Name: Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Erfahren Sie, wie intrazelluläre Signalereignisse in lebenden Zellen nach Interaktion mit apoptotischen Nachbarzellen identifiziert werden. Diese kostengünstige Methode nutzt BUNPT-Zellen und Staurosporin-induzierte Apoptose.

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Diese Arbeit wurde, ganz oder teilweise, durch institutionelle Mittel von Dr. José A. Arruda und der Sektion für Nephrologie, Universität von Illinois in Chicago (an J. S. L.) unterstützt; und finanziell von der medizinischen Abteilung der McGill University und dem Forschungsinstitut des McGill University Health Centre (an J. R.)

1. Vorbereitungen Anmerkung: In diesem Protokoll werden zwei oder mehrere Zelllinien oder primäre Zellkulturen werden unabhängig hergestellt unter spezifischen Bedingungen. Diese Präparate enthalten apoptotischen Zellen (Protokoll 1), nekrotische Zellen (Protokoll 2) und gesunden Responderzellen (Protokoll 3). Nach unabhängige Herstellung sind apoptotischen oder nekrotischen Zellen zu Responderzellen zugegeben und die erhaltene Signaltransduktion wird überwacht (Protocols 4, 5 und 6). <ol><li> Bereiten Kulturmedien und Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie 500 ml Kulturmedium A (für den Einsatz, wenn die Zellen unter permissiven Bedingungen wachsen, siehe Abschnitt 1.2) durch die Kombination der folgenden: 1x Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 4,5 g / l Glucose, 584 mg / l ʟ-Glutamin, 110 mg / l Natriumpyruvat, 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin, 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 10 Einheiten / ml Interferon-γ (IFN-γ). </li><li> Bereiten 500 ml Kulturmedium B (zur Verwendung when Serum-hungernde Zellen unter nicht-permissiven Bedingungen, Abschnitt 1.2) von FBS und IFN-γ aus dem Rezept des Kulturmediums A. Auslassen Um Zellen unter nicht-permissiven Bedingungen (vor der Serum-Hunger) wachsen, mit 10% v sehen / v FBS Kulturmedium B. </li><li> Bereiten 0,4% (v / v) Paraformaldehyd, pH 7,2, in 1x Dulbecco-phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) von 4% Paraformaldehyd Lager zur Fixierung von toten Zellen. Hinweis: Paraformaldehyd ist giftig und entsprechende Vorsicht ist bei seiner Verwendung ausgeübt werden. </li></ol></li><li> Kultur BU.MPT Zellen <ol><li> Tauen aus flüssigem Stickstoff ein Fläschchen BU.MPT Zellen. Hinweis: BU.MPT ist eine Maus Niere proximale röhrenförmige Epithelzellen (PTEC) Linie von einer transgenen Maus abgeleitet ist eine temperaturempfindliche (ts) Mutation (tsA58) des SV40 großen Tumor Antigen (Tag) unter der Kontrolle des Maus-tragenden Haupt Histocompatibility Complex (MHC) H-2K b Klasse I - Promotor 25,26. </li><li> Platten-Zellen auf sterile polystyrene Vakuum-Gasplasma behandelten Gewebekulturschalen (~ 5 × 10 6 Zellen pro 100 mm Durchmesser - Schale). </li><li> Wachsen Zellen unter permissiven Bedingungen in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre. Anmerkung: permissiven Bedingungen, die als Kultur definiert werden bei 33 bis 37 ºC in Gegenwart von IFN-γ, ermöglichen eine stabile Expression des tsA58-mutierten TAg Transgen. Im Gegensatz zu Primärkulturen von Maus Niere PTEC, die mehr überleben nicht als eine einzige Passage oder zwei, kultiviert BU.MPT unter permissiven Bedingungen unbegrenzt passagiert werden. <ol><li> Passage-Zellen mindestens dreimal nach dem Auftauen vor ihnen in einem Experiment verwendet wird. <ol><li> Zur Passage - Zellen, 1 ml von 0,05% Trypsin pro 100 - mm - Schale, und Inkubation in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 5 min. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 10 ml Medium A. aspirieren die abgelösten Zellen und Split im Verhältnis 1: 3 bis 1: 5 in neue 100 mm sterile Polystyrol Vakuum-Gasplasma behandelt tissue Kulturschalen. In Medium A das Volumen zu bringen, bis zu einer Gesamtmenge von 10 ml pro 100 mm Schale. </li></ol></li></ol></li><li> In Vorbereitung für die experimentelle Verwendung als Zellen reagiert, Zellen wachsen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter nicht-permissiven Bedingungen (dh bei 39 ºC in Abwesenheit von IFN-γ [Medium B mit 10% v bis zur Konfluenz / v FBS]). Hinweis: Unter nicht-permissiven Bedingungen, die Expression des tsA58 mutierten TAg Transgen gehemmt durch&gt; 95%, und BU.MPT Zellen verhalten sich wie Primärkulturen von Maus Niere PTEC. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von apoptotischen Zellen BU.MPT (Protokoll 1) Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von apoptotischen Zellen und Staurosporin als Verfahren zur Apoptoseinduktion spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur, kann als Quelle für apoptotische Zellen verwendet werden, wobei die Apoptose durch standardisierte Protoco induziertels für diesen bestimmten Zelltyp und ein Verfahren zur Induktion der Apoptose. <ol><li> Nach dem Durchgang auf 100 mm Durchmesser sterile Polystyrolvakuumgasplasma behandelte Gewebekulturschalen wachsen BU.MPT Zellen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter permissiven Bedingungen zur Konfluenz (dh bei 37 ºC in Kulturmedium A an 10 ml pro 100-mm-Schale), wie in Abschnitt 1.2.3 beschrieben. </li><li> Spülen Sie die adhärenten Zellschicht dreimal mit Kulturmedium B, unter Verwendung von 10 ml pro Spülung. </li><li> Apoptose induzieren , indem die Zellen in Kulturmedium B enthält Staurosporin Inkubieren einer nicht - selektiven Proteinkinase - Inhibitor, bei 1 &amp; mgr; g / ml für 3 Stunden in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ºC. </li><li> Saugen Sie das Staurosporin haltigen Medium &quot;schwebenden&quot; apoptotischen Zellen enthalten, die von der einschichtigen abgelöst haben. Zentrifuge dieses Medium für 10 Minuten bei 500 · g, den Überstand verwerfen, waschen Sie das Pellet dreimal mit Kulturmedium B, undfügen Sie das Pellet zurück zu den Zellen im nächsten Schritt gesammelt, 2.5. </li><li> Lösen sich die verbleibenden adhärenten Zellen aus den Schritten 2.3 und 2.4 durch Zugabe von 5 mM (Ethylendiamintetraessigsäure) EDTA in 1x Ca 2 + - und Mg 2 + -freien DPBS bei 1 ml pro Schale für 5 min. Saugen Sie das EDTA-haltige Medium abgelöst apoptotischen Zellen enthält, und bündeln die abgelösten Zellen mit den &quot;schwebenden&quot; apoptotischen Zellen aus Schritt 2.4 in einem sterilen 15 ml Polystyrol-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Waschen