Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, durch Signalereignisse induzierte und lebensfähige Responderzellen nach ihrer physikalischen Interaktion mit benachbarten toten Zellen zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Zellbiologie, Pathologie und Physiologie zu beantworten, wie z.B. den Einfluss, den tote oder sterbende Zellen auf ihre lebenden Nachbarn ausüben. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie unkompliziert und kostengünstig ist und dass sie zur Untersuchung biologischer Wirkungen angewendet werden kann, die in lebenden Zellen nach ihrer Interaktion mit benachbarten Zellen, die sich in der Apoptose befinden, induziert werden.

Die Technik wird von Lanfei Feng, einem Techniker in meinem Labor, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, nachdem die BUNPT-Zellen in 100-Millimeter-Vakuum-Gasplasma-behandelte Gewebekulturschalen übergeben wurden, züchten Sie sie in Kulturmedium A bis zur Konfluenz und befeuchteten 5%igen Kohlendioxidatmosphäre bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie danach die adhärente Zellmonoschicht dreimal mit Kulturmedium B. Induzieren Sie dann Apoptose, indem Sie die Zellen in Kulturmedium B, das Staurosporin, einen nichtselektiven Proteinkinase-Inhibitor, enthält, 3 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach 3 Stunden wird das Medium mit schwimmenden apoptotischen Zellen gesammelt, die sich von der Monoschicht gelöst haben. Anschließend zentrifugieren Sie dieses Medium zehn Minuten lang bei 500 mal G. Danach verwerfen Sie den Überstand, waschen Sie das Pellet dreimal mit Kulturmedium B, bevor Sie es wieder den anhaftenden Zellen zuführen. Nach diesem Waschschritt lösen Sie die verbleibenden adhärenten Zellen ab, indem Sie 5 millimolare EDTA in 1X calcium- und magnesiumfreiem DPBS hinzufügen.

Sammeln Sie das Medium, das abgelöste apoptotische Zellen enthält, und geben Sie die abgelösten Zellen mit den schwimmenden apoptotischen Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Polystyrol. Dann waschen Sie die apoptotischen Zellen dreimal durch Zentrifugation für zehn Minuten bei 500 x G, gefolgt von einer Resuspension in zehn Millilitern von 1X calcium- und magnesiumfreiem DPBS pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche suspendieren Sie die apoptotischen Zellen in frischem Kulturmedium B bei 5x10^6 Zellen pro Milliliter, bevor Sie sie zur Stimulation der Responder-Zellen verwenden.

Alternativ fixieren Sie die gewaschenen apoptotischen Zellen 30 Minuten lang in 0,4 Paraformaldehyd in 1X DPBS, waschen Sie sie dann dreimal mit Kulturmedium B und suspendieren Sie sie darin bei 5x10^6 Zellen pro Milliliter, bevor Sie sie zur Stimulation der Responderzellen verwenden. Nachdem Sie die BUNPT-Zellen auf sterile Polystyrol-Vakuum-Gasplasma-behandelte Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 100 Millimetern übergeben haben, züchten Sie sie unter permissiven Bedingungen zu einer konfluenten und befeuchteten 5%igen Kohlendioxidatmosphäre. Spülen Sie dann die adhärente Zellmonoschicht dreimal mit 10 mL Kulturmedium B pro Spülgang aus.

Anschließend lösen Sie die Zellen ab, indem Sie 5 mM EDTA in 1X calcium- und magnesiumfreiem DPBS hinzufügen. Sammeln Sie die abgelösten Zellen aus dem EDTA-haltigen Medium und geben Sie die Zellsuspension in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polystyrol. Waschen Sie anschließend die Zellen dreimal durch Zentrifugation für zehn Minuten bei 500-fachem G und resuspension in 10 ml kalzium- und magnesiumfreiem DPBS pro Waschgang.

Nach der letzten Wäsche werden die Zellen in frischem Kulturmedium B bei 5x10^6 Zellen pro Milliliter suspendiert. Induzieren Sie anschließend eine Nekrose, indem Sie die Zellen 45 Minuten lang in einem Wasserbad auf 70 Grad Celsius erhitzen und diese Zellsuspension alle zehn Minuten sanft vortexen. Nach der Induktion der Nekrose inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius und wirbeln Sie die Zellsuspension alle 15 Minuten vorsichtig ein.

