Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

Das übergeordnete Ziel dieser peptidbasierten Methode besteht darin, Gene und Proteine über zelluläre und organellare Barrieren in Pflanzen hinweg zu transportieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen durch die gezielte Modifikation von Pflanzen mithilfe rational gestalteter Peptid-Konjugate zu beantworten, die verschiedene Gene und Proteine liefern, um die Expression spezifischer Gene zu vermitteln. Der unmittelbare Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein einfaches, spritzenunterstütztes Transfektionsverfahren von Pflanzenblättern verwendet, das auf Peptiden basiert, welche zelluläre und organellare Grenzen überwinden können.

Wir haben diese einfache, effektive und neuartige Pflanzentransformationsmethode entwickelt, da herkömmliche Methoden kostspielig sind, nicht auf bestimmte Pflanzentypen anwendbar sind und keine gezielte Bearbeitung intrazellulärer Organellen ermöglichen. Jo-Ann Church wird das Verfahren gemeinsam mit Yoko Horii, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie die Peptid-Plasma-DNA-Formulierung gemäß der schriftlichen Protokollanleitung vor.

Wenn das Peptid der Plasmadna zugegeben wird, bildet sich eine trübe Lösung. Die Mischung klart bei Verdünnung mit ultrareinem Wasser auf das im Textprotokoll angegebene Endvolumen auf. Überführen Sie 800 Mikroliter der verdünnten Lösung in eine Küvette zur Analyse der dynamischen Lichtstreuung.

Bestimmen Sie den hydrodynamischen Durchmesser und den Polydispersitätsindex der gebildeten Komplexe mit einem Zetananosizer. Verwenden Sie einen 633 Nanometer Helium-Neon-Laser bei 25 Grad Celsius mit einem Rückstreuwinkel von 173 Grad. Nach der Größenmessung überführen Sie die Lösung in eine gefaltete Kapillarzelle zur Messung des Zetapotenzials bei den Standardparametern für die Dielektrizitätskonstante, den Brechungsindex und die Viskosität von Wasser bei 25 Grad Celsius.

Um die komplexen Lösungen mittels Rasterkraftmikroskopie zu beobachten, 10 µL auf die frisch gespaltene Oberfläche eines Glimmerblättchens auftragen und das Glimmerblättchen über Nacht in einer abgedeckten Kunststoff-Petrischale an der Luft trocknen lassen. Ein Bild der Komplexe in Luft bei 25 °C mit einem Silizium-Karabiner mit einer Federkonstante von 1,3 N/m im Tapping-Modus aufnehmen. Drei Wochen alte Arabidopsis thaliana verwenden, die unter einem 16-Stunden-Licht-8-Stunden-Dunkel-Zyklus bei 22 °C gezüchtet wurden.

Wählen Sie mindestens drei Blätter für die Transpektion, um eine dreifache Wiederholung für die Quantifizierung der Genexpression zu erhalten. Befüllen Sie eine einmilliliter-kanülenfreie Plastikspritze mit 100 Mikrolitern der Komplexlösung für die Transfektion eines Blattes. Positionieren Sie dann die Spitze der Spritze auf der abaxialen Blattoberfläche.

Drücken Sie die Spritzenkanüle leicht gegen das Blatt und ziehen Sie langsam den Spritzenkolben zurück, während Sie mit dem Zeigefinger einer mit Latexhandschuh bedeckten Hand von der gegenüberliegenden Seite einen Gegendruck ausüben. Eine erfolgreiche Infiltration ist an der Ausbreitung eines wassergesättigten Bereichs im Blatt erkennbar. Kennzeichnen Sie die infiltrierten Blätter zur leichteren Identifizierung.

Inkubieren Sie die mit Peptid-Plasmid-DNA transfizierte Pflanze 12 Stunden lang in einer Wachstumskammer. Um die Transfektionseffizienz zu bewerten, schneiden Sie zuerst das gesamte transfizierte Blatt aus. Bei Transfektionsexperimenten mit dem Renilla-Luciferase-Reporter-Vektor bestimmen Sie die Transfektionseffizienz quantitativ mithilfe eines Renilla-Luciferase-Assay-Kits.

Platzieren Sie zunächst jedes entnommene Blatt in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter 1X-Lysepuffer pro Röhrchen hinzu. Bereiten Sie auf die gleiche Weise Lysate von nicht transfizierten Kontrollblättern im Dreifachansatz vor.

Zerkleinern Sie das Blatt mithilfe eines Homogenisierungsstößels und inkubieren Sie das resultierende Lysat 6 bis 10 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Lysat eine Minute lang in einer Mikrozentrifuge mit 12.470 × g. Übertragen Sie 20 Mikroliter des geklärten Lysats in eine Vertiefung einer 96-Loch-Mikrotiterplatte.

