Name: Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines In Vitro System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Feinstaub-induzierten Chromosomenaberrationen in RAW264.7-Makrophagen mit einem In-Vitro-System. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung genetischer Schäden durch Umweltpartikel.

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Die Arbeit wurde zum Teil durch das National Institute of Health Center of Biological Research Exzellenz [Grant-Nummer 1P20GM109005], der Arkansas Raum Grants Consortium durch National Aeronautics and Space Administration [Gewährungsnummer NNX15AK32A] und das Nationale Institut für Arbeitsschutz und Health (NIOSH) [Gewährungsnummer 2T420H008436]. Die Autoren möchten sich Christopher Fettes für das Korrekturlesen und Bearbeitung des Manuskripts danken.

1. Partikelgewinnung und Vorbereitung <ol><li> Die Kalibrierung des hohen Volumens Schwebstoffe insgesamt Sampler <ol><li> Ziehen Sie den Sampler Motor von der Massendurchflussregler und der Motor zu einem stabilen Wechselstromquelle (Abbildung 1). HINWEIS: Ein Filter wird bei diesem Vorgang nicht verwendet. </li><li> Montieren Sie den Kalibrator Öffnung und Toplader-Adapterplatte an den Sampler. Ziehen Sie die Top-Loading-Adapter Niederhalte Muttern fest, um sicherzustellen, dass keine Luftlecks vorhanden sind. Lassen Sie den Sampler Motor seine normale Betriebstemperatur zu erwärmen (ca. 10-15 min). </li><li> Führen Sie eine Dichtigkeitsprüfung durch die Löcher abdecken oben auf der Öffnung und Druckhahn an der Öffnung mit den Händen. Hören Sie ein schrilles Quietschen Klang durch Luft entweicht. Wenn dieser Ton zu hören ist, nachziehen Toplader-Adapter Niederhaltemuttern als ein Leck vorhanden ist. Wenn der Ton niedriger ist, ist das Leck in der Nähe von einem der anderen Dichtungen in den system. </li><li> Schließen Sie eine Seite eines Wasser Manometer an den Druckanschluss auf der Seite der Öffnung mit einem Gummi-Vakuumröhre. Verlassen die gegenüberliegende Seite des Manometers zur Atmosphäre hin offen. Halten Sie ein Manometer vertikal, um genaue Messwerte zu gewährleisten. Durch Tippen auf die Rückseite des kontinuierlichen Fluss Recorder wird dazu beitragen, den Stift zu zentrieren und genaue Messwerte liefern. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.1.2 unter Verwendung von fünf Flussraten darstellen Betriebsflussraten von 30 bis 60 ft / min (etwa alle 5-6 ft 3 / min). Stellen Sie den Regler auf der variablen Öffnung an fünf verschiedenen Positionen und fünf verschiedene Messungen vornehmen. </li><li> Notieren Sie sich die Umgebungslufttemperatur, Umgebungsluftdruck, Sampler Seriennummer, Seriennummer Öffnung, Öffnung Steigung und mit Datum der letzten zertifiziert, das Datum, die Standortwahl und Betreiber Initialen auf dem Kalibrierungsblatt. </li></ol></li><li> Schwebstoffe insgesamt Probensammlung und gravimetrische Analyse <ol><li> Wickeln Sie ein8 &quot;x 10&quot; Quarzfaserfilter in zwei Schichten von Aluminiumfolie. Setzen Sie den Filter eingewickelt in den Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 550 ° C. Backen Sie den Filter für mindestens 4 Stunden. Lassen Sie den Ofen abkühlen und rufen Sie den Filter. Setzen Sie den Filter im Exsikkator mit CaCO3. </li><li> Wiegen des Filters in einer Mikrowaage mit einer Genauigkeit von 10 &amp; mgr; g. Wiederholen Sie die Messung dreimal während eines Tages. Einzelne Messungen sollten