Name: Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie eine peptidabgeleitete Methode zur Transfektion von Pflanzenzellen mit Genen und Proteinen in Arabidopsis thaliana. Diese einfache Spritzen-Technik ermöglicht effiziente zelluläre und organelläre Zielgerichtetheit.

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Die Autoren möchten die Finanzierung anzuerkennen aus Japan Science and Technology Agency Exploratory Research für Advanced Technology (JST-ERATO), die Neue Energie und Industrial Technology Development Organization (NEDO) und Cross-Minister Strategic Innovation Promotion Program (SIP), Japan .

1. Herstellung von Peptidbasierte Formulierungen <ol><li> Vorbereitung Stammlösungen von jedem Peptid , wie folgt: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml oder 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) und (BP100) 2 K 8 (70 &amp; mgr; M). Wiegen Sie die erforderliche Menge eines jeden Peptids in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und autoklavierten Reinstwasser, um das Peptid aufzulösen. Gut mischen durch wiederholtes Pipettieren, bis eine klare Lösung erhalten wird. </li><li> Amplifizieren, und die Plasmid-DNA (pDNA), doppelsträngige DNA (dsDNA) und doppelsträngige RNA (dsRNA) nach Standardmethoden Molekular reinigen. In 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Stammlösungen mit einer Konzentration von 1 mg / ml (pDNA und dsDNA) oder 400 nM (dsRNA) zu machen. </li><li> Bereiten Sie die Protein - Stammlösung mit einer Konzentration von 7 uM, die durch Lösen von 1 mg des Proteins (z. B., Alkohol - Dehydrogenase, ADH) Pulver in 1 ml Natriumcarbonat - Lösung (0,1 M, pH 9). Beschriften Sie das Protein mit fluorescent Sonden wie Rhodamin B (RhB) Standardprotokollen nach mikroskopische Visualisierung der in die Zellen geliefert Protein zu ermöglichen. </li><li> Kombinieren der jeweiligen Komponenten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Für Peptid-pDNA Formulierungen in das Zytoplasma Targeting, fügen 6,4 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) zu 20 ul pDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 773,6 ul autoklaviert Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. Verwenden Sie das pDNA Konstrukt , das für Kernexpression (P35S-RLuc-tnos, Tabelle 1). </li><li> Für Peptid-pDNA Formulierungen die Mitochondrien - Targeting, fügen 6,6 ul Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) zu 20 ul pDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren und dann 2,4 ul BP100 (1 mg / ml) hinzufügen. Lassen Sie die Mischung für 15 min bei 25 zur Stabilisierung6; C für weitere 15 min. Hinzufügen 771 ul autoklaviertem Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. Verwenden Sie die pDNA - Konstrukt für mitochondriale Expression entworfen (pDONR-cox2: Rluc, Tabelle 1). </li><li> Für Peptid-dsDNA Formulierungen, fügen 5,1 ul (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) auf 8 ul dsDNA (1 mg / ml) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 786,9 ul autoklaviert Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. </li><li> Für Peptid-dsRNA Formulierungen, fügen Sie 50 ul (KH) 9 -BP100 (800 nM) zu 50 ul dsRNA (400 nM) und gut mischen durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen, 700 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser, die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. </li><li> Für Peptid-Protein - Formulierungen, fügen Sie 16 ul (BP100) 2 K 8 (70 &amp; mgr; M) bis 16 &amp; mgr; l von ADH (7 uM) und mischengut durch Pipettieren. Lassen Sie die Mischung bei 25 ° C für 15 Minuten zu stabilisieren. Hinzufügen 768 ul autoklaviertem Reinstwasser die Lösung auf ein Endvolumen von 800 &amp; mgr; l zu verdünnen. </li></ol></li><li> Erlauben die Formulierungen für 15 min bei 25 ° C zu stabilisieren. </li></ol> 2. Charakterisierung von Peptid-basierte Formulierungen <ol><li> Bringen Sie jede Lösung (800 ul) in eine Küvette für dynamische Lichtstreuung (DLS) Analyse. Bestimmen den hydrodynamischen Durchmesser und Polydispersitätsindex von gebildeten Komplexe mit einem zeta Nanosizer, mit einem 633 nm He-Ne-Laser bei 25 ° C mit einem Backscatter-Erfassungswinkel von 173 °. </li><li> Folgende Größenmessungen, übertragen jede Lösung (800 ul) in eine gefaltete Kapillarzelle zum Zeta-Potential-Messungen an Standardparameter der Dielektrizitätskonstante, Brechungsindex und der Viskosität von Wasser bei 25 ° C. </li><li> Beobachten eines kleinen Volumens von komplexen Lösung für DLS-Analyse verwendet, durch Rasterkraftmikroskopie (AFM). Kaution 10 ul-Komplex-Lösung auf die frisch freigelegten gespaltenen Oberfläche eines Glimmerplättchen und lassen Sie die Glimmer trocken über Nacht in einer bedeckten Petrischale aus Kunststoff an der Luft. </li><li> Erwerben Sie ein Bild der Komplexe in Luft bei 25 ° C , um einen Silizium - Cantilever mit mit einer Federkonstante von 1,3 N / m in Tapping - Modus 27,28. </li></ol> 3. Einschleusung von Pflanzenblätter <ol><li> Verwenden Sie 3 Wochen alten Boden gewachsenen Pflanzen (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 oder Pappel 26). Transfizieren mindestens 3 Blätter als dreifacher Ausführung für die Quantifizierung von Genexpression oder Proteinabgabe zu dienen. </li><li> Laden einer 1 ml Kunststoffspritze nadel mit 100 ul komplexe Lösung für die Transfektion eines Blattes. Positionieren Sie die Spitze der Spritze auf der abaxial Oberfläche des Blattes. </li><li> Drücken Sie die Spritzenspitze gegen das Blatt leicht und drücken Sie den Spritzenkolben langsam, während ein Gegendruck mit dem i ausübtndex Finger eines Latex-Handschuh von der gegenüberliegenden Seite. Erfolgreiche Infiltration kann als die Ausbreitung eines mit Wasser getränkten Bereich in dem Blatt zu beobachten. Beschriften Sie die infiltrierten Blätter zur leichteren Identifizierung. </li><li> Inkubieren der transfizierten Blatt für optimierte Dauern folgende Infiltration mit Peptid-pDNA (12 h), Peptid-dsDNA (12 h), Peptid-dsRNA (9-48 h) und Peptid-Protein (6 h) Formulierungen unter den folgenden Bedingungen: 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei 22 ° C für A. thaliana und Pappel oder 24 - Stunden - Dauerlicht bei 29 ° C für N. benthamiana. </li></ol> 4. Beurteilung der Transfektionseffizienz <ol><li> Excise die ganze transfizierten Blatt von kleineren Anlagen (z. B. A. thaliana) oder eine 1 cm 2 Abschnitt des infiltrierten Bereich für größere Anlagen (z. B. N. benthamiana). </li><li> Für Experimente Transfektion Renilla - Luciferase (Rluc) Reportervektor verwendet, bestimmen die transfection Effizienz ein Rluc Assay Kit quantitativ verwenden. <ol><li> Legen Sie jedes Blatt herausgeschnitten oder Blattabschnitt in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. 