Sie die apoptotischen Zellen dreimal durch Zentrifugation für 10 min bei 500 xg und Resuspension in 10 ml 1x Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS pro Waschung. </li><li> Nach der letzten Waschung unterbrechen die apoptotischen Zellen in frischem Kulturmedium B bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml vor der Verwendung zu Responderzellen zu stimulieren. Alternativ fixieren gewaschen apoptotischen Zellen in 0,4% (v / v) Paraformaldehyd in 1x DPBS für 30 Minuten, und dann dreimal waschen mit KulturMedium B, vor Suspension in Kulturmedium B. </li><li> Gegebenenfalls bestätigen Induktion von Apoptose mittels Durchflusszytometrie eine getrennte Herstellung von apoptotischen Zellen (oder durch einige Zellen für diesen Zweck reserviert), wie zuvor beschrieben 6,9,10,15. Anmerkung: Frühe apoptotische Zellen intakte Zellmembranen und erscheinen als Propidiumiodid (PI) -negativen und Annexin V-positive Zellen verringerte Zellgröße (bezogen auf den lebensfähigen Zellen). Späten haben apoptotische Zellen nicht intakten Zellmembranen und erscheinen als PI-positive und Annexin V-positive Zellen der Zellgröße verringert. Mit dem aktuellen Protokoll, typische Zubereitungen enthalten ~ 85% früh apoptotischen und ~ 15% spät apoptotischen Zellen. </li><li> apoptotischen Zellen In den Responderzellen (Protokoll 3) an einem apoptotischen-to-Responderzellverhältnis von 1 BU.MPT: 1, entweder direkt oder nach der Fixierung von apoptotischen Zellen für 30 min mit 0,4% (v / v) Paraformaldehyd in 1x DPBS . Hinweis: Die apoptotischen Zellfixierung vor der Stimulation der Responder solltenbeeinflussen die Ergebnisse nicht, es sei denn , die beobachteten Signalereignisse aufgrund Freisetzung eines löslichen Mediator (Tabelle 1) sind. </li></ol> 3. Herstellung von Nekrotischer BU.MPT Zellen (Protokoll 2) Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von nekrotischen Zellen und Erhitzen als Verfahren zur Nekrose Induktions spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur kann als Quelle von nekrotischen Zellen verwendet werden, wobei durch standardisierte Protokolle für diesen bestimmten Zelltyp und ein Verfahren zur Nekrose Induktion induzierte Nekrose. <ol><li> Nach dem Durchgang auf 100 mm Durchmesser sterile Polystyrolvakuumgasplasma behandelte Gewebekulturschalen wachsen BU.MPT Zellen in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter permissiven Bedingungen zur Konfluenz (dh bei 37 ºC in Kulturmedium A an 10 ml pro Schale), wie in Abschnitt 1.2.3 beschrieben. </li><li> Spülen Sie die adhärenten Zellschicht dreimal mit Kulturmedium B, unter Verwendung von10 ml pro Spülung. </li><li> Lösen sich die Zellen durch Zugabe von 5 mM EDTA in 1x Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS bei 1 ml pro Schale für 5 min. Saugen Sie das EDTA-haltige Medium abgelösten Zellen enthält, und fügen Sie in ein steriles 15 ml Polystyrol-Zentrifugenröhrchen die Zellsuspension. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal durch Zentrifugation für 10 min bei 500 xg und Resuspension in 10 ml Ca + 2 - und Mg + 2 -freie DPBS pro Waschung. </li><li> Nach der letzten Waschung, um die Zellen in frischem Kulturmedium B bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml einzustellen. </li><li> Induce Nekrose von Zellen auf 70 ° C für 45 min in einem Wasserbad, sanft verwirbelt die Zellsuspension alle 10 min erhitzt wird. </li><li> Inkubiere Zellen für 2 h in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C. alle 15 min vorsichtig Vortex, um die Zellsuspension. </li><li> Gegebenenfalls bestätigen die Induktion von Nekrose mittels Durchflusszytometrie eine separate Herstellung ne mitcrotic Zellen (oder durch einige Zellen für diesen Zweck reserviert), wie zuvor beschrieben 6,9,10,15. Hinweis: Nekrotische Zellen Zellmembranen aufgebrochen sind, und erscheinen als PI-positive Zellen mit erhöhter Zellgröße (bezogen auf den lebensfähigen Zellen). Mit dem aktuellen Protokoll, typische Zubereitungen enthalten ≥ 95% nekrotischen Zellen. Alternativ Induktion von Nekrose und den Verlust der Membranintegrität kann durch Trypan-Blau-Färbung bestätigt. </li></ol> 4. Herstellung von BU.MPT Responderzellen (Protokoll 3) Hinweis: Dieses Protokoll für BU.MPT Zellen als Quelle von Responderzellen spezifisch ist. Alternativ kann eine andere Zellinie oder primäre Zellkultur, können als Responderzellen verwendet werden. Vor der experimentellen Verwendung kann quiescence kann über Nacht durch standardisierte Protokolle im Labor induziert. <ol><li> Wachsen BU.MPT Zellen in sterilen 100-mm-Gewebekulturschalen unter permissiven Bedingungen in Kulturmedium A bei 10 ml pro Schale, bis sie erreichen ~85% Konfluenz. </li><li> Absaugen Kulturmedium A, und spülen Sie die Zellen dreimal mit Kulturmedium B bei 10 ml pro Spülung. Serum-verhungern die Zellen über Nacht für 18 bis 24 h in einer befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre unter nicht-permissiven Bedingungen (dh bei 39 ºC in Kulturmedium B bei 10 ml pro Schale), wie im Abschnitt 1.2 0,4, um Ruhe zu induzieren. Alternativ wachsen Zellen in Kulturmedium B plus 10% (v / v) FBS bei 39 ºC für einen Tag, bevor Serum Zellen hungern ohne FBS über Nacht in Kulturmedium B. </li><li> Beschriften Sie eine separate Gewebekulturschale konfluierender BU.MPT Zellen für jede Versuchsbedingung. </li><li> Umfassen die folgenden sechs Bedingungen: Stimulation von lebensfähigem BU.MPT Responder mit entweder Vehikel oder epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) für 15 min, nach ihrer Belichtung für 30 min bis entweder keine Zellen, apoptotische Zellen oder nekrotischen Zellen. Hinweis: Die Einwirkung der toten Zellen können entweder stimulieren oder den Grad der Aktivität eines gi hemmenven Signalmolekül. Die Stimulation wird am besten über einem niedrigen Ausgangswert nachgewiesen (zB Abwesenheit von EGF), während die Hemmung wird am besten von einem hohen Ausgangswert nachgewiesen (zB Vorhandensein von EGF). Da die Wirkung der Stimulation mit toten Zellen a priori nicht bekannt ist, wird empfohlen , alle Studien sowohl in der Abwesenheit und Anwesenheit von EGF auszuführen. </li></ol> 5. Die Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen und nekrotischen Zellen (Protokoll 4) <ol><li> Absaugen Kulturmedium B aus voretikettierten Gerichte der Ruhe (Serum-ausgehungert) BU.MPT Responderzellen (Protokoll 3). Hinweis: Nach der