innerhalb von 25 ug sein. Wird dies nicht erreicht wird, kehrt die verpackte Filter in den Exsikkator und wiederholen Sie den nächsten Tag den Prozess. </li><li> Öffnen Sie den Schutz Deckel (Abbildung 2). Filter entfernen Halterrahmen durch die vier Flügelmuttern lockern, so dass die Messingschrauben und Unterlegscheiben aus dem Weg zu schwingen hinunter. Klappen Sie den Filter aus der Aluminiumfolie und gereinigt Pinzette vorsichtig zu zentrieren, rauere Seite nach oben, auf dem Trag Bildschirm. richten Sie richtig den Filter auf dem Bildschirm. </li><li> Platzieren Sie den Rahmen auf dem Bildschirm, und befestigen Sie es mitDie Messingschrauben und Unterlegscheiben, während eine ausreichende Druckaufbringungsluftverlust an den Kanten zu vermeiden. Wischen Sie Staubansammlung aus der ganzen Filterhalter mit einem sauberen Tuch. Schließen Obdach Deckel vorsichtig und sichern. </li><li> Achten Sie darauf, alle Kabel sind in die entsprechenden Aufnahmebuchsen eingesteckt und der Schlauch zwischen dem Gebläsemotor Druckanschluss und den kontinuierlichen Fluss-Recorder angeschlossen ist. </li><li> Bereiten Sie den Fluss-Recorder. Drücken Sie Stift Arm Heber Stiftspitze zu heben, und legen Sie ein neues Diagramm. Richten Sie die Lasche des Diagramms auf der Antriebsnabe des Recorders und drücken Sie mit dem Daumen-Chart Zentrum auf die Nabe zu senken. Stellen Sie die Zeit von der Antriebsnabe Dreh im Uhrzeigersinn, bis die korrekte Zeit auf Diagramm mit Zeitindex Zeiger ausgerichtet ist. </li><li> Wechseln Sie manuell auf dem Sampler und die Sammlung beginnen. Überwachen Sie den Recorder sicher sein, es ist richtig Einfärben und die verstrichene Zeit Anzeige um sicherzustellen, dass es richtig funktioniert. </li><li> Am Ende der Abtastperiode, schalten Sie den Sampler, Rekord ausdie verstrichene Zeit und das Diagramm abgerufen werden. Entfernen Sie den Rahmen um den Filter zu belichten. Entfernen Sie den freigelegten Filter aus dem Stützsieb indem sie sie sanft an den Enden mit der Zange zu halten. Falten Sie den Filter der Länge nach, so dass Probe berührt Probe zweimal und wickeln Sie es in der ursprünglichen Aluminiumfolie. </li><li> Lagern Sie den Filter in einem Exsikkator mit CaCO3 für mindestens 24 Stunden vor dem Wiegen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 das Gewicht der Filter nach der Probenahme zu messen. Setzen Sie den Filter in einer Zip-Plastikbeutel und lagern Sie es in -80 ° C bis zur Analyse. </li></ol></li><li> Die Analyse der gesammelten Schwebstoffe insgesamt Probe <ol><li> Abrufen der gespeicherten Filter, entfalten die Aluminiumfolie und übertragen Sie den Filter auf eine saubere Teflonoberfläche. Mit einer Pinzette und Skalpell, schneiden Außen (weiß) Teil des Filters und entsorgen. <ol><li> Als nächstes schneiden Sie den Filter in 0,5 &quot;x 0,5&quot; Stücke schneiden und Stücke in einem 100 ml Kolben. 50 ml Reinstwasser. Der Kolben wird in einem UltraschallBad und beschallen bei 33 ± 3 kHz für 60 min. </li></ol></li><li> Filter Extrakt durch ein 0,45 um Polypropylen-Spritzenfilter in einen 100 ml Rundkolben. das Wasser verdampfen, um einen Rotationsverdampfer Instrument unter Druck bei 50 ° C bis ca. 5 ml Extrakt unter Verwendung bleibt in der Flasche. <ol><li> Dampfe das restliche Wasser in einem 15 ml-Birnenkolben mit bekanntem Gewicht. Wiegen Sie die Flasche mit dem Trockenextrakt und die Masse des Trockenextrakt aufzuzeichnen. </li></ol></li><li> Man