100 l 1 × Rluc Assay Lysepuffer pro Röhrchen. Auf die gleiche Weise, bereiten Lysaten von nicht transfizierten Kontrollblätter (dreifach). </li><li> Grind das Blatt eine Homogenisierung zerstoßen und Inkubation des resultierenden Lysat bei 25 ° C für 6 bis 10 Stunden. </li><li> Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.470 × g in einer Mikro für 1 min. Transfer 20 &amp; mgr; l des geklärten Lysat auf eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, und verwenden die verbleibende Volumen für die Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration eines BCA Protein Assay Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> 100 l 1 × Rluc Assay Substrat (verdünnt, um die Rluc Testpuffer verwendet wird) in den Brunnen und mischen durch langsame Pipettieren. Legen Sie die Mikrotiterplatte in einem Multimode-Mikroplatten-Reader und initiieren Messung. </li><li> Ziehen Sie den Hintergrund Lumineszenz (Mittelwert der keinn-transfizierten dreifacher Ausfertigung) von jeder Lumineszenz der Versuchsprobe. Berechnen des Verhältnisses von Photolumineszenz (relative light units, RLU) zu der Menge an Protein (mg). </li></ol></li><li> Für Transfektionsexperimente grün fluoreszierende Protein (GFP) Reportervektor mit oder fluoreszenzmarkierten Protein (z. B. ADH-RhB), beobachten die Fluoreszenz eines konfokalen Laser - Scanning - Mikroskop. <ol><li> Schneiden Sie die Ränder eines ganzen Blattes (die Entfernung von Lufträumen zu unterstützen), während eine geschnittene Blatt kann verwendet werden, wie es ist. Entfernen Sie den Kolben aus einer 10-ml-Spritze und legen jeweils herausgeschnitten Blatt oder Blattabschnitt in der Spritze. </li><li> Setzen Sie den Kolben und drücken Sie sie sanft auf den Boden der Spritze ohne das Blatt zerdrücken. Zeichnen Sie Wasser in die Spritze, bis es etwa die Hälfte gefüllt ist. </li><li> Richten Sie die Spritze nach oben und drücken in der Kolben Luft aus der Spritze durch die Spitze zu entfernen. Decken Sie die Spitze der Spritze und ziehen Sie den Kolben langsam nach unten Luft aus dem lea zu vertreibenf. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis das Blatt durchscheinend erscheint. </li><li> Bedecken die Oberfläche eines Objektträgers mit einem Klebeband. Schneiden Sie eine quadratische Fläche auf dem Band groß genug, um die Blattprobe unter Verwendung einer Klinge aufzunehmen, und ziehen Sie das Quadrat Stück Klebeband mit einer Pinzette aus einer Probenkammer zu schaffen. Das Band wird als Abstandshalter zwischen dem Schieber und Deckglas dienen. </li><li> Legen Sie das Blatt in der Kammer mit dem abaxial Oberfläche nach oben zeigt und füllen die verbleibende Kammerbereich mit Wasser. Dichten Sie das Blatt in der Kammer mit einem Deckglas und sichern Sie die Kanten des Deckglases mit Klebeband. </li><li> Überprüfen Sie die Blattprobe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter einem 40X-Objektiv oder ein 63X Wasserimmersionsobjektiv verwendet wird. GFP oder RhB Fluoreszenz kann bei Anregungswellenlängen von 488 nm bzw. 555 nm bzw. sichtbar gemacht werden. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kritischen Schritte in dem Protokoll, die empirisch diskutiert wurden identifiziert. Durch die Spritze Infiltration, die Peptid-basierten Formulierungen werden in die Lufträume im Inneren der Pflanze Blatt durch die Spaltöffnungen eingeführt. Um eine maximale Aufnahme der Lösung zu gewährleisten, sollte der Infiltrationsverfahren durchgeführt werden , wenn die Pflanzen unter Bedingungen, die zur Öffnung der Stomata dh förderlich sind., Versehen mit ausreichend Wasser und während der Lichtperiode. Im Hinblick auf die Herstellung von Transfektionskomplexen für Formulierungen, die eine Kombination von zwei Peptiden (für mitochondrialen DNA-Zielliefer) umfassen, wobei die Reihenfolge für die Zugabe der einzelnen Komponenten ist entscheidend und nicht invertiert werden sollte. Es gibt viele plausible Änderungen an dem Verfahren. Eine andere Möglichkeit für das Eindringen von Pflanzenzellen ist die Verwendung von Vakuuminfiltration, die die komplexe Lösung zu ganzen Pflanzen einzuführen ist in der Lage und / oder Teilgeweben, einschließlichApikalmeristemen. Für diese alternativen Verfahren werden Sämlinge in der Transfektionslösung eingetaucht, und basierend auf dem Druck, der durch das Vakuum erzeugt wird, die Peptid-Fracht Komplexe werden durch die Stomata und in die Pflanzenzellen (Yoshizumi, T., nicht veröffentlichte Daten) gezwungen. Transient Genexpression, basierend auf Studien an tierischen Zellen wurde mit höheren DNA - Konzentrationen von 29 bis 31 zu erhöhen gezeigt. Es ist wichtig zu beachten , dass das Verhältnis von Peptid zu DNA , die die biophysikalischen Eigenschaften beeinflusst (Größe, Oberflächenladung) von Komplexen (Abbildung 4), die Transfektionseffizienz beeinflusst; Daher muss das optimale Verhältnis auch bei erhöhter DNA-Konzentration gehalten werden. Einer der Hauptvorteile in Peptide als ein Gen / Protein-Zusteller ist, dass seine Sequenz zum Einstellen zugänglich ist, eine gewünschte Funktion zu erfüllen. Zum Beispiel beschrieb der mitochondrialen-Targeting-Domäne des Trägerpeptid in diesem Gestüty kann mit Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Sequenzen für die Lokalisierung zu dieser Organellen ersetzt werden. Während Chloroplast - Transformation in mehrere Anlagen möglich ist , unter Verwendung Biolistik 32-34 weder das Agrobacterium noch der biolistischen Methode könnte Gene in die Mitochondrien oder anderen Organellen neben dem Kern (Tabelle 2) einzuführen. Es sind keine starren Wirtsbereich Einschränkungen für Peptid-basierende Transfektion, im Gegensatz zu dem Agrobacterium basierende Verfahren (Tabelle 2). Bisher Formulierungen für die Transfektion von A. thaliana, N. benthamiana und Pappel optimiert wurden (Tabelle 1), aber das Verfahren kann auch für Nicotiana tabacum verwendet werden, Tomatenzüchtung Micro-Tom, Reis (basierend auf Vorversuchen) und andere mono- und dikotyle Pflanzen. Bisher gibt es keine bekannte Beschränkung in Transgen Größe, wenn Peptide ein verwendet werdens Transfektionsvektoren. Im Gegensatz dazu wurden große DNA - Moleküle wurden für die Transgene von etwa 200 kb wurde 37-39 berichtet die Transformationseffizienz von Agrobacterium -vermittelte Methoden 35,36 und eine obere Größenbegrenzung zu reduzieren gefunden. Verwendung von Biolistik, andererseits, große DNA - Fragmente können 38 während der Herstellung oder Lieferung in Pflanzen geschert werden. Obwohl keine obere Grenze hat für biolistische Transformation bisher physikalische Zwänge wurden , um die Größe der DNA zu beschränken gefunden , die übertragen werden kann , um viel weniger als 150 kb 40 bestimmt. Die Hauptvorteile der Verwendung des Peptid-basierten System für den Gentransfer im Vergleich zu bestehenden Ansätze entweder Agrobacterium oder Mikroprojektilbeschuss verwendet wird , oben erläutert, sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Einige Einschränkungen gibt es für dieses Verfahren, wie es steht. Erstens gezielte Abgabe von pDNA auf spezifische Organellen, wie dem mitochondria, wurde durch eine einfache Kombination von DNA-bindenden, zellpenetrierenden und Organell-Transitsequenzen möglich erwiesen, obwohl der Wirkungsgrad niedrig war. Transgen-Expression konnte festgestellt werden, durch konfokale Mikroskopie, nur in einer kleinen Population von Mitochondrien in den Zellen. Daher sind weitere Modifikationen notwendig: (i) Förderung der Translokation von mehr Komplexe durch die Zelle / Organell-Membran, und (ii) zur Expression der Dissoziation und die Übertragung von pDNA aus dem Trägerpeptid in das Ziel Organell verbessern. Zweitens wurde die transiente Expression von exogener Reportergene unter Verwendung dieses DNA-Abgabesystem, erfolgreich in den zytosolischen und mitochondrialen Kompartiment von Zellen erreicht. Stabile Inkorporation und die Expression der eingeführten Gene in der Pflanze Kern / Organell-Genoms noch nicht jedoch festgestellt worden ist, aufgrund des Fehlens von geeigneten Selektionsstrategien. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass es Bereiche für Verbesserungen oder weitere development, das Peptid abgeleitete Strategie beschrieben hier bleibt eine einfache und vielseitige Technik, die den Weg für die Lieferung verschiedener Ladungen in verschiedene Pflanzenarten geebnet hat.

