Name: Ein Tissue Displacement-basierte Contusive Spinal Cord Verletzung Modell in Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Lernen Sie ein gewebeverdrängungsbasiertes kontusives Rückenmarksverletzungsmodell bei erwachsenen Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Verletzungen zur Untersuchung von Schadensmechanismen und Therapien.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562 unterstützt; Merit Review Award I01 BX002356 aus dem US Department of Veterans Affairs; Craig H Neilsen Stiftung 296749; Indiana-Rückenmark und Hirnverletzung Forschungsstiftung und Mari Hulman George Endowment Funds (XMX); Norton Healthcare, Louisville, KY (YPZ); Der Staat Indiana ISDH 13679 (XW); Und die NeuroCures-Stiftung.

Alle chirurgischen und tierischen Handhabungsverfahren wurden nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council) und den Richtlinien der Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt. 1. Vorbereitung des Tieres und Durchführung der T10 Wirbelsäule Laminektomie <ol><li> Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente und den Metall-Wirbelsäulen-Stabilisator in einem Autoklaven. Den chirurgischen Operationstisch reinigen. Warm ein Heizkissen auf 37 ° C. Legen Sie den Heizkissen auf den Operationstisch und decken Sie ihn mit sterilen chirurgischen Vorhängen ab. Verwenden Sie sterile Technik während des gesamten Betriebs. </li><li> Verwenden Sie weibliche junge erwachsene C57 / 6J Mäuse bei 10 Wochen alt für diese Studie. Anästhesieren Sie jedes Tier mit einer intraperitonealen (ip) Injektion eines Ketamins (87,7 mg / kg) und Xylazin (12,3 mg / kg) Mischung. Bestätigen Sie die vollständige Anästhesie, indem Sie keine Antwort auf eine Paw-Pinch-induzierte Nozizeptionsstimulation auslösen. </stro<html> Ng&gt; <ol><li> Subkutane Verabreichung von Buprenorphin (0,01-0,05 mg / kg), einem Analgetikum und Carprofen (5 mg / kg), einem nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneimittel. </li></ol></li><li> Rasieren Sie die Haare über die Thorakolumbar Wirbelsäule mit einem elektrischen Clipper. Schrubben Sie die Haut mit Betadin-Lösung und 70% Alkoholtücher. </li><li> Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Hornhaut, um die Augen vor dem Trocknen während der Operation zu schützen. </li><li> Mit einem Skalpell, machen Sie eine 1,5 cm Mittellinie Hautinzision auf der Rückseite des Tieres, um die 9. bis 11. thoracic vertebral laminae. Schieben Sie das subkutane Fettgewebe rostrisch. Die paraspinalen Muskeln von den Dornfortsätzen und den Laminae zerlegen, in Richtung der seitlichen Facetten auf jeder Seite. </li><li> Positionieren Sie die Maus auf den U-förmigen Trog des Stabilisators (Abbildung 2A Und 2B ). Die rostfreien Stahlarme unter den sichtbaren Facetten des T10-Wirbels (G &quot;&gt; Abbildung 4A) und mit den an den Armen befestigten Rändelschrauben festziehen ( Abbildung 2A ). </li><li> Entfernen Sie den T10-Dornfortsatz und Lamina (Laminektomie) mit einem Mikro-Rongeur, der die Dura mater über dem Rückenmark aufdeckt (Abbildung 4B ). </li></ol> 2. Durchführen der T10-Kontusionsverletzung mit dem LISA-Impaktor <ol><li> Drehen Sie den Knopf des Druckreglers auf den Stickstofftank, um den komprimierten Stickstoff auf 20 PSI oder 138 kPa (Abbildung 1A ) für diese Studie einzustellen. HINWEIS: Der Druck ist von 10-120 PSI einstellbar. Ein höherer Druck führt zu einem höheren Aufprall. Die SCI-Gerätespitze mit einem Durchmesser von 1,2 mm ist für Mäuse ausgelegt und die Spitze mit einem Durchmesser von 2,2 mm ist für Ratten ausgelegt. Beim Wechsel von Mäusen zu Ratten kann die Spitze des größeren Durchmessers durch Zugabe eines Ringes zur Metallspitze (id 1,2 mm / od 2,2 mm) gebildet werden. Wir verwendeten die 1,2 mm Spitze in diesem Mäuse SCI sTudy Sterilisieren Sie die SCI-Spitze vor Gebrauch. </li><li> Schalten Sie den Computer ein, um die Software zu starten. Drücken Sie die Taste 1 ( Abbildung 1B ), um die Impaktorspitze in eine vollständig ausgefahrene Position zu aktivieren ( Abbildung 3A -1 ). HINWEIS: Die Funktion von Taste 1 besteht darin, den Pneumatikzylinder manuell zu aktivieren oder zu deaktivieren. </li><li> Legen Sie den U-förmigen Behälter mit der Maus auf die Bühne (Abbildung 2B ). Befestigen Sie die Bühne durch Anziehen der Rändelschrauben der Halterung (Abbildung 2B ). </li><li> Stellen Sie unter der Ziffer &quot;SET ZERO LEVEL&quot; (grün) den Nullpunkt ein, mit einem Lasersensor, der den Abstand zur vollständig ausgedehnten Kolbenspitze misst, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;START READING&quot; klicken (Abbildung 3A ). Der Abstand wird im Parameter &quot;Range&quot; in dieser Zone angezeigt ( Bild 3A ). Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;SET ZERO&quot; ( zB 8,951 mm, siehe Abbildung 3A ). </li><li> Drücken Sie die Taste 1 (Abbildung 1B ), um die Impaktorspitze zurückzuziehen (Abbildung 3B -1 , angezeigt durch einen oberen Pfeil) und entriegeln Sie die Befestigungsschraube 1 (Abbildung 2B ). Ziehen Sie die Schraube in die richtige Position ( Abb. 3B -1 , angedeutet durch einen seitlichen Pfeil), um die Spitze vom Laserstrahlengang weg zu bewegen und die Schraube um 90 ° im Uhrzeigersinn zu drehen, um die Schraube zu verriegeln. </li><li> Bewegen Sie die Bühne, indem Sie die vorderen und lateralen Mikrotreiber einstellen (Abbildung 1C ), um den Laserstrahl auf die Mitte des exponierten Rückenmarks zu richten. Nachdem die Verletzungsstelle gezielt ist, messen Sie die Gewebeabstand, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;START READING&quot; unter &quot;SET INJURY L&quot; klickenEVEL &quot;-Zone (blau) ( Fig. 3B und 3B-1 ). </li><li> Langsam den Abstand zwischen dem Sensor und dem Rückenmark über den senkrechten Mikrotreiber einstellen ( Bild 1C ), um den gewünschten Verschiebungsparameter ( zB 0,500 mm, im Feld &quot;Verletzung&quot;) in der Zone &quot;SET INJURY LEVEL&quot; zu erreichen (Blau) ( Fig. 3B ). <ol><li> Wenn die gewünschte Verletzungsverlagerung erreicht ist, notieren Sie den Gewebeabstand ( zB 8,451 mm, im Parameterbereich &quot;Bereich&quot;) (Abbildung 3B ). Definieren Sie die gewünschte Verschiebung (Verletzung) = Spitzenabstand (Nullpunkt) - Gewebeabstand (Bereich) (Abbildung 3B ). Wenn die gewünschte Verletzung ( z. B. 0,500 mm Gewebeverschiebung) erreicht ist (Abbildung 3B ), klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;SET INJURY&quot; unter der Zone &quot;SET INJURY LEVEL&quot;Legen Sie die Verletzung. </li></ol></li><li> Drehen Sie die Schraube 1 90 ° gegen den Uhrzeigersinn, um die Schraube zu entriegeln, schieben Sie die Aufprallspitze wieder in die Laserstrahltrajektorie (Abbildung 3C -1 , Richtung, die durch einen Pfeil angezeigt wird) und verriegeln Sie die Schraube 1, indem Sie sie um 90 ° im Uhrzeigersinn drehen. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen unter der roten Zone &quot;RUN EXPERIMENT&quot; (Abbildung 3C ), um die Auswirkung auszuführen. Die Parameterboxen unter dieser Zone zeigen die Verletzungszeit (en), die Kraft (mV), die Geschwindigkeit (m / s) und die Verletzungsverschiebung (mm) (Abbildung 3C ). </li><li> Nachdem alle Verletzungsdaten aufgezeichnet und gespeichert sind, entfernen Sie den U-förmigen Trog mit der Maus von der Bühne. Überprüfen Sie die Rückenmarksverletzung unter einem Operationsmikroskop (Abbildung 4C ). </li><li> Naht die paravertebralen Muskeln, oberflächliche Faszie und Haut mit kontinuierlicher Naht mit 3-0 Seide (Henry Schein, 776-SK). </li><li> Injizieren thE Tier mit 1 mL 0,9% Kochsalzlösung subkutan zur Hydratation und platziert es auf ein temperaturgesteuertes Pad, bis das volle Bewusstsein wiederhergestellt ist. Legen Sie die Maus in einen Käfig mit zugänglichem Essen und Wasser. </li><li> Für die postoperative Versorgung manuell die Blase ausdrücken, bis die spontane Blase zurückkehrt. Für Analgesie injizieren Buprenorphin (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 h / Tag für 2 Tage. Wenn Harnblaseninfektion auftritt, injizieren Sie Baytril (SQ, 5-10 mg / kg in 0,1 ml, 1 Dosis täglich) für 7-10 Tage. Wenn regionale / systemische Infektion auftritt, injizieren Sie Gentamycin (SQ, 5-8 mg / kg, verdünnt in 1 ml steriler Kochsalzlösung, alle 8-12 h) für 4 Tage. </li><li> Entfernen Sie die Nahtfäden bei 14 Tagen nach dem SCI. </li><li> Am 42. Tag nach der Verletzung werden die Mäuse durch Perfusion geopfert. Nach entsprechender Anästhesie als 1,2 werden sie mit 30 ml (0,01 M) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 30 ml 4% Paraformaldehyd in 0,01 M PBS perfundiert. Ein Zentimeter des Rückenmarks einschließlich der Läsion EposEnter wird gesammelt und verarbeitet für Schnitt und histologische Analyse. </li></ol>

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</ol>

Christopher B. Shields, MD hat das Eigentum an der Louisville Injury System Apparatus (LISA) produziert von Louisville Impactor System, LLC.