löst das trockene Probe mit 400 ul D 2 O durch Beschallen für 15 Minuten und Transfer in einem 5 - mm - Standard - NMR - Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 12.000 xg bei Raumtemperatur um irgendwelche ungelösten Stoffe zu entfernen. </li><li> Wiederholen mit 300 &amp; mgr; l D 2 O. Zugabe von 10 &amp; mgr; l NaN 3 1.4% (Endkonz .: 0,02% w / v) in dem NMR - Röhrchen. Werden 10 ul (32 ug) der Gesamtmenge an suspendierten Teilchen (TSP) -D4 (3,2 mg / ml) an D 2 O (Endkonzentration 0,258 mM) in dem NMR - Röhrchen. </li><li>Erwerben 1 H - NMR - Spektren eines NMR - Spektrometers bei 600,17 MHz betrieben wird . <ol><li> Legen NMR-Röhrchen in die Tripelresonanz Kryosonde. Kalibrieren Sie das Gerät in der folgenden Reihenfolge: lock, tune, Shim, 90 ° Pulslängenkalibrierung und Empfängerverstärkungseinstellung. </li><li> Messen Sie Spektren bei 25 ° C mit einem 1 D Anregung Sculpting-Sequenz mit 180 Wasser-selektive Pulse in Digital-Quad-Erfassungsmodus, 8.192 Scans, 4 Dummy-Scans, Wobbelbreite von 8012,57 Hz, die Frequenz für die Wassersignalunterdrückung bei 4,70 ppm, eingestellt Offset 1,70 sec Erfassungszeit, 32.768 Zeitbereich Datenpunkte (TD), 1 ms Dauer Gradienten (p16), 100 &amp; mgr; s Erholung Verzögerung nach dem Gradienten (d16). </li></ol></li><li> Verfahren 1 H - NMR - Spektren , die durch eine Linienverbreiterung von 1 Hz und Nullfüllung um einen Faktor von 2 (65.536 Datenpunkte) anwenden. Korrigieren Sie die Phase und Baseline manuell und zu integrieren. Set TSP-d4-Peak bei 0,0 ppm. </li></ol></li></ol> 2. Partikelbelastung<ol><li> Kultur einrichten <ol><li> Warm vollständige Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin-Lösung (100 U / ml), 0,25% Trypsin-Lösung und Calcium-Magnesium-freien Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) in einem Wasserbad (bei 37 ° C) für mindestens 30 min vor Kulturbeginn. </li><li> Nehmen Sie einen T75 - Kolben von 5% CO 2 Inkubator kultiviert RAW264.7 Zellen und die Zellen werden mit 2 ml vorgewärmtes PBS zweimal. </li><li> Abzulösen anhaftenden RAW264.7-Zellen vom Boden der Gewebekulturgefäß unter Verwendung von 1 ml vorgewärmtes Trypsin-Lösung, gefolgt von Abkratzen. </li><li> Sammle die Zellen aus Gewebekulturgefäß und stellen durch wiederholtes Pipettieren eine Einzelzellsuspension. Zähle die Anzahl der Zellen mit Trypan - Blau und der Platte bei einer Dichte von 8000 / cm 2 (500.000 Zellen insgesamt) in einer 100 mm - Gewebekulturschale mit vorgewärmtem kompletten Medien. Einstellen Medienvolumen auf 10 ml für eine Endkonzentration von 50.000 Zellenpro ml. HINWEIS: Verdoppelung der Anzahl der Platten, wenn DNA-Methylierungsanalyse wird ebenfalls durchgeführt. </li><li> Platzieren Sie die neu ausplattiert RAW264.7 - Zellen zurück in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C und lassen für 24 h zu befestigen. </li><li> Auch in einem Biosicherheitsschrank resuspendieren gefilterten Partikel. Beispielsweise verdünnte Teilchen in einer Konzentration von 0,5 mg / ml in sterilem PBS für eine 5 &amp; mgr; g / ml Behandlung Dosis und bei 5 mg / ml für eine 50 &amp; mgr; g / ml Behandlungsdosis. Verdünnungen bis zu Monat im Voraus gespeichert und bei -80 ° C hergestellt werden. </li></ol></li><li> Die Behandlung mit Feinstaub <ol><li> Nehmen Sie die Zellen , die aus 5% CO 2 Inkubator und überprüfen unter 10 - facher Vergrößerung ein inverses Mikroskop für das Zellwachstum unter Verwendung der