Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines In Vitro System

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Chromosomenschäden zu erkennen, die durch die Exposition von Zellen gegenüber Feinstaub aus der Umgebungsluft induziert werden. Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage auf dem Gebiet des Feinstaubs zu beantworten, nämlich führt die Exposition gegenüber Feinstaub zu Chromosomenschäden? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Visualisierung der im genetischen Material induzierten Schäden ermöglicht.

Nach dem Sammeln und Analysieren der Partikel gemäß dem Textprotokoll ist die Partikelexposition durchzuführen, indem das gesamte Wachstumsmedium, 0,25 % Trypsin und PBS mindestens 30 Minuten lang vor Beginn der Kultur in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius erwärmt wird. Nach dem Waschen der rohen 264,7-Zellen geben Sie einen Milliliter der warmen Trypsinlösung in die Schale und lösen Sie die Zellen durch Schaben vom Boden des Gewebekulturgefäßes. Sammeln Sie dann die Zellen und stellen Sie durch wiederholtes Pipettieren eine einzellige Suspension her.

Zählen Sie mit Trypanblau die Anzahl der Zellen und verwenden Sie dann ein vorgewärmtes vollständiges Medium, um sie mit einer Dichte von 8000 pro Quadratzentimeter in einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale zu plattieren. Verwenden Sie dann das vollständige Medium, um das Volumen auf 10 Milliliter einzustellen, um eine Endkonzentration von 50.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, damit sie sich anheften können.

Verwenden Sie in einer Biosicherheitswerkbank steriles PBS, um gefilterte Partikel in einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter für eine Behandlungsdosis von 5 Mikrogramm pro Milliliter und bei 5 Milligramm pro Milliliter für eine Behandlungsdosis von 50 Mikrogramm pro Milliliter zu verdünnen. Um Zellen mit Feinstaub zu behandeln, überprüfen Sie die kultivierten Zellen unter einem Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung auf Zellwachstum, Zellmorphologie, Kulturzustand und Kontamination. Die Zellen sollten zu diesem Zeitpunkt zu mindestens 30 % konfluent sein.

Aspirieren Sie das Medium mit einer sterilen Pipette aseptisch und verwenden Sie zwei Milliliter 37 Grad Celsius PBS, um das Kulturgefäß zweimal zu waschen. Fügen Sie eine vorher festgelegte Dosis Feinstaub mit frischem Medium hinzu und inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, um der Exposition zu entsprechen, die für die gleichzeitige genotoxische und epigenotoxische Analyse verwendet wird. Um die Zellen in der Metaphase zu stoppen, geben die Zellen nach dem Waschen zwei Milliliter vorgewärmtes Medium mit fünf Mikrolitern pro Milliliter Colcemidlösung in die Kultur und inkubieren zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2

Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium vollständig und waschen Sie die Zellen zweimal mit warmem PBS. Fügen Sie dann Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie die Kulturen eine Minute lang bei 37 Grad Celsius. Mit einem Zellschaber die Zellen ablösen und 10 Milliliter PBS hinzufügen, um das Trypsin zu inaktivieren.

Pipettieren Sie dann die Zellen mindestens zehnmal auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und geben Sie die Zellen in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Millilitern. Legen Sie die Röhrchen in eine ausschwenkbare Zentrifuge und schleudern Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 400-mal g und Raumtemperatur. Um eine hypotone Behandlung durchzuführen, entfernen Sie den Überstand aus den Röhrchen, ohne das Zellpellet zu stören, und lassen Sie etwa 0,5 Milliliter PBS übrig.

Brechen Sie das Zellpellet vorsichtig auf und verwenden Sie eine P200-Pipette, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Dann vier Milliliter vorgewärmte Kaliumchloridlösung tropfenweise unter leichtem Schütteln hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellsuspension 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad.

Fixieren Sie die Zellen nach der hypotonischen Behandlung, indem Sie dem Röhrchen ein gleiches Volumen Fixiermittel hinzufügen, und mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Die Röhrchen werden bei 400 mal g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugiert und der Überstand entfernt. In diesem Stadium hat das Zellpellet an Größe zugenommen und ist weißlich und sichtbarer geworden.

Entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie vier Milliliter frisches Fixiermittel hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen, entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie vier Milliliter Fixiermittel, um die Zellen zwei weitere Male zu waschen.

Tauchen Sie Objektträger 30 Minuten lang vollständig in 10 % Flüssigwaschmittel. Spülen Sie die Objektträger anschließend 30 Minuten lang gründlich unter fließendem kaltem Leitungswasser ab. Spülen Sie die Objektträger dreimal mit destilliertem Wasser ab, um das Reinigungsmittel vollständig zu entfernen.

Tauchen Sie sie dann in destilliertes Wasser und bewahren Sie die Objektträger über Nacht im Kühlschrank auf. Geben Sie zehn Mikroliter Zellsuspension auf einen gekühlten, nassen Objektträger und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Zum Färben und Einbetten der Proben werden 50 Milliter Giemsa-Färbelösung hergestellt, indem ein Teil der Giemsa-Färbelösung mit einem Teil PBS gemischt und in ein Coplin-Glas gegossen wird.

Tauchen Sie die Objektträger 20 Minuten lang in Färbelösung, spülen Sie die Objektträger dann in destilliertem Wasser ab, um überschüssige Flecken zu entfernen, und verwenden Sie sofort einen Fön, um die Objektträger zu trocknen. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Tragen Sie am nächsten Morgen einen einzigen Tropfen Eindeckmittel auf die Folie auf.

Legen Sie vorsichtig einen Deckglas darauf und lassen Sie das Eindeckmedium langsam über die Folie verteilen. Verwenden Sie dann ein Papiertuch, um überschüssiges Medium zu entfernen. Verwenden Sie abschließend ein Hellfeldmikroskop mit 100-facher Vergrößerung, um die strukturellen Chromosomenaberrationen in den Metaphasenausbreitungen zu untersuchen.

Dieses Bild zeigt, dass eine normale Maus-Metaphasenausbreitung 40 azentrische Chromosomen hat. Die Behandlung mit Feinstaub induziert verschiedene Chromosomenaberrationen, wie z. B. einen Chromatidenbruch, ein azentrisches Fragment, ein Ringchromosom, ein dizentrisches Chromosom, doppelte Minuten, eine Robertsonsche Translokation und eine Endoreduplikation. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass nur proliferierende Zellen verwendet werden sollten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie M-FISH und SKY, verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel, ob interchromosomale, stabile Aberrationen vorhanden sind. Vergessen Sie nicht die Vorsichtsmaßnahmen und Karzinogene, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.