Bei diesem Verfahren werden die BUNPT-Zellen in sterilen 100-Millimeter-Gewebekulturschalen unter freizügigen Bedingungen gezüchtet, bis sie eine Konfluenz von etwa 85 % erreichen. Anschließend wird Kulturmedium A aspiriert und die Zellen dreimal mit 10 mL Kulturmedium B pro Spülgang gespült. Anschließend lässt das Serum die Zellen 18 bis 24 Stunden lang in einer befeuchteten 5%igen Kohlendioxidatmosphäre unter nicht-permissiven Bedingungen im Serum hungern, um Ruhe zu induzieren.

Markieren Sie eine separate Gewebekulturschale mit konfluenten BUNPT-Zellen für die sechs experimentellen Bedingungen für das nächste Verfahren. Aspirieren Sie nun Kulturmedium B aus den vormarkierten Schalen von ruhenden BUNPT-Responderzellen. Um die 100-Millimeter-Schalen unter verschiedenen Bedingungen zuzubereiten, fügen Sie zwei ml eines der beiden Kulturmedien B ohne Zellen, die apoptotische Zellsuspension bei 5X10^6 Zellen pro Milliliter in Kulturmedium B oder die nekrotische Zellsuspension bei 5X10^6 Zellen pro ml in Kulturmedium B hinzu. Erreichen Sie ein Verhältnis von toten zu Responderzellen von eins zu eins, indem Sie zu ml toter Zellen bei 5X10^6 Zellen pro Milliliter zu einem konfluente 100-Millimeter-Schale, die 10X10^6 Zellen enthält.

Schwenken Sie das Geschirr vorsichtig. Dann werden sie bei 37 Grad Celsius in der befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nach 30 Minuten stimulieren Sie die Responderzellen entweder mit Vehikel oder 15 nMOL EGF, entsprechend der Vormarkierung der Kulturschale.

Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie anschließend die abgestorbenen Zellen weg, indem Sie fünf Millimeter eiskaltes DPBS hinzufügen. Schwenken Sie die Schüssel und saugen Sie die Waschflüssigkeit an.

Wiederholen Sie den Waschgang dreimal. Legen Sie dann sofort die Responder-Zellschalen zur weiteren Verarbeitung auf Eis. Diese Abbildung zeigt, dass die Exposition von ruhenden BUNPT-Respondern gegenüber apoptotischen Zellen für 30 Minuten die basale Phosphorylierung von GSK3 alpha beta stark hemmte.

Um eine physikalische Interaktion zwischen BUNPT-Respondern und apoptotischen Zellen zu verhindern, wurden BUNPT-Responder in einem permeablen Stützsystem gezüchtet und durch eine 0,4-Mikron-Polycarbonatmembran von den apoptotischen Zielen getrennt. Die Verhinderung der physikalischen Interaktion zwischen BUNPT-Respondern und apoptotischen Zellen hob die Fähigkeit apoptotischer Ziele auf, die Phosphorylierung von GSK3 alpha beta zu hemmen. Um die Rolle der Phagozytose zu bewerten, wurde der Zytoskelett-Inhibitor Cytochalasin D verwendet, um die phagozytäre Aufnahme abgestorbener Zellen zu verhindern.

Die Hemmung der Phosphorylierung von GSK3 alpha beta als Reaktion auf apoptotische Zellen erfolgte in Abwesenheit von Phagozytose. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 4-6 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, ohne die Zeit, die für die Gelelektrophorese und das Immunblotting erforderlich ist. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Verwendung einer zellulären Suspension im Gegensatz zu einem löslichen Liganden als Stimulus mehrere inhärente und weitgehend unvermeidbare experimentelle Hindernisse mit sich bringt.

Mit dem gleichen Verfahren kann man andere Zellfunktionen untersuchen, wie z.B. das Überleben oder die Proliferation oder das Zellwachstum, um die funktionellen Konsequenzen der Signalereignisse zu bestimmen, die in lebenden reagierenden Zellen nach ihrer Interaktion mit benachbarten toten Zellen induziert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie spezifische Signalereignisse identifizieren können, die in lebensfähigen Responderzellen nach ihrer physischen Interaktion mit nahe gelegenen toten Zellen induziert werden.