Zellmorphologie, Kulturbedingungen und Kontamination. Man sollte erwarten, dass mindestens 30% konfluenten Zellen in diesem Stadium zu haben. </li><li> Aseptisch absaugen Medien sterilisierten Pipette und waschen Sie das Kulturgefäß mit 2 ml 37 ° C PBSzwei Mal vollständig die Medien entfernen und schwebenden oder toten Zellen. </li><li> Hinzufügen vorbestimmte Dosis von Partikeln mit frischem Medium in den Kulturgefäßen und inkubieren gewünschte Zeit bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. In dieser Studie wurden 72 h RAW264.7-Zellen mit PM behandeln, um die Belichtung für gleichzeitige genotoxischen und epigenotoxic Analyse parallel. HINWEIS: Die Zytotoxizität negativ auf die Qualität der zytogenetische Analyse beeinflussen können. Daher zusätzliche Assays wie Cytotoxizität, DNA-Methylierung, Western-Blotting oder Genexpressionsanalyse werden typischerweise auf behandelten Zellen durchgeführt. Expose Zellen mit dem spezifischen Assay gewünscht beschrieben und gehen. Unerfahrene Anwender können auch eine positive Kontrolle, wie Methyl Methansulfonat einschließen möchten ihre Fähigkeit zu testen CAs zu erkennen. </li></ol></li></ol> 3. zytogenetischen Assay <ol><li> Die Behandlung Zellen in der Metaphase zu verhaften <ol><li> Wärmen Sie die Colcemid sosung (10 &amp; mgr; g / ml) in einem Wasserbad 37 ° C für 30 min. Wischen Sie den Deckel mit 70% Alkohol unter einem biologischen Sicherheit Kabinett das Risiko einer Kontamination zu minimieren </li><li> Entfernen Sie vollständig die Medien aseptisch und waschen Sie die Kulturgefäße mit 2 ml vorgewärmt PBS zweimal. </li><li> Fügen vorgewärmtes frisches Medium (2 ml Medium / 10 6 Zellen) enthält , Colcemid - Lösung (5 ul / ml) in dem Kulturgefäß und Inkubieren für 2 Std. </li></ol></li><li> Zellernte <ol><li> Warm Trypsinlösung und PBS in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min gehalten. Von diesem Schritt an ist es nicht erforderlich, aseptischen Zustand zu halten. </li><li> Komplett-Medium zu entfernen, waschen Sie die Kulturgefäße mit 2 ml 37 ° C PBS für zwei Mal, fügen Kolben erforderliche Volumen der vorgewärmten Trypsin-Lösung (in der Regel 2 ml für 60 mm Kulturschale oder T25-Flasche und 4 ml für 100-mm-Schale oder T75 ), und setzen CO &amp; sub2 ; -Inkubator das Kulturgefäß bei 37 ° C für 1 min in 5% zurück. </li><li> Take das Kulturgefäß aus, nehmen die Zellen mit einem Schaber, und 10 ml PBS hinzufügen Trypsin Aktion zu stoppen. </li><li> Pipette nach oben und unten mindestens zehnmal Einzelzellsuspension und Transfer-Zellen in einem 15 ml konischen Boden Zentrifugenröhrchen zu machen. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 400 xg für 5 min in einer Ausschwingzeit Zentrifuge bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, brechen die Zellpellet durch leichtes Klopfen, mit 10 ml PBS, und wieder für fünf Minuten zentrifugiert werden. </li></ol></li><li> Hypotone Behandlung und Fixierung <ol><li> Vorwärmen 0,075 M Kaliumchloridlösung in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 30 min. </li><li> Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und etwa 0,5 ml PBS verlassen. </li><li> brechen Sie vorsichtig das Zellpellet und Einzelzellsuspension machen eine P200 Pipette. </li><li> 4 ml vorgewärmten Kaliumchloridlösung tropfen unter leichtem Schütteln. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in hypotonischen potassium Chloridlösung in einem 37 ° C Wasserbad für 20 min. </li><li> Machen Sie frische acetomethanol Lösung durch Zugabe von 3-Teile Methanol mit 1-K-Eisessig. Halten Sie diese frisch zubereitet Fixiermittel bei Raumtemperatur. </li><li> Nach hypotonischer Behandlung, ein gleiches Volumen (4 ml) von Fixiermittel in dem Rohr hinzuzufügen und die Lösung vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens gemischt. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand. In diesem Stadium Zellpelletgröße zunimmt, werden weißlich und mehr sichtbar. </li><li> Überstand entfernen, 4 ml frisches Fixiermittel und halten bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min, entfernen Überstand und geben zwei weitere Waschungen mit 4 ml Fixiermittel. </li></ol></li><li> Slide Reinigung und Metaphasespreitung Vorbereitung <ol><li> Tauchen Glasplättchen vollständig in 10% flüssiges Detergens für 30 min. </li><li> Spülen Sie die Folien gründlich in kaltem Leitungswasser für 30 min. </li><li> Rinse gleitet dreimal mit destilliertem Wasser vollständig Reinigungsmittel zu entfernen, in destilliertem Wasser tauchen, und für eine spätere Verwendung im Kühlschrank lagern. HINWEIS: Reinigungs Dias vor dem Gebrauch Gleichmäßigkeit des Ausbringens erleichtert und Metaphase Qualität erhöht. </li><li> Drop-10 &amp; mgr; l Zellsuspension auf gekühlten nassen Rutsche und lassen Sie es über Nacht trocknen bei Raumtemperatur an der Luft. </li></ol></li><li> Die Färbung und Montage <ol><li> Bereiten Sie 50 ml Giemsa-Lösung durch einen Teil der Giemsa-Lösung mit einem Teil PBS mischen und gießen Sie eine Glasküvette in. </li><li> Tauchen Sie die Folien in Färbelösung für 20 min. </li><li> Spülen Sie die Folien in destilliertem Wasser, um überschüssige Fleck entfernen und sofort trocknen die Folien einen Fön verwenden. </li><li> Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Tragen Sie einen einzigen Tropfen Eindeckmedium auf der Folie, legen Sie vorsichtig mit einem Deckglas auf dem Montagemedium, lassen Sie das Medium über den Objektträger zu verbreiten langsam und entfernendas überschüssige Medium mit einem Papiertuch. Erlauben die montierte Rutsche für mindestens 1 Stunde vor dem Bewegen oder Betrachten unter einem Mikroskop zu trocknen Bewegung des Deckglases zu vermeiden. Achtung: Es ist wichtig, das Deckglas sorgfältig zu platzieren, ohne dass Blasen in diesem Schritt zu bilden. Die Verwendung von übermäßiger Hitze Blasen zu entfernen, ist nicht zu empfehlen. </li></ol></li><li> Die mikroskopische Beobachtung und Aberrationstypen <ol><li> Untersuchen Sie die Struktur CAs in Metaphase bei 100-facher Vergrößerung verbreitet eine gute Qualität Hellfeld-Mikroskop. </li><li> Ergebnis mindestens 50 bis 100 Metaphase-Spreads für jede Behandlungsgruppe für Behandlungen, die eine große Anzahl von CAs induzieren. Für kleinere Effektgrößen wird die Analyse von bis zu 300 Metaphasespreitungen beraten. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die zytogenetische Untersuchung oder mikroskopische Analyse der Zahlen oder Strukturen der Chromosomen, in erster Linie in der Metaphase-Spreads, liefert Informationen von entscheidender Bedeutung für die Prognose, die Risikobewertung und die Behandlung für verschiedene Krankheiten. Es ist nun gut etabliert, dass zytogenetische Anomalien, die mit dem Fortschreiten und die Entwicklung von verschiedenen Krankheiten verbunden sind, einschließlich Krebs. Bisher CAs wurden in allen wichtigen Tumorarten gefunden. CAs können s...