Pflanzengentechnik wird konventionell verwendet, um nützliche Eigenschaften auf Pflanzen zu übertragen. In den letzten Jahren wurde diese Technologie eingesetzt, um Pflanzen in Biofabriken umzuwandeln, um pharmazeutisch wichtige und kommerziell wertvolle Proteine herzustellen, von denen viele nicht chemisch synthetisiert werden können und die Herstellung mit tierischen oder mikrobiellen Systemen sehr kostspielig ist1. Durch die Einführung neuer Gene kann der pflanzeneigene Stoffwechsel für die Produktion verschiedener Biopharmazeutika wie Antikörper, Stoffwechselenzyme, Hormone, Antigene oder Impfstoff2 manipuliert werden.
Etablierte Gentransfertechnologien für Pflanzen sind die Agrobacterium-vermittelte Verabreichung3, das Bombardement mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen (Biolistika)4 und die Elektroporation5 oder Polyethylenglykol6 Behandlung von Protoplasten. Techniken, die Protoplasten erfordern, werden im Allgemeinen vermieden, da sie zeitaufwändig und umständlich sind und zu inkonsistenten Ergebnissen führen7. Infolgedessen werden derzeit bei praktisch allen Pflanzenmodifikationsarbeiten entweder Agrobacterium oder Mikroprojektile für den Gentransfer verwendet. Die Agrobacterium-Methode wird häufiger verwendet, ist aber auf viele wirtschaftlich wichtige Pflanzenarten nicht anwendbar. In der Zwischenzeit ist der Beschuss von Mikroprojektilen aufgrund eines breiten Spektrums anfälliger Pflanzen vielseitiger, erfordert jedoch spezielle Ausrüstung und verursacht oft schwere Gewebeschäden. Darüber hinaus beinhalten diese Methoden entweder einen zufälligen (Biolistik) oder einen komplexen (Agrobacterium) Verabreichungsmechanismus und weisen variable Transformationsratenauf 8. Daher ist eine neuartige Pflanzentransformationstechnologie erforderlich, die einfach, aber effektiv ist und auf verschiedene Pflanzentypen anwendbar ist.
Derzeit werden Pflanzen in erster Linie durch die Abgabe von exogener DNA, die für ein gewünschtes Merkmal kodiert, einer genetischen Veränderung unterzogen, anstatt durch die direkte Abgabe eines Zielproteins. Die höhere Stabilität der DNA gegenüber Proteinen ist ein wesentlicher Vorteil; Zu den potenziellen Problemen im Zusammenhang mit der DNA-Übertragung gehören jedoch die zufällige Insertion exogener DNA in das Pflanzengenom und die unbeabsichtigte Übertragung von Antibiotikaresistenzgenen auf pathogene Bakterien über horizontalen Gentransfer9. Für Genom-Editing-Zwecke kann die Möglichkeit, Pflanzengenome zu bearbeiten, ohne fremde DNA in Zellen einzubringen, regulatorische Bedenken im Zusammenhang mit gentechnisch veränderten Pflanzen umgehen. Eine alternative DNA-freie Strategie für die Modifikation von Pflanzen durch direkte Verabreichung von Proteinen wird daher in der Lage sein, diesen Bedürfnissen gerecht zu werden.
Hier stellen wir ein peptidbasiertes System vor, das ursprünglich für die menschliche Gentherapie10-14 entwickelt wurde, für die gezielte Abgabe von exogenen Genen oder Proteinen in intakten Pflanzen. Peptide sind in der Lage, die DNA vor dem Abbau von Nukleasen zu schützen und können den Gentransfer über Zell- und Organellenmembranen vermitteln15-17. Sie haben auch vielfältige und einstellbare Eigenschaften, abgesehen davon, dass sie nicht zytotoxischsind 18-20. Noch wichtiger ist, dass Gene mit Hilfe von Peptiden präzise auf intrazelluläre Organellen wie die Mitochondrien21 oder Plastiden (Chloroplasten)22 zur Expression ausgerichtet werden können - eine Aufgabe, die durch biolistische oder Agrobacterium-vermittelte Transformation nicht erreicht werden kann. Abhängig von der Art der Ladung kann diese neue Pflanzenmodifikationstechnologie genutzt werden, um Proteine23 zu transportieren und entweder spezifische Gene innerhalb der Pflanze, in ihrem zytosolischen Raum24-26 oder innerhalb eines spezifischen Organellenkompartiments21 zu exprimieren (Plasmid21, 24 oder doppelsträngige RNA25) oder herunterzuregulieren (doppelsträngige RNA 26). Die entworfenen Trägerpeptide bestehen aus einer kationischen Domäne in Form von entweder Polylysin (K8) oder Polylysin-Co-Histidin (KH)9 zur Bindung und/oder Kondensation von negativ geladenen Ladungen, die an zellpenetrierende (BP100-Peptid) oder Mitochondrien-Transitsequenzen (Cytcox-Peptid) konjugiert ist.

