Name: Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Erfahren Sie die stabile Markierung von Patienten-xenografts mit lentiviralen Partikeln für Brustkrebsforschung. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung von Tumorwachstum und Metastasierung durch In-vivo-Bildgebung.

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Die Autoren danken Dr. Darrel Kotton an der Boston University für die Bereitstellung der Phage-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W-Vektor und Protokolle für hohe Titer lentiviralen Produktion in diesen Studien verwendet. Diese Arbeit wurde von DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) und R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Zentrum Zuschuss unterstützt in - vivo - Bildgebung gefördert und Gewebekultur-Kerne an der University of Colorado AMC.

<ol><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+human+tumour+tissue+xenografts+in+immunodeficient+mice%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review.</a> Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Kabos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+luminal+breast+cancer+xenografts+retain+hormone+receptor+heterogeneity+and+help+define+unique+estrogen-dependent+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+research+and+treatment%22%5BJournal%5D)">Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures.</a> Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renewable+tissue+resource+of+phenotypically+stable%2C+biologically+and+ethnically+diverse%2C+patient-derived+human+breast+cancer+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models.</a> Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).</li>
<li>Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+human+primary+tumorgraft+models%3A+comparisons+with+traditional+oncology+preclinical+models+and+the+clinical+relevance+and+utility+of+primary+tumorgrafts+in+basic+and+translational+oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2012).</li>
<li>Marangoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+patient+tumor-derived+breast+cancer+xenografts+for+preclinical+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays.</a> Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).</li>
<li>Garrido-Laguna, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engraftment+in+nude+mice+and+enrichment+in+stroma-+related+gene+pathways+predict+poor+survival+and+resistance+to+gemcitabine+in+patients+with+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer.</a> Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).</li>
<li>Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+breast+tumor+xenografts+facilitating+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy.</a> Breast Cancer Res. 15 (1), 201(2013).</li>
<li>Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+intrinsic+subtypes+of+breast+cancer+in+the+quest+for+precision+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy.</a> Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).</li>
<li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+of+triple-negative+breast+cancer+reproduce+molecular+features+of+patient+tumors+and+respond+to+mTOR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition.</a> Breast Cancer Res. 16 (2), R36(2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).</li>
<li>Thibaudeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+breast+cancer-induced+bone+metastasis+in+vivo%3A+current+transplantation+models+and+advanced+humanized+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Powell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+deficiency+linked+to+B+cell+translocation+gene+2+%28BTG2%29+loss+enhances+metastatic+potential+by+promoting+tumor+growth+in+primary+and+metastatic+sites+in+patient-derived+xenograft+%28PDX%29+models+of+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+of+human+breast+cancer%3A+protocols+for+in+vitro+and+in+vivo+applications+in+tumor+biology+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2013).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. (32), (2009).</li>
<li>Indumathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+depletion+of+stromal+vascular+fractions+isolated+from+human+adipose+tissue%3A+a+novel+approach+towards+cell+enrichment+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology.</a> Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).</li>
<li>Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer+requires+identification+and+correction+of+a+critical+cell+lineage-dependent+transduction+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias.</a> Nat Commun. 6, 6927(2015).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> J Vis Exp. (67), e4260(2012).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+TGFbeta+Signaling+in+Mouse+Models+of+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis.</a> Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).</li>
<li>Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+human+breast+cancer+cell+lines+that+permit+rapid+and+sensitive+in+vivo+detection+of+mammary+tumors+and+multiple+metastases+in+immune+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice.</a> Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).</li>
<li>Lawson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+a+stem-cell+program+in+human+metastatic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells.</a> Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).</li>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls: Die Verwendung hoch Titer Lentivirale Partikel (&gt; 10 8 TU / ml) ist ein entscheidender Schritt in den Erfolg dieses Protokolls, die sorgfältige Kontrolle der während der in vitro Transduktion Medienzusammensetzung ermöglicht. Während mehrere Methoden für die Herstellung von High-Titer viralen Partikel wurden gut 18,19 beschrieben; Dieses Protokoll verwendet lentivirale Partikel , wie im Detail in ...