Es wurde geschätzt , dass die Exposition gegenüber Partikeln (PM) verursacht mehr als 3 Millionen zusätzliche Todesfälle jährlich, in erster Linie von Herz - Lungen - Erkrankungen und Lungenkrebs 1. Tatsächlich PM wurde als krebserzeugend für den Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (Gruppe 1), ein erhöhtes Risiko für Lungenkrebs erkannt mit Exposition gegenüber PM zugenommen hat 2 gezeigt. Interessanterweise fast alle Krebszellen beherbergen numerische und / oder strukturelle Chromosomenanomalien. Partikulärer organischer Kohlenstoff ist eine Variante, komplexe und heterogene Mischung, deren Zusammensetzung und Größenverteilung auf die Emissionen abhängig sowie physikalischen und chemischen Umwandlungen. Auf sie entfallen 35 bis 55% der städtischen PM 2.5 Masse (PM 2,5 um Größe und kleiner) und mehr als 60% der ländlichen und kontinentalen Hintergrund PM 2.5 Masse 3, 4. Die wasserlösliche Fraktion einen Anteil von 30-90% der organischen Aerosol. Eine große Anzahl von organischen Verbindungen,identifiziert wurden, einschließlich aliphatischer Kohlenwasserstoffe, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe und deren oxygenierte und nitrierte Derivate, aliphatische Aldehyde und Alkohole, freie Fettsäuren und deren Salze, Di-Carbonsäuren, multifunktionelle Verbindungen, Proteine ​​und Huminsäure artigen Makromoleküle (HULIS) unter Verwendung von chromatographische Methoden gekoppelt mit massenspektrometrischen Techniken 5-8. Diese Verbindungen weisen weniger als 10-20% der partikulären organischen Kohlenstoff, wodurch die meisten organischen Kohlenstoff ist unbekannt 9. Experimentelle Beweise legen nahe, dass die Zytotoxizität, oxidativer Stress, Entzündung und bei der Entwicklung von PM-assoziierten Krankheitszuständen beteiligt sind. Es wurde kürzlich gezeigt, jedoch, dass Exposition gegenüber PM resultiert auch in einer Reihe von epigenetischen Veränderungen, einschließlich Änderungen in der DNA - Methylierung von repetitiven Elementen in beiden experimentellen in vitro - Systemen und in menschlichen Subjekten 10-12. Von besonderem Interesse sind die Auswirkungen derPM auf Satelliten-DNA - größere und kleinere Satelliten -, die in der heterochromatischen Region um die Zentromer der Chromosomen zu finden sind. Es wurde gezeigt , daß diese Wirkungen von der Natur persistent sein kann, wie sie für mindestens 72 Stunden nach der Exposition 12 detektiert werden. Veränderungen in der DNA - Methylierung, besonders um Zentromeren kann zur Ansammlung von Satelliten - DNA - mRNA - Transkripte, Kompromisses chromosomale Integrität während der Zellteilung führen und in der Folge in der Entwicklung einer Vielzahl von pathologischen Zuständen 13 führen. Die Anpassung der zytogenetischen Ansatz für die Analyse von CAs als Endpunkt epigenetischen Veränderungen von PM verursacht, so ist von großer Bedeutung. Hier berichten wir den Ansatz für die Umgebungs PM Sammlung und Vorbereitung, in vitro - Exposition und Analyse von CAs die murine Makrophagen RAW264.7 Modellsystem. Makrophagen umfassen die erste Verteidigungslinie gegen die inhalierte Fremdkörper und damit tseine Zelllinie dient als etablierter und der am häufigsten verwendete Modell in der Partikel Toxikologie 11, 12, 14, 15.