Nacht-Kultur unter nicht-permissiven Bedingungen, BU.MPT Zellen wie Primärkulturen von Maus Niere PTEC verhalten soll. </li><li> Pro 100-mm-Schale, 2 ml eines der folgenden: Kulturmedium B (keine Zellen); apoptotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 1); oder nekrotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro mL in Kulturmedium B (Protokoll 2). <ol><li> Verteilen Sie die 2 ml Suspension von toten Zellen gleichmäßig über die 100-mm-Schale, und halten Sie die Zeit für sie, auf ein Minimum zu begleichen. Um dies zu erreichen, verteilen die tote Zellsuspension tropfenweise mit einer breiten Spitze Pipette über die gesamte Oberfläche der Responderzell Gerichte. Verwenden Sie ein Volumen von 2 ml als Kompromiss zwischen der Einschwingzeit minimiert und die Verklumpung von toten Zellen zu vermeiden. Hinweis: Die Verwendung einer Suspension von toten Zellen als Anregung eine Reihe von speziellen Überlegungen zur Folge hat , die im Folgenden näher beschrieben werden (Tabelle 2 und Diskussion). </li><li> Erreichen Sie einen Toten-to-Responder - Zellen - Verhältnis von ~ 1: 1 durch Zugabe von 2 ml toten Zellen bei ~ 5 × 10 6 Zellen pro ml zu einem konfluenten 100 - mm - Schale, die ~ 10 x 10 6 Zellen enthält. Alternativ kann, um die Dosisabhängigkeit von irgendwelchen beobachteten Signalereignisse zu etablieren, variieren das Verhältnis von Toten zu Responderzellen kontinuierlich durch progressive Verdünnung in Kulture Medium B der toten Zellsuspensionen in den Protokollen 1 und 2 hergestellt. </li></ol></li><li> Vorsichtig die Teller wirbeln, dann in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ºC inkubiert. </li><li> Nach 30 Minuten Stimulierung entweder die Responderzellen mit Vehikel oder 50 nM EGF, entsprechend der vorge Kennzeichnung der Kulturschale. </li><li> In einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 15 min inkubieren. </li><li> Waschen Sie die toten Zellen entfernt durch Zugabe von 5 ml eiskaltem 1x DPBS, wirbeln die Schüssel, und Absaugen der Waschflüssigkeit. Dreimal wiederholen. </li><li> Ab sofort legen Sie die Responderzellschalen auf Eis für die weitere Verarbeitung. </li><li> Bereiten Sie Zelllysaten <ol><li> Bereiten Zelllysepuffer folgendes enthält: 1 × Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), 10 mM Natriumpyrophosphat, 0,5% w / v Desoxycholat, 0,1% w / v SDS, 10% Glycerin und 25 mM Natriumfluorid. <ol><li> Unmittelbar vor der Lyse der Zelle, die folgende in der exakten Reihenfolge im ind gegeben hinzufügencated Konzentrationen: mini EDTA-freie Proteaseinhibitorcocktail (1 Tablette pro 10 ml Lyse-Puffer), 10% (v / v) Triton X-100, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und 10 mM Natriumorthovanadat. </li></ol></li><li> In 700 ul eiskaltem Zelllysepuffer pro 100 mm Schale frisch stimuliert Responderzellen auf Eis aus Schritt 5.7. Scrape-Zellen mit einem Zellschaber und übertragen das Lysat vorab gekühlt 1,5 ml Mikroröhrchen. Pflegen Sie die Röhrchen auf Eis für 15 min. </li><li> Beschallen Lysaten auf Eis mit 10 Impulsen von 20 Hz, weniger als eine Sekunde pro Dauer. Vermeiden Sie die Erstellung von Schaum an der Gas / Flüssig-Grenzfläche, da dies die Proben überhitzen kann. Tauchen Sie voll und ganz die Beschallungsgerät Sonde in die Mikroröhrchen Lysaten vor der Beschallungsgerät einschalten, und schalten Sie das Beschallungsgerät aus, bevor die Sonde aus den Lysaten zu entfernen. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 g für 10 min bei 4 ° C, übertragen Sie die Überstände in frische vorgekühlte Mikroröhrchen, Und lagern bei -70 ºC. </li><li> Führen Gelelektrophorese und Immunoblotting auf Überständen von Lysaten, wie zuvor beschrieben 6,9,10,15. </li></ol></li></ol> 6. Vermeiden von direkter physischer Kontakt zwischen Targets und Responders Mit einem Semipermeable Polycarbonat-Membran (Protokoll 5) <ol><li> Bereiten Sie BU.MPT Responderzellen gemäß Protokoll 3, mit einer Ausnahme; wachsen Zellen in sterilen Kultur Polystyrol Gewebe behandelt 12-Well-Clustern. </li><li> In ausgewählten Wells, legen Sie ein durchlässiges Trägersystem eine 0,4 um Polycarbonatmembran enthält physikalische Wechselwirkung zwischen toten und Responderzellen zu verhindern. Umfassen Kontrollvertiefungen ohne Membran in dem gleichen Experiment. </li><li> Absaugen Kulturmedium B aus experimentellen Vertiefungen von Serum-ausgehungert BU.MPT Responderzellen. </li><li> Folgen Protokoll 4 zur Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen oder nekrotischen Zellen, mit den folgenden Modifikationen: <ol><li> Pro Vertiefung der 12-Well-Cluster, mit 0,1 ml eines der folgenden: Kulturmedium B (keine Zellen); apoptotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 1); oder nekrotischen Zellsuspension bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml in Kulturmedium B (Protokoll 2). Hinweis: Da ein konfluenter Vertiefung einer 12-Well - Cluster enthält ~ 0,5 × 10 6 Zellen, Zugabe von 0,1 ml der toten Zellen bei ~ 5 x 10 6 Zellen pro ml ergibt eine dead-to-Responderzellenverhältnis von ~ 1: 1. </li><li> Um Brunnen die durchlässige Trägersystem enthält, fügen Sie die toten Zellen auf der Oberseite des 0,4 um Polycarbonatmembran innerhalb des durchlässigen Trägersystem, so gibt es keine direkte physikalische Wechselwirkung zwischen toten und Responderzellen. </li></ol></li></ol> 7. Die Hemmung der Phagozytose mit Cytochalasin D (Protokoll 6) <ol><li> Bereiten Sie BU.MPT Responderzellen gemäß Protokoll 3. </li><li> Bereiten Sie den Cytoskelettinhibitor Cytochalasin D in dimethyl Sulfoxid (DMSO) bei 4 mg / ml (1000 ×). In den vormarkiert Speisen der BU.MPT Responderzellen entweder 10 &amp; mgr; l Vehikel (DMSO) oder 10 &amp; mgr; l von Cytochalasin D eine Endkonzentration von 4 ug / ml in 10 ml Kulturmedium zu erreichen, B. Hinweis: Bei dieser Konzentration von Cytochalasin D, Phagozytose von BU.MPT Zellen und Makrophagen - Zelllinie von ≥90% 9,10 gehemmt wurde. </li><li> Inkubieren für 2 h bei 37 ºC in einem befeuchteten 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre. </li><li> Folgen Protokoll 4 zur Stimulation der Responder-Zellen mit apoptotischen oder nekrotischen Zellen. </li><li> Gegebenenfalls bestätigen die Hemmung der Phagozytose von abgestorbenen Zellen mittels Durchflusszytometrie eine getrennte Herstellung von Toten und Responderzellen (oder für diesen Zweck reservierten Zellen), wie zuvor beschrieben 9,10. </li></ol>