<table><tbody><tr><td>(KH)9-BP100</td><td>Peptid Kundenspezifisch synthetisiert vom RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequenz: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)2-K8 Peptid</td><td>Kundenspezifisch synthetisiert vom RIKEN Brain Science</td><td>Institute N/A</td><td>Sequenz: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 Peptid</td><td>Kundenspezifisch synthetisiert vom RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequenz: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)9</td><td>Peptid Kundenspezifisch synthetisiert vom RIKEN Brain Science Institute</td><td>N/A</td><td>Sequenz: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS und P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kodiert für grün fluoreszierendes Protein bzw. Renilla-Luciferase-Gene unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp und pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kodiert für grün fluoreszierendes Protein bzw. Renilla-Luciferase-Gene unter der Kontrolle des mitochondrial-spezifischen Promotors cox2 (Ref: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (PCR-amplifiziert aus pBI221-P35S-Rluc-TNOS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kodiert für grün fluoreszierendes Protein bzw. Renilla-Luciferase-Gene unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors CaMV 35S (Ref: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Für RNA-Interferenz-vermitteltes Silencing von grün fluoreszierendem Protein (Ref: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Für RNA-Interferenz-vermitteltes Silencing von Chalkonsynthase (Ref: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 ml und 10 ml Kunststoffspritzen</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>Sekisui Chemical Co., Ltd.</td><td>Nr. 835</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol-Dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>Rasterkraftmikroskop</td><td>Seiko Instruments Inc.</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>Rasterkraftmikroskop</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cantilever-Mikroskop</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Korkbohrer</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>Für die Exzision von Blättern in Scheiben mit einem Durchmesser von 1 cm</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>Küvette</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>gefaltete Kapillarzelle</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td></td><td></td>DTS1070</tr><tr><td>Zange</td><td>Shimizu Akira Inc.</td><td>Rostfreie Pinzette 150</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisierungsstößel</td><td>Ieda Trading Corp.</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>Mica</td><td>Nisshin EM Co., Ltd.</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Objektträger</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>S011120</tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Kunststoff</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay Kit</td><td>Promega Corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin B Isothiocyanat</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td></td><td></td>283924</tr><tr><td>RNase-freies Wasser</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge und Griff</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>Edelstahl Nr. 14 (Klinge), Nr. 3L (Griff)</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenspitzenkappe</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta Potentiometer</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>Zetasizer Nano-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

peptid abgeleitete methode zu schleusen gene und proteine ​​über zelluläre und organell-barrieren in pflanzen