Die Entwicklung von Patienten stamm Tumorxenografte (PDXs), wobei operativ reseziert Tumorproben direkt transplantiert werden in immungeschwächten Mäusen, bietet mehrere Vorteile gegenüber Standard - Zell-Linie Xenotransplantatmodellen und stellt einen großen Fortschritt in der Krebsforschung 1,2. PDXs können durch aufeinanderfolgende Durchgänge mit minimalen Veränderung der genetischen und biologischen Eigenschaften des Tumors bei der ersten Passage gezüchtet gepflegt und erweitert werden; und genauer widerspiegeln Tumor Heterogenität als abgeleitet Xenotransplantate von menschlichen Krebszelllinien 3-8. Diese Modelle werden nun in großem Umfang als Plattform genutzt zur Personalisierung von Krebstherapeutika 9,10, als präklinische Plattform in der Medikamentenentwicklung 6,11 und als experimentelles Werkzeug für das Studium der Krebsbiologie 4,12. Die meisten PDXs implantiert werden und subkutan propagiert, die feasibly Messung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit ermöglicht Sätteln mit. abermetastatische Erkrankung hat, war schwieriger zu modellieren PDXs verwenden. Speziell für Brustkrebs - Xenotransplantaten mit metastatischen Kapazität verschiedenen Organen haben 3,5,13 beschrieben worden ist , aber die Frequenz der spontanen Verbreitung an metastatischen Stellen ist extrem niedrig. Wo berichtet, stützt sich die Identifizierung und Quantifizierung von metastasierendem Belastung in mühsamer histologische Untersuchung von Zielorganen post-mortem. Krebs-Zelllinien Biolumineszenz (Luciferase, Luc) exprimieren, oder fluoreszierend (Green Fluorescent Protein, GFP) Gen-Reporter werden in experimentellen Modellen von Brustkrebs Metastasen in Gehirn, Lunge, Knochen und Leber nach intrakardial, Schwanz-Vene, intrafemoral und splenic Injektion häufig verwendete 14-16. Während diese Modelle Verbreitung von den primären Tumoren umgehen, sie sind wertvoll, die Mechanismen der Organtropismus und metastatischen Kolonisation zu studieren. Doch von primären Patiententumoren und PDXs abgeleiteten Zellen können niedrige Transfektion oder Transduktionsraten haben using Standardverfahren. Eine Alternative ist PDX-abgeleiteten Zelllinien in vitro zu etablieren 17, die als herkömmliche Gewebekulturprotokollen markiert werden können. Dieser Ansatz ist jedoch nicht geeignet für die meisten PDXs Kennzeichnung, für die Zell-Linie Ableitung schwierig und kann den Phänotyp der Zellen verändern. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Weiterleitung von PDX-distanzierte Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren , die sich für die in - vivo - Bildgebung. Darüber hinaus beschreiben wir experimentelle Metastasierung mit Intrakardial dissoziierter luc-GFP-markierten PDX-Zellen bei immunsupprimierten Mäusen. Ein Basisprotokoll für die Transduktion von PDX-distanzierte Organoide mit Gen-Reporter exprimieren Lentiviren zuvor 18 beschrieben. In der aktuellen Protokoll beschreiben wir zusätzliche Methoden für das menschliche Tumorzellen zu bereichern und in der Nähe von 100% Transduktionseffizienz, sowie die Verwendung von markierten PDXs zum Nachweis von experimentellen Brustkrebs erhaltenMetastasen. Dieses Protokoll kann für die Markierung von mehreren Krebsarten PDXs mit verschiedenen Leucht und Fluoreszenzmarker sowie Modulation der Genexpression (dh shRNA Knockdown von Genen von Interesse) angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pilz-Antibiotika</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105-500</td><td>Aufschlusspuffer</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Rot Ca2+/Mg2+freier</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex</td><td>Cultrex</td><td>3433-005-01</td><td>Grundstein-Matrix-Extrakt (BME)</td></tr><tr><td>30 &#176; C-Schüttler</td><td>NewBrunswick Scientific CO. INC</td><td>Serie 25 Inkubator-Schüttler</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956; m Filter</td><td>Falcon</td><td>7352350</td><td></td></tr><tr><td>Skalpelle</td><td>Fisher</td><td>22079690</td><td></td></tr><tr><td>Clorhexidin Desinfektionsmittel</td><td>Durvet&nbsp;</td><td>NDC# 30798-624-35</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für die Zelllyse von rotem Blut</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Neuraminidase</td><td>Sigma</td><td>N7885-1UN</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326+) Mikrokügelchen*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-061-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit zur Depletion von Abstammungszellen, Maus</td>*<td>Miltenyil Biotec</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator&nbsp;</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mini MACS Magnetständer</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201 MS-</td><td>oder LS-Säulen können verwendet werden, einstellbar auf die Anzahl der Zellen.</td></tr><tr><td>Illumatool Abstimmbares Lichtsystem</td><td>Lightools research</td><td>Verschiedenes</td><td>Für die in vivo Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS200 Bildgebungsgerät</td><td>Xenogen</td><td>Verschiedenes</td><td>Für die in vivo Luminiszenzbildgebung</td></tr><tr><td>Humanes Cytokeratin Klon MNF116 Monoklonaler Antikörper</td><td>DAKO</td><td>M0821</td><td>Pan-Cytokeratin&nbsp;</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor-Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4267S</td><td>EGFR</td></tr></tbody></table>

