Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

Das übergeordnete Ziel dieser Peptid-abgeleiteten Methode ist es, Gene und Proteine über zelluläre und organellare Barrieren in Pflanzen zu transportieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen durch die Modifikation von Pflanzen über rational gestaltete Peptidkonjugate zu beantworten, die verschiedene Gene und Proteine liefern, um die Expression spezifischer Gene zu vermitteln. Der unmittelbare Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein einfaches, spritzengestütztes Transfektionsverfahren von Pflanzenblättern verwendet, das auf Peptiden basiert, die zelluläre und organellare Grenzen überwinden können.

Wir haben diese einfache, effektive und neuartige Methode zur Pflanzentransformation entwickelt, da herkömmliche Methoden kostspielig sind, auf einige Pflanzenarten nicht anwendbar sind und nicht in der Lage sind, intrazelluläre Organellare zu bekämpfen. Jo-Ann Church wird das Verfahren mit Yoko Horii, einer Technikerin aus meinem Labor, vorführen. Bereiten Sie die Peptid-Plasma-DNA-Formulierung vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wenn das Peptid zur Plasma-DNA hinzugefügt wird, bildet sich eine trübe Lösung. Das Gemisch wird klar, wenn es mit Reinstwasser auf das im Textprotokoll angegebene Endvolumen verdünnt wird. 800 Mikroliter der verdünnten Lösung werden für die dynamische Lichtstreuanalyse in eine Küvette überführt.

Bestimmen Sie den hyrodynamischen Durchmesser und den Polydispersitätsindex der gebildeten Komplexe mit einem Zetananosizer. Mit einem 633 Nanometer großen Helium-Neon-Laser bei 25 Grad Celsius und einem Rückstreu-Detektionswinkel von 173 Grad. Nach den Größenmessungen wird die Lösung in eine gefaltete Kapillarzelle überführt, um das Zetapotenzial bei den Standardparametern der Dielektrizitätskonstante, des Brechungsindex und der Viskosität von Wasser bei 25 Grad Celsius zu messen.

Um die komplexe Lösung mit dem Rasterkraftmikroskop zu betrachten, geben Sie 10 Mikroliter auf die frisch freigelegte gespaltene Oberfläche einer Glimmerfolie und lassen Sie den Glimmer über Nacht in einer abgedeckten Petrischale aus Kunststoff an der Luft trocknen. Nehmen Sie ein Bild der Komplexe in Luft bei 25 Grad Celsius mit einem Silizium-Cantilever, einer Federkonstante von 1,3 Newton pro Meter im Klopfmodus auf. Verwenden Sie drei Wochen alte Arabidopsis thaliana, die in einem Zyklus von 16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkel und 22 Grad Celsius angebaut wird.

Wählen Sie mindestens drei Blätter für die Transspektion aus, die als Triplicat für die Quantifizierung der Genexpression dienen. Laden Sie eine nadellose Ein-Millileter-Kunststoffspritze mit 100 Mikrolitern komplexer Lösung für die Transfektion eines Blattes. Positionieren Sie dann die Spitze der Spritze auf der abaxialen Oberfläche des Blattes.

Drücken Sie die Spritzenspitze leicht gegen das Blatt und drücken Sie den Spritzenkolben langsam nieder, während Sie mit dem Zeigefinger einer mit Latexhandschuhen behandschuhten Hand von der gegenüberliegenden Seite einen Gegendruck ausüben. Eine erfolgreiche Infiltration kann als Ausbreitung eines wassergetränkten Bereichs im Blatt beobachtet werden. Beschriften Sie die infiltrierten Blätter zur leichteren Identifizierung.

Inkubieren Sie die Peptidplasma-DNA-transfizierte Pflanze 12 Stunden lang in einer Wachstumskammer. Um die Transfektionseffizienz zu bewerten, wird zunächst das gesamte transfizierte Blatt exzidiert. Für Transfektionsexperimente mit dem Renilla-Luciferase-Reportervektor bestimmen Sie die Transfektionseffizienz quantitativ mit einem Renilla-Luciferase-Assay-Kit.

Legen Sie zunächst jedes herausgeschnittene Blatt in ein 1,5-Millileter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 100 Mikroliter 1X Lysis Buffer pro Röhrchen hinzu. Auf die gleiche Weise werden Lysate von nicht transfizierten Kontrollblättern in dreifacher Ausfertigung hergestellt.