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Die Fähigkeit, exogene Proteine einzuführen und spezifische Gene in Pflanzen zu exprimieren (oder herunterzuregulieren), bietet ein mächtiges Werkzeug für die Grundlagenforschung sowie für neue Anwendungen im Bereich der Pflanzenbiotechnologie. Praktikable Methoden, die es derzeit für den Protein- oder Gentransfer in Pflanzenzellen gibt, nämlich Agrobacterium und Mikroprojektilbeschuss, haben Nachteile wie eine geringe Transformationsfrequenz, eine begrenzte Wirtsreichweite oder hohe Kosten für Geräte und Microcarrier. Das folgende Protokoll skizziert eine einfache und vielseitige Methode, bei der rational gestaltete Peptide als Verabreichungsmittel für eine Vielzahl von Nukleinsäure- und Protein-basierten Ladungen in Pflanzen verwendet werden. Peptide werden aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit, ihrer reduzierten Größe, ihrer vielfältigen und einstellbaren Eigenschaften sowie ihrer Fähigkeit, intrazellulären/organellären Zugang zu erhalten, als Werkzeuge für die Entwicklung des Systems ausgewählt. Die Herstellung, Charakterisierung und Anwendung optimierter Formulierungen für jede Art der breiten Palette der gelieferten Ladungen (Plasmid-DNA, doppelsträngige DNA oder RNA und Protein) werden beschrieben. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls, mögliche Modifikationen und bestehende Einschränkungen der Methode werden ebenfalls diskutiert.