<ol><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+versus+accessory+aspects+of+cell+death%3A+recommendations+of+the+NCCD+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015.</a> Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).</li>
<li>Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+tissue+injury+and+cell+death+in+inflammation%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective.</a> Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHochreiter-Hufford%2C+A+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22">Cold Spring Harb. Perspect. Biol</a>. 5, a008748(2013).</li>
<li>Reddy, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+macrophages+induces+novel+signaling+events+leading+to+cytokine-independent+survival+and+inhibition+of+proliferation%3A+activation+of+Akt+and+inhibition+of+extracellular+signal-regulated+kinases+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2.</a> J. Immunol. 169, 702-713 (2002).</li>
<li>Cvetanovic, M., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+discrimination+of+apoptotic+cells%3A+repression+of+proinflammatory+macrophage+transcription+is+coupled+directly+to+specific+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition.</a> J. Immunol. 172, 880-889 (2004).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells%2C+at+all+stages+of+the+death+process%2C+trigger+characteristic+signaling+events+that+are+divergent+from+and+dominant+over+those+triggered+by+necrotic+cells%3A+implications+for+the+delayed+clearance+model+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity.</a> J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).</li>
<li>Cvetanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+apoptotic+cells+reveals+a+ubiquitous+and+unconventional+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity.</a> J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).</li>
<li>Birge, R. B., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+apoptotic+immunity%3A+the+calming+touch+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Innate apoptotic immunity: the calming touch of death.</a> Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+apoptotic+cells+by+epithelial+cells%3A+conserved+versus+tissue-specific+signaling+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses.</a> J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition-dependent+signaling+events+in+response+to+apoptotic+targets+inhibit+epithelial+cell+viability+by+multiple+mechanisms%3A+implications+for+non-immune+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).</li>
<li>Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+effects+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive effects of apoptotic cells.</a> Nature. 390, 350-351 (1997).</li>
<li>Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+that+have+ingested+apoptotic+cells+in+vitro+inhibit+proinflammatory+cytokine+production+through+autocrine%2F+paracrine+mechanisms+involving+TGF-%CE%B2%2C+PGE2%2C+and+PAF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Investig%22%5BJournal%5D)">Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF.</a> J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).</li>
<li>Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+and+innate+immune+stimuli+combine+to+regulate+macrophage+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion.</a> J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).</li>
<li>Ariel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+neutrophils+and+T+cells+sequester+chemokines+during+immune+response+resolution+through+modulation+of+CCR5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression.</a> Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).</li>
<li>Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+E1+and+protectin+D1+activate+inflammation-resolution+programmes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes.</a> Nature. 447, 869-874 (2007).</li>
<li>Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+are+pleiotropic+inhibitors+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response.</a> Cell. 131, 1124-1136 (2007).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+can+activate+the+%22phoenix+rising%22+pathway+to+promote+wound+healing+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration.</a> Sci. Signal. 3, ra13(2010).</li>
<li>Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dangerous+attraction%3A+phagocyte+recruitment+and+danger+signals+of+apoptotic+and+necrotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells.</a> Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+activate+AMPK+and+inhibit+epithelial+cell+growth+without+change+in+intracellular+energy+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores.</a> J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).</li>
<li>Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cook-Mills+J.M.+Human+and+murine+high+endothelial+venule+cells+phagocytose+apoptotic+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes.</a> Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).</li>
<li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Sci. Signal. 2, ra51(2009).</li>
<li>Esmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+neutrophil+granulocytes%3A+diminished+proinflammatory+neutrophil+functions+in+the+presence+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells.</a> J. Immunol. 184, 391-400 (2010).</li>
<li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calreticulin+exposure+dictates+the+immunogenicity+of+cancer+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death.</a> Nature Med. 13, 54-61 (2007).</li>
<li>Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dangerous+attraction%3A+phagocyte+recruitment+and+danger+signals+of+apoptotic+and+necrotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells.</a> Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).</li>
<li>Sinha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+activates+the+Wnt+and+phosphatidylinositol+3-kinase+Akt+signaling+pathways+to+promote+cell+survival+in+the+absence+of+soluble+survival+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Wakasugi, K., Schimmel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+cytokines+released+from+a+human+aminoacyl-tRNA-synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase.</a> Science. 284, 147-151 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir stellen hier ein Protokoll, um die intrazelluläre Signalisierungsereignisse für die Charakterisierung in lebenden Zellen induziert nach ihrer Exposition gegenüber Zellen, die einer Apoptose unterliegen, oder anderen Formen von Zelltod. Das Protokoll betont die mehrere Mechanismen, durch die Exposition gegenüber apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen modulieren können. Diese Mechanismen sind: die Interaktion (über Moleküle oder Oberflächendeterminanten auf die tote Zelle o...