Mahlen Sie das Blatt mit einem Homogenisierungsstößel und inkubieren Sie das resultierende Lysat sechs bis 10 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.470 g in einer Mikrozentrifuge für eine Minute. Übertragen Sie 20 Mikroliter des geklärten Lysats in eine Vertiefung in einer 96-Well-Mikroplatte.

Verwenden Sie das verbleibende Volumen zur Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration mit einem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter des einmaligen Renilla Luciferase Assay-Substrats in die Vertiefung und mischen Sie es durch langsames Pipettieren. Legen Sie die Mikroplatte in einen Multimode-Mikroplatten-Reader und starten Sie die Messung.

Bei Transfektionsexperimenten mit einem grün fluoreszierenden Proteinreportervektor ist die Fluoreszenz mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop zu beobachten. Schneiden Sie zuerst die Ränder eines ganzen Blattes ab, um die Entfernung von Lufträumen zu erleichtern. Entfernen Sie dann den Kolben von einer 10-Mileter-Spritze und legen Sie jedes herausgeschnittene Blatt oder jeden Blattabschnitt in die Spritze.

Setzen Sie den Kolben wieder auf und schieben Sie ihn vorsichtig auf den Boden der Spritze, ohne das Blatt zu zerdrücken. Ziehen Sie Wasser in die Spritze, bis sie etwa zur Hälfte gefüllt ist. Richten Sie die Spritze nach oben und drücken Sie auf den Kolben, um Luft durch die Spitze aus der Spritze zu entfernen.

Decken Sie dann die Spitze der Spritze ab und ziehen Sie den Kolben langsam nach unten, um Luft aus dem Blatt zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis das Blatt durchscheinend erscheint. Decken Sie anschließend die Oberfläche eines Objektträgers mit Klebeband ab.

Schneiden Sie mit einer Klinge eine quadratische Fläche auf das Klebeband, die groß genug ist, um die Blattprobe aufzunehmen, und ziehen Sie das quadratische Stück Klebeband mit einer Pinzette ab, um eine Probenkammer zu schaffen. Das Klebeband dient als Abstandshalter zwischen der Folie und dem Deckglas. Legen Sie das Blatt mit der abaxialen Fläche nach oben in die Kammer und füllen Sie die verbleibende Kammerfläche mit Wasser.

Versiegeln Sie den Flügel innerhalb der Kammer mit einem Glas-Deckglas und sichern Sie die Ränder des Deckglases mit Klebeband. Untersuchen Sie die Blattprobe mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter einem 40-fach-Objektiv oder einem 63-fach-Wasserimmersionsobjektiv. Die GFP-Fluoreszenz kann bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern sichtbar gemacht werden.

Eine optimale Herstellung der Peptidplasma-DNA-Formulierung bei einem Peptid-zu-DNA-Verhältnis von 0,5 sollte einen mittleren Durchmesser von etwa 290 Nanometern und einen niedrigen Polydispersitätsindex von etwa 0,3 aufweisen, was auf eine gleichmäßige Größenverteilung hinweist. Zusätzlich sollten die Komplexe ein Zetapotential von etwa 30 Millivolt aufweisen. Hier ist eine repräsentative Rasterkraftmikroskop-Aufnahme der Peptid-Plasma-DNA-Komplexe zu sehen.

Es wurden homogene globuläre Komplexe beobachtet. Unter Verwendung der Peptid-Plasma-DNA-Formulierung kann eine nuklear-gezielte Abgabe und Expression von Plasma-DNA in Arabidopsis thaliana mit einem geschätzten Renilla-Luciferase pro Milligramm-Wert von etwa 100.000 erreicht werden. Die mikroskopische Beobachtung wurde an Blättern durchgeführt, die mit Komplexen behandelt wurden, die mit Plasma-DNA hergestellt wurden und den GFP-Reporter zur Beurteilung der Genexpression kodieren.

Die Bilder zeigten, dass in Zellen, die mit nicht-zielgerichteten Peptid-Plasma-DNA-Komplexen transfiziert wurden, eine diffuse grüne Fluoreszenz, die der GFP-Expression entspricht, deutlich beobachtet und im Zytosol lokalisiert wurde. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie, verschiedene protein- und nukleinsäurebasierte Frachten in lebende Pflanzen einzubringen. Nachdem Sie dieses Video angesehen und das Textprotokoll gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene optimierte Fomulationen für jede Art von Fracht vorbereiten, charakterisieren und anwenden können, zu denen die Plasma-DNA, die Doppelstrang-DNA oder RNA und das Protein gehören.