Im Jahr 1911 beschrieb Allen das erste Gewichtstropfenmodell mit einem festen Gewicht, um Verletzungen an den exponierten Rückenmarken von Hunden 12 zu induzieren. Ähnliche Gewichtstropfenmodelle wurden auf der Basis des Allen-Modells entwickelt, darunter der NYU / MASCIS-Impaktor 3 , 6 , 13 , 14 . Zusätzlich zum Gewichtstropfenmodell wurden weitere SCI-Geräte erstellt. Das OSU / ESCID 5 , 7- Modell verwendet einen Gewebeverdrängungsmechanismus, um die Verletzungsschwere zu steuern, und das IH-Modell 4 , 8 verwendet Kraft, um ein abgestuftes SCI zu erzeugen. In diesen Systemen wird die Wirbelstabilisierung durch Klemmen der Dornfortsätze rostral und kaudal zur Verletzungsstelle erreicht. Diese Geräte verwenden niedrige Verletzungsgeschwindigkeiten, speziell 0,33 - 0,9 m / s (NYU / MASCIS), 0,148 m / s (OSU / ESCID),Und 0,13 m / s (IH). Die Stabilisierung der rostralen und kaudalen Dornfortsätze kann die Wirbelsäulenflexibilität und die Wirbelsäulenbewegung während des Aufpralls hervorrufen, was die Verletzungsgenauigkeit beeinträchtigen kann. Die LISA-Methode versucht, die Mängel der bestehenden Modelle zu überwinden, insbesondere in Bezug auf die Wirbelsäuleninstabilität und die geringe Verletzungsgeschwindigkeit. Diese Methode verwendet bilaterale Facettenstabilisierung und vermeidet Bewegungsartefakte, die mit der Verletzung verbunden sind. Diese Vorrichtung nutzt eine Hochschlaggeschwindigkeit, die zwischen 0,5-2 m / s 11 , 15 eingestellt werden kann. Der Lasersensor ist weiter vorgerückt als der im ESCID-Modell verwendete Ling-Vibrator und misst präzise den Abstand von der Oberfläche des Rückenmarks, ohne dass ein Gewebekontakt erforderlich ist. Das Modell wurde ursprünglich entwickelt, um ein Ratten-SCI zu produzieren, und es wurde nun angepasst, um SCI auf Mäusen und an nichtmenschlichen Primaten 16 zu produzieren, mit Modifikationen. WirbelsäuleDie Abilisierung verringert die Variabilität bei allen experimentellen SCI-Methoden, insbesondere bei Gewebeverdrängungsmodellen. Der Laserentfernungssensor bestimmt die Größe der Gewebeverdrängung des Rückenmarks bei Atembewegungen. Es ist wichtig, dass der Punkt des Rückenmarks, auf dem der Laser fokussiert ist, der identische Punkt sein sollte, der vom Impaktor getroffen wird. Dieser Schritt wird während des Kalibrierungsschrittes ( Fig. 3 ) durchgeführt, wenn die Impaktorspitze und der Laserstrahl ausgerichtet sind. Eine mögliche Schwäche dieses Modells ist, dass die Größe der Gewebeverdrängung von der Duraloberfläche gemessen wird. Obwohl die Dicke der Dura einen vernachlässigbaren Unterschied zwischen den Tieren darstellt, kann eine signifikante Variabilität im Subarachnoidalraum mit Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) auftreten. Variabilität bei Verletzungsergebnissen kann auftreten, wenn eine sehr milde Kontusionsverletzung unter Verwendung einer kleinen Gewebeverdrängung erzeugt wird. Insgesamt ist die Konsistenz der Verletzung vor allem abhängigAuf die Genauigkeit der Gewebeverdrängung und auch auf die Geschwindigkeits- und Gewebekontaktzeit des Kolbens. Der Bereich der Gewebeverdrängung ist breit (Genauigkeit: 0-10 ± 0,005 mm). Basierend auf früheren Pilotdaten und veröffentlichten Informationen bei Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten ergibt eine Verschiebung von 20% des anteroposterioren Durchmessers des SC ein mildes SCI, eine Verdrängung von 30-40% ergibt eine moderate SCI und