die markierung von brustkrebs-patienten stamm xenografts mit nachvollziehbare reporter für tumorwachstum und metastasierung studies

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Die Verwendung präklinischer Modelle zur Untersuchung der Tumorbiologie und des Ansprechens auf die Behandlung ist für die Krebsforschung von zentraler Bedeutung. Alteingesessene humane Zelllinien und viele transgene Mausmodelle versäumen es oft, die Schlüsselaspekte menschlicher Malignome zu rekapitulieren. Daher werden alternative Modelle entwickelt, die die Heterogenität der Tumoren und ihrer Metastasen besser abbilden. Patienten-abgeleitete Xenotransplantat-Modelle (PDX), bei denen chirurgisch resezierte Tumorproben in immungeschwächte Mäuse transplantiert werden, sind zu einer attraktiven Alternative geworden, da sie über mehrere Generationen transplantiert werden können und die Tumorheterogenität effizienter widerspiegeln als Xenotransplantate, die aus menschlichen Krebszelllinien stammen. Eine Einschränkung bei der Verwendung von PDXs besteht darin, dass sie schwer zu transfizieren oder zu transduzieren sind, um rückverfolgbare Reporter einzuführen oder die Genexpression zu manipulieren. Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Transduktion dissoziierter Tumorzellen aus PDXs mit hoher Transduktionseffizienz und die Verwendung von markierten PDXs für experimentelle Modelle von Brustkrebsmetastasen. Das Protokoll demonstriert auch die Verwendung von markierten PDXs in experimentellen Metastasenmodellen, um den Organbesiedlungsprozess der Metastasenkaskade zu untersuchen. Metastasen in verschiedenen Organen können mit Hilfe der biolumineszenten Bildgebung bei lebenden Tieren oder der GFP-Expression während der Dissektion und bei exzidierten Organen leicht sichtbar gemacht und quantifiziert werden. Diese Methoden bieten ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Verwendung mehrerer Arten von PDXs auf die Metastasierungsforschung auszuweiten.

Diese Methode beschreibt die Transduktion von PDX-dissoziierten Zellen Brustkrebs mit hohem Titer unter Verwendung von lentiviralen Vektoren pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro und Phage-EF1aL-Luciferase-UBC-GFP-W. Diese Vektoren exprimieren einen fluoreszierenden Marker, der die Effizienz der Transduktion in vitro ermöglicht die Abschätzung bereits 24 h nach der Infektion (Abbildung 1a). Für die meisten PDXs Expression von GFP wird 72 Stunden nach der Infektion (A...

Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Das übergeordnete Ziel dieses Transduktionsprotokolls besteht darin, Reportergene stabil in von Patienten abgeleitete Xenotransplantate (PDX) einzubringen, um deren Verwendung in experimentellen und spontanen Metastasemodellen zu erleichtern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise inwieweit eine extrakutane Metastasierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantaten erfolgt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass markierte PDX mithilfe der In-vivo-Bildgebung verfolgt werden können, wodurch die Beurteilung gezielter, spezifischer Metastasen ohne umfangreiche histologische Analysen post mortem erleichtert wird.Dieses Protokoll wird Jessica Finlay-Schultz, eine Postdoktorandin, demonstrieren, die es routinemäßig zur Markierung von xenotransplantierten Tumoren von Brustkrebspatientinnen anwendet. Beginnen Sie unter Verwendung aseptischer Technik damit, mit einem Skalpell die Haut rund um den Tumor aufzuschneiden. Ziehen Sie anschließend die Haut mit einer Pinzette zurück und trennen Sie sie mit einem sauberen Skalpell vom Tumor ab.Wenn der Tumor vollständig freigelegt ist, verwenden Sie ein sauberes Paar Pinzette und Skalpell, um das Gewebe in fünf Milliliter Waschmedium auf Eis zu überführen. Danach entsorgen Sie das Medium und waschen den Tumor zweimal mit je 10 Milliliter HBSS, ergänzt mit HEPES. Legen Sie den gespülten Tumor in eine sterile, vorher gewogene 60-Zentimeter-Zellkulturschale und wiegen Sie die Schale, um die Tumormasse abzuschätzen.Unter Verwendung eines Skalpells wird der Tumor der Länge nach halbiert. Anschließend wird aus einer der Hälften eine dreimillimetergroße Scheibe geschnitten und 24 Stunden lang in 10 % Formalin gegeben. Zu dem verbleibenden Tumoranteil werden 200 Mikroliter HBSS mit HEPES hinzugefügt, und mithilfe von Pinzette und einem sauberen Skalpell wird das Gewebe in möglichst kleine Stücke zerkleinert.Überführen Sie die Fragmente in ein steriles 50-Milliliter-Konischgefäß und geben Sie mindestens ein Milliliter Digestionspuffer pro 100 Milligramm Tumor hinzu, der mit Antimykotika und Antibiotika ergänzt wurde. Nach drei Stunden bei 30 Grad Celsius und 125 bis 200 Umdrehungen pro Minute fügen Sie 35 Milliliter Waschmedium hinzu, um die Digestion zu stoppen, und filtrieren die entstandene Gewebesuspension durch ein 70-Mikron-Nylon-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Konischgefäß, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet für fünf Minuten bei Raumtemperatur in einem Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer.Am Ende der Lyse die Tonicität durch Zugabe von 10 Milliliter Waschpuffer wiederherstellen und die Zellen durch einen 40-Mikron-Filter sieben, um Klumpen zu entfernen. Die Zellen erneut zentrifugieren und das Pellet in fünf Milliliter Waschpuffer auf Eis resuspendieren. Anschließend die Anzahl der lebensfähigen Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss bestimmen.Um die humanen epithelialen Krebszellen durch Linien-positiv-Mel-Zell-Depletion anzureichern, überführen Sie bis zu 1 × 10⁷ Zellen in ein neues 5-mL-Polypropylenröhrchen und geben Sie 2 mL Epithel-Anreicherungspuffer zu den Zellen hinzu. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie mittels Pipette vollständig den Überstand. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet in 40 µL eiskaltem Epithel-Anreicherungspuffer und geben 10 µL Biotin-Antikörper-Cocktail pro 1 × 10⁷ Zellen hinzu.Vorsichtig durch Pipettieren mischen und die Zellsuspension 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation die Zellen mit 30 Mikroliter Epithel-Anreicherungspuffer pro 1 × 10⁷ Zellen mischen, gefolgt von der Zugabe von 20 Mikroliter antibiotinmarkierten Mikroperlen mit vorsichtiger Vermischung.Nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen mit drei Milliliter kaltem epithelialen Anreicherungspuffer waschen und das Überstand vorsichtig abpipettieren. Den Pellet in 500 Mikroliter epitheliale Anreicherungspuffer auf Eis resuspendieren und eine Säule in einen magnetischen Separator stellen. Die Säule mit 0,5 Milliliter epithelialem Anreicherungspuffer spülen.Und platzieren Sie ein neues Sammelröhrchen aus Polypropylen unter die Säule. Anschließend geben Sie die markierten Zellen langsam auf die Säule. Sammeln Sie die angereicherte, unmarkierte, linien-negative, tumorale Zellfraktion im Durchlauf, gefolgt von drei Säulenspülungen mit jeweils 500 µL frischem