<table><tbody><tr><td>Probenehmer für gesamte Schwebstoffe</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III NMR-Spektrometer&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2 Software</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Prozessor Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 Mausmakrophagen</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX Medium mit hohem Glukosegehalt</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Warm in einem 37 μd; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Warm in einem 37 Grad; C Wasserbad vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Warm in einem 37 μde; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Warm in einem 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Lösung in PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Warm in einem 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>KaryoMAX Kaliumchlorid Lösung</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Warm in einem 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure, Eiszeit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Flüssigwaschmittel</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Wright und Wright-Giemsa Fleckenlösungen</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Permount Eindeckmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

die analyse der feinstaub in der luft-induzierte chromosomenaberrationen mit hilfe eines<em&gt; in vitro</em&gt; system

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM) ist eine der weltweit wichtigsten gesundheitlichen Bedenken, die verschiedene zelluläre Komponenten beschädigen können, einschließlich der nuklearen genetischen Materials. Um die Auswirkungen der PM auf nukleare genetische Integrität, strukturelle Chromosomenaberrationen erzielte in den Metaphasespreitungen der Maus RAW264.7-Makrophagenzellen zu bewerten. PM wird aus der Umgebungsluft mit einem hohen Volumen Schwebstoffe insgesamt Sampler gesammelt. Das gesammelte Material wird solubilisiert und filtriert, um das wasserlösliche, Feinanteil beibehalten. Die Teilchen werden für die chemische Zusammensetzung, die durch Kernspinresonanz (NMR) -Spektroskopie charakterisiert. Verschiedene Konzentrationen von Partikelsuspension werden auf eine in - vitro - Kultur von RAW264.7 Makrophagen der Maus für eine Gesamtbelichtungszeit von 72 Stunden zugegeben, zusammen mit unbehandelten Kontrollzellen. Am Ende der Belichtung wird die Kultur mit Colcemid behandelten Zellen in der Metaphase zu verhaften. Die Zellen werden dann geerntet, mit hypotonischer Lösung behandelt, in acetomethanol fixiert, dropped auf Glasobjektträger und schließlich mit Giemsa-Lösung gefärbt. Die Objektträger werden untersucht die strukturellen Chromosomenaberrationen zu bewerten (CAs) in Metaphase bei 1,000x Vergrößerung breitet sich ein Hellfeld-Mikroskop. 50 bis 100 Metaphasespreitung sind für jede Behandlungsgruppe erzielt. Diese Technik ist für den Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen (CAs) wie Chromatidentyp Art bricht, Chromatidentyp Art Austausch, acentric Fragmente angepasst, dizentrischen und Ringchromosomen, Doppel Minuten, Endoreduplikation und Robertson&#39;sche Translokation in vitro nach der Exposition gegen Uhr. Es ist eine leistungsfähige Methode, um eine gut etablierte zytogenetische Endpunkt zu epigenetischen Veränderungen zu verknüpfen.