Apoptosis oder regulierte Zelltod 1 trägt in wesentlicher Weise zur Erhaltung und Entwicklung von Geweben. Gesehen am einfachsten, Apoptose Genehmigungen im Alter, beschädigt oder überschüssige Zellen ohne Schaden für das umgebende Gewebe 2,3 beseitigt werden. Der Beitrag der Apoptose Gewebshomöostase jedoch wesentlich dynamischer und vielfältig. Die Zellen durch Apoptose erwerben mehrere neue Aktivitäten zu sterben, beide abgesondert und zellassoziierte, die es ihnen ermöglichen 4-10 die Funktion benachbarter lebenden Zellen zu beeinflussen. Frühere Untersuchungen über die Fähigkeit von apoptotischen Zellen konzentriert Entzündung 11-16, aber apoptotischen Zellen zu unterdrücken , auch ein breites Spektrum von Zellfunktionen modulieren, einschließlich solcher vital Aktivitäten als Überleben 4,9,10, 4,9,10 - Proliferation, Differentiation 17, Migration 18 und 19 das Wachstum. Außerdem sind diese Wirkungen nicht auf professionelle Phagozyten beschränkt ist, wie Makrophagens, aber auf praktisch allen Zelltypen und Abstammungslinien erstrecken, einschließlich traditionell nicht-phagozytische Zellen, wie Epithelzellen und Endothelzellen 7,9,10,18-21. Die spezifische Reaktion benachbarter lebenden Zellen zu apoptotischen Zellen nach der Exposition, hängt von mehreren Faktoren, die sowohl die lebensfähigen reagierenden Zellen beziehen, und den apoptotischen Zellen selbst. Obwohl beispielsweise Exposition gegenüber apoptotischen Zellen hemmt , die Proliferation von sowohl murinen Makrophagen und Nieren proximalen tubulären Epithelzellen (ptecs), wobei diese beiden Zelltypen unterscheiden sich erheblich in ihrem Überleben Reaktion auf apoptotische Zellen 4,6,9,10. Apoptotischen Zellen fördern das Überleben von Makrophagen, aber der apoptotischen Tod von ptecs 4,6,9,10 induzieren. Bemerkenswert ist , kann die Reaktion auf apoptotische Zellen unterscheiden sich auch Zellen der gleichen Abstammungslinie, abhängig von der Reaktion Zelle Ursprungsorgan 10 (beispielsweise Nieren ptecs Vergleich Brustepithelzellen unter reagiertZellen) oder Zustand der Aktivierung 22 (zB Neutrophile). Umgekehrt kann apoptotischen Zellen unterschiedliche Antworten in der gleichen Zelle evozieren von der Art des apoptotischen Stimulus abhängig 10,23 oder das Stadium der Apoptose 10,14. Da müssen die Verschiedenheit und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen, große Sorgfalt in sezieren die Signalereignisse und Wege für einen bestimmten Ergebnis verantwortlich gemacht werden. Erstens Antworten direkte physikalische Interaktion zwischen lebens- und apoptotischen Zellen erfordern , müssen von den durch lösliche Mediatoren durch die apoptotische Zelle 3,6-10 freigesetzt oder erzeugt ausgelöst differenziert werden. Wenn physikalische Wechselwirkung erforderlich ist, dann sollte eine weitere Differenzierung vorgenommen werden. Signalisierungsereignisse können auf Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zelle, unabhängig von nachfolgenden engulfment abhängen, oder Phagozytose, unabhängig von dem spezifischen Rezeptor, der die apoptotische Zelle bindet<html> 3-7,9,10,19. Im letzteren Fall ist die Antwort auf apoptotischen Zellen nicht spezifisch, und kann von jedem Material phagozytischen 4,6 ausgelöst werden. Die Bedeutung dieser Unterscheidung kann wiederum durch kontras die Antworten von Makrophagen und Nieren ptecs geschätzt. Für beide Zelltypen, Exposition gegenüber apoptotischen Zellen verändert die Aktivität des Pro-Überleben kinase Akt. Die Modulation ist abhängig von physikalischen Wechselwirkung, da die Trennung von Reaktion und apoptotischen Zellen durch eine 0,4 um Polycarbonatmembran hebt die Antwort 4,9,10,19. Jedoch ist die Reaktion von ptecs rezeptorvermittelten und unabhängig von Phagocytose, während die Reaktion der Makrophagen durch Phagozytose 4,9,10,19 angetrieben wird. Diese Schlussfolgerung wird durch die Tatsache verstärkt , dass die Exposition gegenLatexKügelchen, einem neutralen phagozytischen Reiz, keine Auswirkungen auf die Akt - Aktivität in ptecs hat, sondern ahmt die Wirkung von apoptotischen Zellen in Makrophagen 4,9. &quot;&gt; Obwohl weniger gut untersucht, sterbende Zellen durch Nekrose oder zufälligen Zelltod 1, modulieren auch die Funktion der lebensfähigen Zellen in der Nähe 3-10,19. Wie apoptotischen Zellen, nekrotische Zellen üben ihre Wirkungen durch eine Vielzahl von Mechanismen, insbesondere der Leckage der intrazellulären Inhalte durch ihre geplatzten Zellmembran 3,5,6,9,24. Viele Zellen, einschließlich ptecs und Makrophagen besitzen ausgeprägte nicht-konkurrierende Rezeptoren für durch Nekrose 5,9 sterbende Zellen. Verpflichtungs dieser Rezeptoren signal~~POS=TRUNC induziert, die durch den Eingriff der Rezeptoren für apoptotische Zellen zu denen häufig entgegengesetzte 4-10,19 induziert , z. B. in ptecs erhöhen nekrotischen Zellen die Phosphorylierung von Akt, während apoptotischen Zellen Phosphorylierung 9,10,19 verringern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignisse induziert in lebensfähige Niere ptecs durch Rezeptor-vermittelte Erkennung von benachbarten apoptotischen ptecs <sup&gt; 9,10,19. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierte Zellinie PTEC bekannt als BU.MPT Zellen 9,10,19,25,26 spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien , die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen nicht-epithelialen sind als die Niere. Wichtig ist, stellt die Verwendung von apoptotischen Zellen als Zell Reiz bestimmte inhärente experimentellen Schwierigkeiten nicht vorhanden mit löslichen Liganden. Der wichtigste davon ist, dass apoptotische Zellen als Suspension zugegeben werden müssen und nicht als eine Lösung. Diese Schwierigkeiten, sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Fast alle der in dem Protokoll beschriebenen Techniken sind einfach und Standard-Zellkultur. Der Vorteil dieses Protokolls liegt in seiner Aufmerksamkeit auf die mehrere Mechanismen, durch die apoptotischen Zellen Signaltransduktion innerhalb reagierenden Zellen modulieren. Diese Mechanismen schließen die Bindung über Oberflächendeterminanten oder Brückenmoleküle an spezifische Rezeptoren auf der Wiederchenden Zelle, die Freisetzung von löslichen Mediatoren und / oder der Eingriff der phagozytischen Maschinen. Nekrotische Zellen werden in allen Experimenten eingeschlossen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse sind spezifisch für die Art des Zelltods, und nicht eine verallgemeinerte Reaktion auf tote Zellen. Eine sorgfältige Ansatz, wie in diesem Protokoll empfohlen, ist von entscheidender Bedeutung für unser Verständnis von der stetig wachsenden Einfluss, den sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in Gesundheit und Krankheit.