Ein Array von Nukleinsäure und Protein Ladungen wurden erfolgreich in verschiedene Pflanzen eingebracht, die entworfen Peptide als Zuführungsvektoren verwendet wird. Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen kationischen Peptiden und negativ geladenen Ladungen führte zur Bildung von Transfektionskomplexen , die direkt in die Pflanzen infiltriert werden können Blätter eine nadellose Spritze (Abbildung 1). Optimierte Formulierungen (empirisch in diesen Studien bestimmt 21,23-26) für die Transfektion von Pflanzenzellen sind in Tabelle 1 aufgeführt, wobei jeder Typ der Vielzahl von gelieferten Ladungen (pDNA, dsDNA, dsRNA und Protein) dargestellt wird. Die mittleren Durchmesser aller peptidbasierten Formulierungen wurden in ungefähren Bereich von 150 bis 300 nm. Basierend auf DLS-Analyse zeigten alle Formulierungen relativ geringe Größe Polydispersitäten, was darauf hinweist, dass die gebildeten Peptid-Fracht-Aggregate eine einheitliche Größenverteilung aufweisen. Die MorphologienKomplexe zwischen Peptid und pDNA (2A) oder Protein (2B), auf Glimmer wurden durch AFM abgebildet. Homogene globuläre Komplexe wurden mit den Daten von DLS-Messungen für beide Peptid-pDNA und Peptid-Protein-Kombinationen in Übereinstimmung beobachtet. In Bezug auf das Zetapotential von Komplexen (Tabelle 1), pDNA- und dsDNA abgeleitete Komplexe hatten negative Nettooberflächenladungen während dsRNA-basierte Komplexe eine nahezu neutrale Oberflächenladung hatte. Peptid-Protein-Komplexe, auf der anderen Seite, wurden positiv geladen. Die Wirkungsgrade von Peptid-pDNA und Peptid-dsDNA Formulierungen in der Transfektion von A. thaliana oder N. benthamiana als Modellpflanze Systeme Vermittlung wurden als qualitativ quantitativ als auch bewertet. Rluc Genexpression Assay für die Quantifizierung von Genexpressionsniveaus (Tabelle 1), daher für dieses Experiment verwendet wurde , oder pDNAdsDNA Rluc-Gen kodiert, müssen zur Komplexierung mit den jeweiligen Träger Peptide verwendet werden. Mit dem (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung kann nuklear gezielte Abgabe und Expression von pDNA erreicht werden, nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden mit einem geschätzten RLU / mg - Wert von etwa 1 × 10 5. Für mitochondriale-zielgerichtete Abgabe und Expression von pDNA, eine Kombination von Peptiden, Cytcox- (KH) 9 und BP100, wird für die Komplexbildung erforderlich ist . Mit der gleichen optimierten Inkubationszeit von 12 Stunden jedoch eine viel niedrigere Niveau der Transfektion (etwa 1 × 10 3 RLU / mg) wurde erreicht. Inzwischen ähnliche Inkubationszeit (12 h) und Gen - Expressionsniveau (etwa 1 × 10 3 RLU / mg) wurde erforderlich / aufgezeichnet für dsDNA-Komplexen, auch die (KH) 9 -BP100 Peptid formuliert werden. Qualitative Bewertung der Genexpression wurden durch direkte mikroskopische Beobachtung der Blätter mit Komplexe prepar behandelt durchgeführted mit pDNA oder dsDNA kodiert, das GFP-Reporter-Gen. In Zellen , die mit Nicht-Zielpeptid-pDNA - Komplexen transfiziert, diffundieren grüne Fluoreszenz mit entsprechenden GFP - Expression deutlich beobachtet wurde und die in das Cytosol (3A) zu lokalisieren. Deutliche Unterschiede in der Lokalisation Muster der GFP-Fluoreszenz waren in Zellen offensichtlich mitochondrialen gezielte Peptid-pDNA Komplexe infiltriert mit. Hier punctate grüne Fluoreszenz , die mit der mitochondrialen stain colokalisieren sichtbar war, was die Spezifität der Genexpression ausschließlich in der mitochondrialen Kompartiment von Zellen (3B) bestätigt. Im Fall von Peptid-Protein-Formulierungen, Konjugation des Proteins Ladung (ADH) mit einem Fluorophor (RhB) wird die Visualisierung des gelieferten Protein im intrazellulären Kompartiment ermöglichen. Innerhalb einer kurzen Inkubationszeit von 6 Stunden, ADH-RhB Protein (blau) wurde festgestellt, überall verteilt werdendas Cytosol und Vakuole von infiltrierten Zellen (3C). unter Verwendung von Peptid-dsRNA Formulierungen Inzwischen konnte eine schnelle und effiziente Herunterregulation der Genexpression in verschiedenen Anlagen durchgeführt werden. Im ersten Experiment, A. thaliana Blatt wurde mit dem Peptid-dsRNA infiltriert Komplexe der Chalkon - Synthase - Gen (CHS) verantwortlich für Anthocyan (rotes Pigment) Biosynthese unter Dürrebedingungen zum Schweigen zu bringen. Der Unterschied im Auftreten von A. thaliana Blätter unter normalen (3D, a) und Trockenheit (3D, b) ein einfaches Mittel vorgesehen CHS zu bewerten Silencing die optimierte Peptid-dsRNA - Formulierung unter Verwendung von (Pfeil 1 zeigt die infiltriert region). In dem zweiten Experiment wurden Peptid-dsRNA - Komplexe wurden in den Blättern von transgenen A. thaliana infiltriert gelb fluoreszierendes Protein exprimieren (YFP). Eine scheinbare Reduktion der YFP-Expression konnte in den epidermalen Zellen 9 h p zu sehenOst-Transfektion (3E, F). Die Wirksamkeit der Formulierung in Herunterregulierung der Genexpression in einem anderen Anlagensystem (Pappel, 12 h nach der Transfektion) wurde ebenfalls nachgewiesen (Abbildung 3G, H). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> Abbildung 1: Peptid-basierte Formulierungen für die Lieferung von Nukleinsäure und Protein Cargoes in lebenden Pflanzen. Die entworfenen Träger Peptide bestehen aus Polykationen zu Zelle eindringende oder organellären Transitsequenzen konjugiert. Polykationen ermöglichen Bindung und / oder Kondensation von negativ geladenen Ladungen sowie Flucht aus dem endosomalen Kompartiment in Zellen nach Verinnerlichung. Lieferung von Ladungen in die Zellen und anschließend auf spezifische Organellen wird durch Zelle eindringende Sequenzen und Organell-Transitsequenzen vermittelt sind. Verschiedene Ladungen, die successfu sein könntelly in die Anlage geliefert umfassen Nukleinsäuren wie pDNA, dsDNA und dsRNA sowie Modellproteine ​​wie Rinderserumalbumin (BSA), Alkoholdehydrogenase (ADH) und Citrin (eine Variante von gelb fluoreszierendes Protein). Bioaktive Moleküle können Transfektionskomplexe mit Peptidkonjugaten über elektrostatische Wechselwirkungen zu bilden, die in Pflanzen eingeführt werden Blätter mit einer Spritze Infiltration. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> Abbildung 2: Morphologien der Peptid-basierte Formulierungen. (A) AFM Amplitudenbild von (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung bei N / P 0,5. (B) AFM Höhenbild von (BP100) 2 K 8 / ADH Formulierung bei Molaren Ratio 10. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus veröffentlichten Quellen 23,24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die mikroskopische Beurteilung von Transfektionseffizienzen Peptid-basierte Formulierungen unter Verwendung optimiert. (A) Cytosolic GFP - Expression (grün), deutlich von Chloroplasten - Autofluoreszenz (rot), wurde in den Schwammparenchym Zellen von A. thaliana beobachtet Blätter infiltriert mit (KH) 9 -BP100 / pDNA Formulierung (N / P 0,5; 12 h ). (B) die GFP - Expression (grün) wurde in den Mitochondrien (rot) in den epidermalen Zellen von A. thaliana leaf infiltriert mit Cytcox- (KH) 9 / BP100 / pDNA Formulierung (N / P 0,5 für jede peptid detektierte; 12 h). Vergrößerte Bilder von Mitochondrien mit GFP-Expression sind im äußersten rechten Bereich angezeigt. (C) Lieferung von ADH-RhB (blau) in die Schwammparenchym Zellen von A. thaliana Blätter durch (BP100) 2 K 8 in einem Peptid / Protein - Molverhältnis von 10, visualisiert 6 Stunden nach der Infiltration vermittelt. (D) A. thaliana leaf vor (a) und nach (b) Behandlung mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA - Formulierung (Molverhältnis 2; 48 h), die bei der Unterdrückung der Anthocyan - Biosynthesewegs geführt. Eine ähnliche Formulierung GFP5 dsRNA enthielt , wurde in das Blatt als negative Kontrolle (c) infiltriert. Pfeile 1 und 3 zeigen den infiltrierten Bereich, während Pfeile 2 und 4, um die nicht-infiltrierten Bereich innerhalb des Blattes an. (E) A. thaliana verlässt folgende Infiltration gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und (F) , um die verminderte YFP - Fluoreszenz zum Ausdruck mit<html> (KH) 9 -BP100 / dsRNA - Formulierung (Molverhältnis 2; 9 h). (G) Transgenic Pappel Blätter gelb fluoreszierendes Protein (YFP) und (H) die verminderte YFP - Fluoreszenz folgende Infiltration mit (KH) 9 -BP100 / dsRNA Formulierung exprimieren (Molverhältnis 2; 12 h). Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung aus veröffentlichten Quellen 21,23,24,26. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> Abbildung 4: Variation in Peptid-zu-DNA (N / P) Verhältnis und die Auswirkung auf die biophysikalischen Eigenschaften von Komplexen. Mit zunehmender Peptid zu DNA-Verhältnis, Peptid-basierten Formulierungen Abnahme der Größe, während deren Zeta-Potentialwerte Übergang von negativ zu positiv./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> Tabelle 1: Charakterisierung und Bewertung verschiedener Peptid-basierte Formulierungen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> Tabelle 2: Ein Vergleich von Peptid-basierten und anderen vorhandenen DNA - Delivery - Technologien für Intact Pflanzen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a>