Große Sorgfalt sollte, sowie die Zeit des Jahres, in der Wahl der Position des TSP-Sampler genommen werden, wenn Sammlung durchgeführt wird. Die chemische Zusammensetzung sowie die Größe der Teilchen im wesentlichen die Ergebnisse beeinflussen können. Das Material gesammelt haben, sollten vor dem weißen Filter sichtbar sein. Eine normale Maus Metaphasespreitung wird 40 acentric Chromosomen haben. Das Ziel dieser Technik ist es, eine Änderung (oder das Fehlen davon) in dem Anteil der abno...

Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Quantifizierung und Charakterisierung von Chromosomenaberrationen in vitro in RAW264.7 Makrophagen der Maus nach der Behandlung mit der Umgebungsluft Feinstaub.

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, chromosomale Schäden nachzuweisen, die durch die Exposition von Zellen gegenüber partikulärer Materie aus der Umgebungsluft verursacht werden. Diese Methode kann dazu beitragen, eine zentrale Fragestellung im Bereich der partikulären Materie zu beantworten, nämlich, ob die Exposition gegenüber partikulärer Materie chromosomale Schäden hervorruft. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine direkte Visualisierung der Schäden im genetischen Material ermöglicht.Nach der Sammlung und Analyse der Partikel gemäß dem Textprotokoll führen Sie die Partikelexposition durch, indem Sie das komplette Wachstumsmedium, 0,25 % Trypsin und PBS im Wasserbad bei 37 Grad Celsius mindestens 30 Minuten vor der Kulturinitiierung erwärmen. Nach dem Waschen der rohen 264,7-Zellen geben Sie ein Milliliter der warmen Trypsinlösung in die Schale und lösen die Zellen durch Schaben vom Boden des Zellkulturgefäßes ab. Sammeln Sie anschließend die Zellen ein und stellen eine Einzelzell-Suspension durch mehrfaches Pipettieren her.Mit Trypanblau die Anzahl der Zellen zählen und dann die Zellen mit vorgewärmtem vollständigem Medium in einer Dich

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Karyotypisierung ist eine einfache und nützliche Technik allgemein zum Nachweis genetischer Veränderungen verwendet. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll für das Chromosom verteilt Vorbereitung von menschlichen embryonalen Stammzellen für die Überwachung der chromosomalen Status dieser Zellen in Kultur gehalten.

Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Xenopus Eiextrakt ist ein nützliches Modellsystem, um die DNA-Schäden Prüfpunkt untersuchen. Dieses Protokoll ist für die Herstellung von Xenopus Ei-Extrakten und DNA-Schaden induzierenden Prüfpunkt Reagenzien. Diese Techniken sind an eine Vielzahl von DNA-schädigenden Ansätze in der Untersuchung der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung.

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

Dieses Video zeigt einen hochsensitiven Immunfluoreszenz-basierten Assay zum Nachweis von PM2,5-induzierten oxidativen Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen durch Messung der Spiegel von 8-OHdG und γH2AX, die auf DNA-Schäden bzw. Doppelstrang-DNA-Brüche hinweisen.

Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von PM2,5-vermittelten DNA-Schäden in Fischembryonen

Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Wir beschreiben die detaillierten Schritte eines chemischen Hochdurchsatz-Assays im Fadenwurm Caenorhabditis elegans, der zur Beurteilung der Keimbahntoxizität verwendet wird. In diesem Assay wird die Störung der Keimbahnfunktion nach chemischer Exposition mit einem fluoreszierenden Reporter überwacht, der spezifisch für aneuploide Embryonen ist.

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Ein Protokoll zur Bewertung von Veränderungen des DNA-Schadensniveaus und der DNA-Reparaturkapazität, die durch chronische in vivo Niedrigdosis-Bestrahlung in Milz-Lymphozyten von Mäusen induziert werden können, durch Messung von phosphoryliertem Histon H2AX, einem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, mittels Durchflusszytometrie wird vorgestellt.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Nützlichkeit der multiplen Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH) und der spektralen Karyotypisierung (SKY) bei der Identifizierung interchromosomaler stabiler Aberrationen in den Knochenmarkzellen von Mäusen nach Exposition gegenüber Ganzkörperbestrahlung.

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

Dieses Verfahren wurde für die Entwicklung fortgeschrittener 3D-Leberkulturen in vitro eingeführt, die eine physiologisch relevantere Bewertung der genotoxischen Gefahren im Zusammenhang mit Nanomaterial-Expositionen sowohl über ein akutes als auch ein langfristiges, wiederholtes Dosisregime ermöglichen können.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Wir haben eine modifizierte QuEChERS-HPLC-Methode entwickelt, um die internen Spiegel von 16 PAK in Zebrafischembryonen zu bestimmen.

Ein modifiziertes QuEChERS-HPLC-Verfahren zum Nachweis von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in Zebrafischembryonen, die Feinstaub ausgesetzt waren

Lernen Sie die Analyse von Feinstaub-induzierten Chromosomenaberrationen in RAW264.7-Makrophagen mit einem In-Vitro-System. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung genetischer Schäden durch Umweltpartikel.

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines

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