<table><tbody><tr><td>Zellkulturmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1x mit [4,5 g/L] Glukose, &#671;-Glutamin & Natrium-Pyruvat</td><td>Mediatech (Manassas, VA)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Clone II, fetales Rinderserum</td><td>GE Healthcare (Logan, UT)</td><td>SH30066.03</td><td>10% (v/v)&nbsp; zum Kulturmedium hinzufügen Ein</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamin, 100x</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>10378-016</td><td>100 Einheiten/ml zu den Nährmedien A und B</td></tr><tr><td>&gamma hinzufügen;-Interferon, Maus rekombinant, aus Escherichia coli</td><td>Calbiochem, Millipore (Billerica, MA)</td><td>407303</td><td>10 Einheiten/ml zum Kulturmedium hinzufügen A</td></tr><tr><td>Falcon Polystyrol-Gewebekulturschalen, pyrogenfreies</td><td>Corning (Durham, NC)</td><td>353003</td><td>steril, </td></tr><tr><td>Falcon Zentrifugenröhrchen aus Polystyrol</td> mit 100 mm Durchmesser, konischer <td>Boden Corning (Durham, NC)</td><td>352095</td><td>steril, 15 mL</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,05%, Gibco</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td>25300062</td><td>steril, 100</td></tr> <tr><td>mLName</td><td><>Company</td><td>Katalog</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Chemicals and inhibitors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staurosporin, aus Streptomyces sp.</td><td>Sigma (St. Louis, MO)</td><td>S4400</td><td>bei [1 &mu; g/ml] für 3 h zur Induktion der Apoptose</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), [1 mg/ml]</td><td>Millipore (Billerica, MA)</td><td>EA140</td><td>bei 50 nM zur Stimulation von Responder-Zellen</td></tr><tr><td>UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>15575-038</td><td>5 mM zur Ablösung anhaftender Zellen</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4%</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>91691049</td><td>zur Färbung</td></tr> <tr><td>toter ZellenParaformaldehydlösung, 4% in DPBS</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA)</td><td>19943</td><td>verwenden Sie 0,4% (v/v) in 1x DPBS für die Zellfixierung</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), 1x, Gibco</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>14040133</td><td>Stammlösung</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), Ca2+- und Mg2+-frei, 1x, Gibco</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>14190367</td><td>Stammlösung</td></tr><tr><td>Cytochalasin D, 4 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO), aus Zygosporium mansonii</td><td>Sigma (St. Louis, MO)</td><td>C8273</td><td>Anwendung bei [4 &mu; g/mL] zur Hemmung der Phagozytose</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma (St. Louis, MO)</td><td>D2650</td><td>Lösungsmittel für Cytochalasin D</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Cell lysis buffer ingredients</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered salz (TBS), 10x, pH 7,4</td><td>BioRad (Hercules, CA)</td><td>1706435</td><td>für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Natriumpyrophosphat</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>221368</td><td>10 mM für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>D6750</td><td>0,5 % w/v für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>L3771</td><td>0,1 % w/v für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>G5516</td><td>10% für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>450022</td><td>25 mM für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Komplette Mini-EDTA-freie Proteasehemmer-Cocktailtablette</td><td>Roche Diagnostics (Indianapolis, IN)</td><td>4693159001</td><td>für Zelllysepuffer, 1 Tablette pro 10 ml Puffer</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>T8787</td><td>10% für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>11DTT00005</td><td>1 mM für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>4800263</td><td>1 mM für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Natriumorthovandate</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>2159664</td><td>10 mM für Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalog</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T6000B Zentrifuge</td><td>Du Pont (Wilmington, DE)</td><td>T6000B</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissuemat, Wasserbad</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator (Ultraschallgerät), Modell 100</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Verschiedenes</stark></td>Zellzählkammer, Neubauer Hawksley (Lancing, Sussex, UK)AC2000 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II Millipore (Billerica, MA)CBA059 für PI- und Annexin V-Färbung <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>zur Bestimmung des Stadiums der Apoptose</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikrozentrierröhrchen, 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeable Halterung, 0,4 &mu; m Polycarbonat-Membran</td><td>Corning (Corning, NY)</td><td>3413</td><td>steril, Polystyrol, Gewebekultur behandelt</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>>Katalog</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphoglykogensynthase-Kinase-3&alpha;/&beta; (GSK-3&alpha;/&beta;) (Ser21/9), polyklonaler Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9331</td><td>polyklonaler Kaninchen-Antikörper</td></tr><tr><td>Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) monoklonaler Antokörper ( (14C10) )</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118</td><td>monoklonaler Kaninchen-Antikörper</td></tr></tbody></table>