Bestehende Methoden zur Modifikation von Pflanzen sind nur begrenzt anwendbar. Die hier vorgeschlagene neuartige Peptid-abgeleitete Technologie verspricht sowohl Einfachheit als auch Effizienz bei der Einführung von exogenen Proteinen oder Genen in die gewünschten intrazellulären Kompartimente intakter Pflanzen.

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Das übergeordnete Ziel dieser peptidbasierten Methode besteht darin, Gene und Proteine über zelluläre und organellare Barrieren in Pflanzen hinweg zu transportieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen durch die gezielte Modifikation von Pflanzen mithilfe rational gestalteter Peptid-Konjugate zu beantworten, die verschiedene Gene und Proteine liefern, um die Expression spezifischer Gene zu vermitteln. Der unmittelbare Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein einfaches, spritzenunterstütztes Transfektionsverfahren von Pflanzenblättern verwendet, das auf Peptiden basiert, welche zelluläre und organellare Grenzen überwinden können.Wir haben diese einfache, effektive und neuartige Pflanzentransformationsmethode entwickelt, da herkömmliche Methoden kostspielig sind, nicht auf bestimmte Pflanzentypen anwendbar sind und keine gezielte Bearbeitung intrazellulärer Organellen ermöglichen. Jo-Ann Church wird das Verfahren gemeinsam mit Yoko Horii, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie die Peptid-Plasma-DNA-Formulierung gemäß der schriftlichen Protokollanleitung vor.Wenn das Peptid der Plasmadna zugegeben wird, bildet sich eine trübe Lösung. Die Mischung klart bei Verdünnung mit ultrareinem Wasser auf das im Textprotokoll angegebene Endvolumen auf. Überführen Sie 800 Mikroliter der verdünnten Lösung in eine Küvette zur Analyse der dynamischen Lichtstreuung.Bestimmen Sie den hydrodynamischen Durchmesser und den Polydispersitätsindex der gebildeten Komplexe mit einem Zetananosizer. Verwenden Sie einen 633 Nanometer Helium-Neon-Laser bei 25 Grad Celsius mit einem Rückstreuwinkel von 173 Grad. Nach der Größenmessung überführen Sie die Lösung in eine gefaltete Kapillarzelle zur Messung des Zetapotenzials bei den Standardparametern für die Dielektrizitätskonstante, den Brechungsindex und die Viskosität von Wasser bei 25 Grad Celsius.Um die komplexen Lösungen mittels Rasterkraftmikroskopie zu beobachten, 10 µL auf die frisch gespaltene Oberfläche eines Glimmerblättchens auftragen und das Glimmerblättchen über Nacht in einer abgedeckten Kunststoff-Petrischale an der Luft trocknen lassen. Ein Bild der Komplexe in Luft bei 25 °C mit einem Silizium-Karabiner mit einer Federkonstante von 1,3 N/m im Tapping-Modus aufnehmen. Drei Wochen alte Arabidopsis thaliana verwenden, die unter einem 16-Stunden-Licht-8-Stunden-Dunkel-Zyklus bei 22 °C gezüchtet wurden.Wählen Sie mindestens drei Blätter für die Transpektion, um eine dreifache Wiederholung für die Quantifizierung der Genexpression zu erhalten. Befüllen Sie eine einmilliliter-kanülenfreie Plastikspritze mit 100 Mikrolitern der Komplexlösung für die Transfektion eines Blattes. Positionieren Sie dann die Spitze der Spritze auf der abaxialen Blattoberfläche.Drücken Sie die Spritzenkanüle leicht gegen das Blatt und ziehen Sie langsam den Spritzenkolben zurück, während Sie mit dem Zeigefinger einer mit Latexhandschuh bedeckten Hand von der gegenüberliegenden Seite einen Gegendruck ausüben. Eine erfolgreiche Infiltration ist an der Ausbreitung eines wassergesättigten Bereichs im Blatt erkennbar. Kennzeichnen Sie die infiltrierten Blätter zur leichteren Identifizierung.Inkubieren Sie die mit Peptid-Plasmid-DNA transfizierte Pflanze 12 Stunden lang in einer Wachstumskammer. Um die Transfektionseffizienz zu bewerten, schneiden Sie zuerst das gesamte transfizierte Blatt aus. Bei Transfektionsexperimenten mit dem Renilla-Luciferase-Reporter-Vektor bestimmen Sie die Transfektionseffizienz quantitativ mithilfe eines Renilla-Luciferase-Assay-Kits.Platzieren Sie zunächst jedes entnommene Blatt in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter 1X-Lysepuffer pro Röhrchen hinzu. Bereiten Sie auf die gleiche Weise Lysate von nicht transfizierten Kontrollblättern im Dreifachansatz vor.Zerkleinern Sie das Blatt mithilfe eines Homogenisierungsstößels und inkubieren Sie das resultierende Lysat 6 bis 10 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Lysat eine Minute lang in einer Mikrozentrifuge mit 12.470 × g. Übertragen Sie 20 Mikroliter des geklärten Lysats in eine Vertiefung einer 96-Loch-Mikrotiterplatte.Verwenden Sie das verbleibende Volumen zur Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration mithilfe eines BCA-Protein-Assay-Kits gemäß dem Herstellerprotokoll. Geben Sie anschließend 100 µL eines einmaligen Renilla-Luciferase-Assay-Substrats in die Vertiefung und mischen Sie durch langsames Pipettieren. Stellen Sie die Mikroplatte in einen Multimode-Mikroplatten-Reader und starten Sie die Messung.Bei Transfektionsexperimenten unter Verwendung eines Reportervektors für ein grün fluoreszierendes Protein beobachten Sie die Fluoreszenz mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Schneiden Sie zunächst die Ränder eines ganzen Blattes ab, um die Entfernung der Lufträume zu erleichtern. Entfernen Sie dann den Kolben aus einer 10-mL-Spritze und geben Sie jedes ausgeschnittene Blatt oder Blattstück in die Spritze.Setzen Sie den Kolben wieder ein und drücken Sie ihn vorsichtig bis zum Boden der Spritze, ohne das Blatt zu zerquetschen. Ziehen Sie Wasser in die Spritze, bis diese etwa zur Hälfte gefüllt ist. Richten Sie die Spritze nach oben und drücken Sie auf den Kolben, um die Luft durch die Spitze aus der Spritze zu entfernen.Danach die Spitze der Spritze abdecken und den Kolben langsam herunterziehen, um Luft aus dem Blatt zu entweichen zu lassen. Diesen Vorgang mehrmals wiederholen, bis das Blatt durchscheinend erscheint. Anschließend die Oberfläche eines Objektträgers mit Klebeband bedecken.Schneiden Sie mit einer Klinge einen quadratischen Bereich auf dem Klebeband aus, der groß genug ist, um die Blattprobe aufzunehmen, und lösen Sie das quadratische Stück Klebeband mit einer Pinzette ab, um eine Probenkammer zu erzeugen. Das Klebeband dient als Abstandshalter zwischen Objektträger und Deckglas. Legen Sie das Blatt mit der abaxialen Oberfläche nach oben in die Kammer und füllen Sie den verbleibenden Bereich der Kammer mit Wasser.Versiegeln Sie das Blatt innerhalb der Kammer mit einem Glasdeckel und sichern Sie die Ränder des Deckels mit Klebeband. Untersuchen Sie die Blattprobe mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter einem 40x-Objektiv oder einem 63x-Wasserimmersions-Objektiv. Die GFP-Fluoreszenz kann bei einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern sichtbar gemacht werden.Eine optimale Herstellung der Peptid-Plasma-DNA-Formulierung bei einem Peptid-zu-DNA-Verhältnis von 0,5 sollte einen mittleren Durchmesser von etwa 290 Nanometern und einen niedrigen Polydispersitätsindex von ungefähr 0,3 aufweisen, was auf eine gleichmäßige Größenverteilung hinweist. Zusätzlich sollten die Komplexe ein Zeta-Potential von etwa 30 Millivolt zeigen. Ein repräsentatives Bild einer Atomkraftmikroskopie der Peptid-Plasma-DNA-Komplexe ist hier dargestellt.Homogene, globuläre Komplexe wurden beobachtet. Mithilfe der Peptid-Plasmid-DNA-Formulierung kann eine kernzielgerichtete Abgabe und Expression der Plasmid-DNA in Arabidopsis thaliana erreicht werden, mit einem geschätzten Renilla-Luciferase-Wert pro Milligramm von etwa 100.000. Die mikroskopische Beobachtung wurde an Blättern durchgeführt, die mit Komplexen behandelt wurden, die unter Verwendung der Plasmid-DNA hergestellt worden waren und den GFP-Reporter kodierten, um die Genexpression zu bewerten.Die Bilder zeigten, dass in Zellen, die mit nicht-zielgerichteten Peptid-Plasma-DNA-Komplexen transfiziert wurden, eine diffuse grüne Fluoreszenz, die der GFP-Expression entspricht, deutlich beobachtet werden konnte und im Zytoplasma lokalisiert war. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie den Weg, verschiedene protein- und nukleinsäurebasierte Frachten in lebende Pflanzen einzubringen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und das schriftliche Protokoll gelesen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man verschiedene optimierte Formulierungen für jede Art von Fracht vorbereitet, charakterisiert und anwendet, zu denen Plasma-DNA, doppelsträngige DNA oder RNA sowie Proteine gehören.