Verwenden Sie das verbleibende Volumen zur Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration mithilfe eines BCA-Protein-Assay-Kits gemäß dem Herstellerprotokoll. Geben Sie anschließend 100 µL eines einmaligen Renilla-Luciferase-Assay-Substrats in die Vertiefung und mischen Sie durch langsames Pipettieren. Stellen Sie die Mikroplatte in einen Multimode-Mikroplatten-Reader und starten Sie die Messung.

Bei Transfektionsexperimenten unter Verwendung eines Reportervektors für ein grün fluoreszierendes Protein beobachten Sie die Fluoreszenz mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Schneiden Sie zunächst die Ränder eines ganzen Blattes ab, um die Entfernung der Lufträume zu erleichtern. Entfernen Sie dann den Kolben aus einer 10-mL-Spritze und geben Sie jedes ausgeschnittene Blatt oder Blattstück in die Spritze.

Setzen Sie den Kolben wieder ein und drücken Sie ihn vorsichtig bis zum Boden der Spritze, ohne das Blatt zu zerquetschen. Ziehen Sie Wasser in die Spritze, bis diese etwa zur Hälfte gefüllt ist. Richten Sie die Spritze nach oben und drücken Sie auf den Kolben, um die Luft durch die Spitze aus der Spritze zu entfernen.

Danach die Spitze der Spritze abdecken und den Kolben langsam herunterziehen, um Luft aus dem Blatt zu entweichen zu lassen. Diesen Vorgang mehrmals wiederholen, bis das Blatt durchscheinend erscheint. Anschließend die Oberfläche eines Objektträgers mit Klebeband bedecken.

Schneiden Sie mit einer Klinge einen quadratischen Bereich auf dem Klebeband aus, der groß genug ist, um die Blattprobe aufzunehmen, und lösen Sie das quadratische Stück Klebeband mit einer Pinzette ab, um eine Probenkammer zu erzeugen. Das Klebeband dient als Abstandshalter zwischen Objektträger und Deckglas. Legen Sie das Blatt mit der abaxialen Oberfläche nach oben in die Kammer und füllen Sie den verbleibenden Bereich der Kammer mit Wasser.

Versiegeln Sie das Blatt innerhalb der Kammer mit einem Glasdeckel und sichern Sie die Ränder des Deckels mit Klebeband. Untersuchen Sie die Blattprobe mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter einem 40x-Objektiv oder einem 63x-Wasserimmersions-Objektiv. Die GFP-Fluoreszenz kann bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern sichtbar gemacht werden.

Eine optimale Herstellung der Peptid-Plasma-DNA-Formulierung bei einem Peptid-zu-DNA-Verhältnis von 0,5 sollte einen mittleren Durchmesser von etwa 290 Nanometern und einen niedrigen Polydispersitätsindex von ungefähr 0,3 aufweisen, was auf eine gleichmäßige Größenverteilung hinweist. Zusätzlich sollten die Komplexe ein Zeta-Potential von etwa 30 Millivolt zeigen. Ein repräsentatives Bild einer Atomkraftmikroskopie der Peptid-Plasma-DNA-Komplexe ist hier dargestellt.

Homogene, globuläre Komplexe wurden beobachtet. Mithilfe der Peptid-Plasmid-DNA-Formulierung kann eine kernzielgerichtete Abgabe und Expression der Plasmid-DNA in Arabidopsis thaliana erreicht werden, mit einem geschätzten Renilla-Luciferase-Wert pro Milligramm von etwa 100.000. Die mikroskopische Beobachtung wurde an Blättern durchgeführt, die mit Komplexen behandelt wurden, die unter Verwendung der Plasmid-DNA hergestellt worden waren und den GFP-Reporter kodierten, um die Genexpression zu bewerten.

Die Bilder zeigten, dass in Zellen, die mit nicht-zielgerichteten Peptid-Plasma-DNA-Komplexen transfiziert wurden, eine diffuse grüne Fluoreszenz, die der GFP-Expression entspricht, deutlich beobachtet werden konnte und im Zytoplasma lokalisiert war. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie den Weg, verschiedene protein- und nukleinsäurebasierte Frachten in lebende Pflanzen einzubringen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und das schriftliche Protokoll gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man verschiedene optimierte Formulierungen für jede Art von Fracht vorbereitet, charakterisiert und anwendet, zu denen Plasma-DNA, doppelsträngige DNA oder RNA sowie Proteine gehören.