identifizierung von intrazellulärer induzierte in lebenden zellen durch interaktion signalisierung mit benachbarte zellen, die eine programmierten zelltods

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Die Zellen durch Apoptose sterben, auch bezeichnet als regulierte Zelltod, mehrere neue Aktivitäten zu erwerben, die es ihnen ermöglichen, die Funktion von benachbarten lebenden Zellen zu beeinflussen. Vitale Aktivitäten, wie das Überleben, die Proliferation, das Wachstum und die Differenzierung, gehören zu den vielen Zellfunktionen durch apoptotische Zellen moduliert. Die Fähigkeit, apoptotische Zellen zu erkennen und zu reagieren scheint ein universelles Merkmal aller Zellen zu sein, unabhängig von Lineage oder Organ des Ursprungs. Allerdings ist die Vielfalt und Komplexität der Reaktion auf apoptotischen Zellen vor, dass große Sorgfalt, die für ein bestimmtes Ergebnis in sezieren die Signalereignisse und Wege genommen werden. Insbesondere muß man unter den mehreren Mechanismen unterscheiden, durch die apoptotischen Zellen intrazelluläre Signalwege innerhalb tragfähige Responderzellen beeinflussen können, einschließlich: Rezeptor-vermittelte Erkennung der apoptotischen Zellen, die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch die apoptotische Zelle und / oder Eingriff der phagocytic Maschinen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung von intrazellulären Signalereignissen, die lebensfähige Responderzellen nach ihrer Exposition gegenüber apoptotischen Zellen induziert werden. Ein Hauptvorteil des Protokolls liegt in der Aufmerksamkeit es Dissektion des Mechanismus zahlt, durch die apoptotischen Zellen Ereignisse innerhalb reagiert Zellen modulieren signalisiert. Während das Protokoll für eine konditional immortalisierten Mausniere proximalen röhrenförmigen Zelllinie (BU.MPT Zellen) spezifisch ist, ist es leicht zu Zelllinien, die angepasst Ursprungs und / oder abgeleitet von anderen Organen als der Niere nicht-epithelialen sind. Die Verwendung von toten Zellen als Stimulus stellt einige einzigartige Faktoren, die den Nachweis von intrazellulären Signalereignisse behindern. Diese Probleme sowie Strategien zu minimieren oder zu umgehen, sie werden innerhalb des Protokolls erörtert. Die Anwendung dieses Protokolls sollte unsere wachsenden Wissen der breiten Einfluss unterstützen, die toten oder sterbenden Zellen auf ihre Live-Nachbarn ausüben, sowohl in den Bereichen Gesundheit und in disease.

In Abbildung 1 stellen wir eine schematische Darstellung der Timing- und kritischen Schritte bei der Herstellung von apoptotischen Zellen beteiligt (Protokoll 1) und nekrotischen Zellen (Protokoll 2) und die Stimulation von Responderzellen mit Suspensionen von apoptotischen und nekrotischen Zellen (Protokoll 4). In Figur 2 stellen wir repräsentative Ergebnisse , die Wirkung von apoptotischen Z...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung intrazellulärer Signalereignisse, die in lebensfähigen Zellen durch physikalische Interaktion mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert werden. Das Protokoll konzentriert sich auf Signalereignisse, die durch Rezeptor-vermittelte Erkennung der toten Zellen induziert werden, im Gegensatz zu ihrer phagozytären Aufnahme oder Freisetzung löslicher Mediatoren.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, durch Signalereignisse induzierte und lebensfähige Responderzellen nach ihrer physikalischen Interaktion mit benachbarten toten Zellen zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Zellbiologie, Pathologie und Physiologie zu beantworten, wie z.B. den Einfluss, den tote oder sterbende Zellen auf ihre lebenden Nachbarn ausüben. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie unkompliziert und kostengünstig ist und dass sie zur Untersuchung biologischer Wirkungen angewendet werden kann, die in lebenden Zellen nach ihrer Interaktion mit benachbarten Zellen, die sich in der Apoptose befinden, induziert werden.Die Technik wird von Lanfei Feng, einem Techniker in meinem Labor, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, nachdem die BUNPT-Zellen in 100-Millimeter-Vakuum-Gasplasma-behandelte Gewebekulturschalen übergeben wurden, züchten Sie sie in Kulturmedium A bis zur Konfluenz und befeuchteten 5%igen Kohlendioxidatmosphäre bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie danach die adhärente Zellmonoschicht dreimal mit Kulturmedium B. Induzieren Sie dann Apoptose, indem Sie die Zellen in Kulturmedium B, das Staurosporin, einen nichtselektiven Proteinkinase-Inhibitor, enthält, 3 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nach 3 Stunden wird das Medium mit schwimmenden apoptotischen Zellen gesammelt, die sich von der Monoschicht gelöst haben. Anschließend zentrifugieren Sie dieses Medium zehn Minuten lang bei 500 mal G. Danach verwerfen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet dreimal mit Kulturmedium B, bevor Sie es wieder den anhaftenden Zellen zuführen. Nach diesem Waschschritt lösen Sie die verbleibenden adhärenten Zellen ab, indem Sie 5 millimolare EDTA in 1X calcium- und magnesiumfreiem DPBS hinzufügen.Sammeln Sie das Medium, das abgelöste apoptotische Zellen enthält, und geben Sie die abgelösten Zellen mit den schwimmenden apoptotischen Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Polystyrol. Dann waschen Sie die apoptotischen Zellen dreimal durch Zentrifugation für zehn Minuten bei 500 x G, gefolgt von einer Resuspension in zehn Millilitern von 1X calcium- und magnesiumfreiem DPBS pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche suspendieren Sie die apoptotischen Zellen in frischem Kulturmedium B bei 5x10^6 Zellen pro Milliliter, bevor Sie sie zur Stimulation der Responder-Zellen verwenden.Alternativ fixieren Sie die gewaschenen apoptotischen Zellen 30 Minuten lang in 0,4 Paraformaldehyd in 1X DPBS, waschen Sie sie dann dreimal mit Kulturmedium B und suspendieren Sie sie darin bei 5x10^6 Zellen pro Milliliter, bevor Sie sie zur Stimulation der Responderzellen verwenden. Nachdem Sie die BUNPT-Zellen auf sterile Polystyrol-Vakuum-Gasplasma-behandelte Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern übergeben haben, züchten Sie sie unter permissiven Bedingungen zu einer konfluenten und befeuchteten 5%igen Kohlendioxidatmosphäre. Spülen Sie dann die adhärente Zellmonoschicht dreimal mit 10 mL Kulturmedium B pro Spülgang aus.Anschließend lösen Sie die Zellen ab, indem Sie 5 mM EDTA in 1X calcium- und magnesiumfreiem DPBS hinzufügen. Sammeln Sie die abgelösten Zellen aus dem EDTA-haltigen Medium und geben Sie die Zellsuspension in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polystyrol. Waschen Sie anschließend die Zellen dreimal durch Zentrifugation für zehn Minuten bei 500-fachem G und resuspension in 10 ml kalzium- und magnesiumfreiem DPBS pro Waschgang.Nach der letzten Wäsche werden die Zellen in frischem Kulturmedium B bei 5x10^6 Zellen pro Milliliter suspendiert. Induzieren Sie anschließend eine Nekrose, indem Sie die Zellen 45 Minuten lang in einem Wasserbad auf 70 Grad Celsius erhitzen und diese Zellsuspension alle zehn Minuten sanft vortexen. Nach der Induktion der Nekrose inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius und wirbeln Sie die Zellsuspension alle 15 Minuten vorsichtig ein.Bei diesem Verfahren werden die BUNPT-Zellen in sterilen 100-Millimeter-Gewebekulturschalen unter freizügigen Bedingungen gezüchtet, bis sie eine Konfluenz von etwa 85 % erreichen. Anschließend wird Kulturmedium A aspiriert und die Zellen dreimal mit 10 mL Kulturmedium B pro Spülgang gespült. Anschließend lässt das Serum die Zellen 18 bis 24 Stunden lang in einer befeuchteten 5%igen Kohlendioxidatmosphäre unter nicht-permissiven Bedingungen im Serum hungern, um Ruhe zu induzieren.Markieren Sie eine separate Gewebekulturschale mit konfluenten BUNPT-Zellen für die sechs experimentellen Bedingungen für das nächste Verfahren. Aspirieren Sie nun Kulturmedium B aus den vormarkierten Schalen von ruhenden BUNPT-Responderzellen. Um die 100-Millimeter-Schalen unter verschiedenen Bedingungen zuzubereiten, fügen Sie zwei ml eines der beiden Kulturmedien B ohne Zellen, die apoptotische Zellsuspension bei 5X10^6 Zellen pro Milliliter in Kulturmedium B oder die nekrotische Zellsuspension bei 5X10^6 Zellen pro ml in Kulturmedium B hinzu. Erreichen Sie ein Verhältnis von toten zu Responderzellen von eins zu eins, indem Sie zu ml toter Zellen bei 5X10^6 Zellen pro Milliliter zu einem konfluente 100-Millimeter-Schale, die 10X10^6 Zellen enthält.Schwenken Sie das Geschirr vorsichtig. Dann werden sie bei 37 Grad Celsius in der befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nach 30 Minuten stimulieren Sie die Responderzellen entweder mit Vehikel oder 15 nMOL EGF, entsprechend der Vormarkierung der Kulturschale.Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie anschließend die abgestorbenen Zellen weg, indem Sie fünf Millimeter eiskaltes DPBS hinzufügen. Schwenken Sie die Schüssel und saugen Sie die Waschflüssigkeit an.Wiederholen Sie den Waschgang dreimal. Legen Sie dann sofort die Responder-Zellschalen zur weiteren Verarbeitung auf Eis. Diese Abbildung zeigt, dass die Exposition von ruhenden BUNPT-Respondern gegenüber apoptotischen Zellen für 30 Minuten die basale Phosphorylierung von GSK3 alpha beta stark hemmte.Um eine physikalische Interaktion zwischen BUNPT-Respondern und apoptotischen Zellen zu verhindern, wurden BUNPT-Responder in einem permeablen Stützsystem gezüchtet und durch eine 0,4-Mikron-Polycarbonatmembran von den apoptotischen Zielen getrennt. Die Verhinderung der physikalischen Interaktion zwischen BUNPT-Respondern und apoptotischen Zellen hob die Fähigkeit apoptotischer Ziele auf, die Phosphorylierung von GSK3 alpha beta zu hemmen. Um die Rolle der Phagozytose zu bewerten, wurde der Zytoskelett-Inhibitor Cytochalasin D verwendet, um die phagozytäre Aufnahme abgestorbener Zellen zu verhindern.Die Hemmung der Phosphorylierung von GSK3 alpha beta als Reaktion auf apoptotische Zellen erfolgte in Abwesenheit von Phagozytose. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 4-6 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, ohne die Zeit, die für die Gelelektrophorese und das Immunblotting erforderlich ist. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Verwendung einer zellulären Suspension im Gegensatz zu einem löslichen Liganden als Stimulus mehrere inhärente und weitgehend unvermeidbare experimentelle Hindernisse mit sich bringt.Mit dem gleichen Verfahren kann man andere Zellfunktionen untersuchen, wie z.B. das Überleben oder die Proliferation oder das Zellwachstum, um die funktionellen Konsequenzen der Signalereignisse zu bestimmen, die in lebenden reagierenden Zellen nach ihrer Interaktion mit benachbarten toten Zellen induziert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie spezifische Signalereignisse identifizieren können, die in lebensfähigen Responderzellen nach ihrer physischen Interaktion mit nahe gelegenen toten Zellen induziert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