peptide-derived-method-to-transport-genes-proteins-across-cellular

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Makromolekulare Handel zwischen Pflanzenzellen können durch transiente Expression eines Fluoreszenz-markierten Proteins von Interesse und die Analyse ihrer intra-und interzelluläre Verteilung durch konfokale Mikroskopie beurteilt werden.

Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment

Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält,...

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Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Zinkfingerdomänen sind eigen zellpermeablen und fähig zur Vermittlung Proteinabgabe in einem weiten Bereich von Säugetierzelltypen. Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung Zinkfinger-Technologie für die intrazelluläre Proteinabgabe dargestellt.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

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Eine einfache Methode zur Isolierung der Sojabohne Protoplasten und Anwendung auf vorübergehende Genexpressionsanalysen

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Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

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Direktinfusionsgerät zur Molekülabgabe in Pflanzen

Dieses Protokoll beschreibt die Auswahl optimaler plasmodesmaler Marker für konfokalmikroskopische Analysen von Proteinen, die während Virus-Plasmodesmata-Interaktionen oder des plasmosmodesmalen Transports auf Plasmodesmen abzielen.

Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

Erfahren Sie eine peptidabgeleitete Methode zur Transfektion von Pflanzenzellen mit Genen und Proteinen in Arabidopsis thaliana. Diese einfache Spritzen-Technik ermöglicht effiziente zelluläre und organelläre Zielgerichtetheit.

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

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