epithelialen Anreicherungspuffer.Um die Tumorzellen zu transduzieren, zentrifugieren Sie die isolierten Zellen zur Wiederinokulation in zwei Milliliter Mammosphärenmedium. Nach der Zellzählung zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren das Pellet in 2 Milliliter Mammosphärenmedium, ergänzt mit 20 Mikrolitern Polybrene. Anschließend geben Sie jeweils zwei mal zehn hoch fünf vitalen Tumorzellen pro Vertiefung in eine Ultra-Low-Adhärenz-Platte mit sechs Vertiefungen und geben Lentivirenpartikel zu den Zellen mit einer Multiplizität der Infektion von 10 hinzu.Die Platte vorsichtig schwenken, um das Virus mit den Zellen zu vermischen. Die Co-Kulturen anschließend für bis zu 96 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, wobei nach den ersten 24 Stunden 500 Mikroliter frisches Mammosphären-Medium hinzugefügt werden.Wenn mindestens 10 % der Zellen GFP-positiv sind, überführen Sie die transduzierten Zellen aus mindestens einem Well in ein 15-Milliliter-Konischglas auf Eis und waschen Sie den Well mit einem Milliliter Mammosphärenmedium. Puffern Sie den Waschansatz mit den Zellen zusammen und zentrifugieren Sie die Tumorzellen in 10 Milliliter HBSS mit HEPES. Schließlich resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikroliter Basalmatrizextrakt auf Eis.Und laden Sie die eingebetteten Zellen in eine 0,5-Milliliter-Insulinspritze zur Wiedereinimplantation. Einige Vektorvials mit hoher Titerkonzentration exprimieren einen fluoreszierenden Marker, der eine Abschätzung der Transduktionseffizienz bereits 24 Stunden nach der Infektion in vitro ermöglicht. Bei den meisten PDXs verzögert sich die GFP-Expression bis zu 72 Stunden nach der Infektion.An diesem Punkt wird üblicherweise die Bildung von Zellaggregaten beobachtet. Nach der Suspension in extrazellulärer Matrix und erneuter Implantation regenerieren die markierten Tumorzellen Tumore, die mittels Biolumineszenz oder Fluoreszenz verfolgt werden können. Ein erfolgreich markiertes PDX wird in der ersten Generation nach der Transduktion nahezu zu 100 % GFP-positiv sein und diesen Zustand in nachfolgenden Passagen beibehalten.Jedoch weisen einige PDX eine ungleichmäßige Verteilung von GFP-positiven Zellen auf, was auf eine suboptimale in-vitro-Transduktion hinweist. Die immunhistochemische Färbung von Tumorgewebe zeigt, dass die Expression kritischer Marker, wie des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors und der Panzytokeratine, auch nach mehreren Passagen und erneuten Implantationen erhalten bleibt. Experimentelle Metastasemodelle bieten eine Alternative zur Untersuchung der Schritte der Organotropie und der Besiedlung von Organen in der metastatischen Kaskade.Tatsächlich bildet ein transduzierter PDX, der mit 2,5 × 10⁵ Zellen pro Maus injiziert wird, Metastasen in der Leber, die mittels Luciferase-Bildgebung in vivo leicht identifizierbar sind, sowie in der Lunge, die ex vivo durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können. Nach Beherrschung der Technik dauert die Dissoziation und Markierung der PDXs etwa 4 Stunden.Die eigentliche Ausdehnung des Tumors kann je nach Tumor und verwendeter System 8 bis 12 Wochen dauern. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, ein Virus mit hoher Titerkonzentration und einem Reportergen zu verwenden, um sowohl die Transfektionseffizienz als auch das Tumorwachstum in vivo überwachen zu können. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie in-vivo-Metastasenstudien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Tumorprogression, Metastasierung und Therapieantwort zu beantworten.Diese Technik eröffnet Brustkrebsforschern die Möglichkeit, multiple Aspekte der Tumorprogression mithilfe neuartiger PDX-Modelle zu untersuchen, die die Tumorheterogenität besser widerspiegeln. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dissoziierte Tumorzellen mit Lentiviren hoher Titer markiert werden können. Dies ermöglicht es Ihnen, Tumorzellen sowohl in vivo zu verfolgen als auch die Expression von Genen des Interesses gegebenenfalls zu beeinflussen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lentiviralen Partikeln äußerst gefährlich sein kann, und Sie sollten stets angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.

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Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies (Video) | JoVE Journal

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

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