Der Begriff Anastase bezieht sich auf das Phänomen, bei dem sterbende Zellen einen Zellselbstmordprozess in einem späten Stadium rückgängig machen, sich selbst reparieren und schließlich überleben. Hier demonstrieren wir Protokolle zum Nachweis und zur Verfolgung von Zellen, die einer Anastasierung unterzogen werden.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Ein Workflow mit Flow Cytometry oder Differential Zentrifugation wurde entwickelt, um erkennen, zu quantifizieren und isolieren Apoptotic Körper aus einem Apoptotic Probe zu hoher Reinheit.

Nachweis und Isolierung von apoptotischen stellen hohe Reinheit

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Zytotoxizität von pre-activated CD8 untersuchen+ T-Zellen gegen Krebszellen durch das Erkennen von apoptotischen Krebs Zellen über Echtzeit-Mikroskopie. Dieses Protokoll kann Mechanismen hinter myeloische Zellen-induzierte T-Zell-Unterdrückung untersuchen und zu bewerten Verbindungen auffüllen T Zellen durch Blockade von Immunzellen suppressive myeloische abzielen.

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung von apoptotischen Thymozyten und peritonealen Makrophagen vor und analysieren die Effizienz der Eskrozytose und die spezifische hemmungsvermittelte Blockierung apoptotischer Thymozyten-Verengungen. Dieses Protokoll hat eine breite Anwendung in der zellvermittelten Räumung anderer Partikel, einschließlich künstlicher Perlen und Bakterien.

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Die Apoptose kann durch die durchflusszytometrische Analyse früher und später apoptotischer Biomarker charakterisiert werden. Die Zelllinie des Gebärmutterhalskrebses, SiHa, wurde nach Behandlung mit Actinomycin D mit einem Benchtop-Durchflusszytometer auf Apoptose-Biomarker untersucht.

Durchflusszytometrische Analyse von apoptotischen Biomarkern in Actinomycin-D-behandelten SiHa-Gebärmutterhalskrebszellen

Ein Verfahren für die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) über Retrovirus-vermittelte ektopische Expression von Oct4 generieren, wird Sox2, Klf4 und MYC beschrieben. Ein praktischer Weg, um menschliche iPSC Kolonien auf GFP-Expression zu identifizieren Basis wird ebenfalls diskutiert.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Erfahren Sie, wie intrazelluläre Signalereignisse in lebenden Zellen nach Interaktion mit apoptotischen Nachbarzellen identifiziert werden. Diese kostengünstige Methode nutzt BUNPT-Zellen und Staurosporin-induzierte Apoptose.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods (Video) | JoVE Journal

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

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