eine Verschiebung von&gt; 50% Produziert schwere SCI bei einer Geschwindigkeit von 1 m / s. Es gibt leichte Unterschiede je nach Tierart. Die Verweilzeit ist von 0 bis 5 s über ein Zeitrelais einstellbar. In unserer Studie wurde die Verweilzeit auf 300 ms eingestellt. Dies kann leicht angepasst werden, um die Verweilzeiten anderer SCI-Geräte, einschließlich der NYU- und IH-Modelle, zu replizieren. Zusammenfassend haben wir ein verschiebungsbasiertes Modell von Continuous SCI bei erwachsenen Mäusen entwickelt. Das Modell verwendet einen U-förmigen Stabilisator, um die bilateralen Wirbelsäulenfacetten zu stabilisieren, wodurch die Schnur vermieden wirdBewegungsartefakte, die mit der lasergeführten Messung der Kordoberfläche verbunden sind. Dieses Modell kann Hochgeschwindigkeitsschnurverletzungen von 0,5-2 m / s erzeugen. Der Lasersensor ist genauer als die herkömmliche Methode, um die Geschwindigkeit und den Abstand zur Aufprallfläche zu bestimmen. Das Modell kann auf allen Ebenen Verletzungen des Rückenmarks hervorrufen, von mild bis schwer. Wenn es modifiziert wird, kann dieses Gerät auch Verletzungen bei Ratten und großen Tieren wie nichtmenschlichen Primaten hervorrufen.

Die häufigste Rückenmarksverletzung (SCI), die beim Menschen auftritt, ist ein kontaktiver SCI 1 . Um die Mechanismen der Verletzung und die verschiedenen therapeutischen Strategien nach SCI zu untersuchen, ist ein präzises, konsistentes und reproduzierbares, konsequentes SCI-Modell bei Nagetieren erforderlich. Bei der experimentellen SCI-Forschung wurden 2 , 3 , 4 , 5 , 6 viele Rückenmarksverletzungsmodelle mit verschiedenen Verletzungserzeugungsmechanismen verwendet. Drei konsequente SCI-Modelle - speziell die Toleranz-basierte New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) Impaktor 3 , 6 , die Ohio State University (OSU) Impaktor / elektromagnetische SCI-Gerät (ESCID) 5 , 7 , einD der Infinite Horizon (IH) Impaktor 4 , 8 - sind weithin im SCI-Forschungsgebiet akzeptiert. Der NYU / MASCIS-Impaktor oder ein Äquivalent produziert Verletzungen, indem er ein festes Gewicht von verschiedenen Höhen auf das Ziel-Rückenmark ablegt, um mehrere Verletzungsschweregrade 3 , 6 zu erzeugen. Die OSU / ESCID verursacht Verletzungen durch Verursachung der Gewebeverdrängung 5 , 7 . Der IH-Impaktor erzeugt eine Verletzung durch unterschiedliche Kräfte auf das Rückenmark 4 , 8 . Jeder Impaktor verwendet eine andere Geschwindigkeit, die ein wichtiger Parameter ist, der die Verletzungsergebnisse beeinflusst. Das NYU / MASCIS Gerät erzeugt Geschwindigkeiten von 0,33-0,9 m / s. Das IH-Gerät hat eine maximale Geschwindigkeit von 0,13 m / s 4 . Der OSU / ESCID-Impaktor hat eine feste Geschwindigkeit von 0,148 m / s 5 . Bemerkenswert, die Geschwindigkeiten derSe Modelle sind niedriger als die in klinischen Geschwindigkeiten, die in der Regel 1,0 m / s 9 . Hier stellen wir eine neuartige Verschiebungs-basierte Continuity-SCI-Vorrichtung vor, die Louisville Injury System Apparatus (LISA) genannt wird, um SCI bei Mäusen mit einer hohen Aufprallgeschwindigkeit 10 zu erzeugen. Dieses System umfasst einen Wirbelstabilisator, der den Wirbel am Verletzungsort fest stabilisiert und so die Produktion eines konstanten, reproduzierbaren SCI ermöglicht. Der Lasersensor des Gerätes sorgt für die genaue Bestimmung der Gewebeverdrängung und die daraus resultierende Schwere des SCI. Die Geschwindigkeit des Stößels an der Berührungsstelle mit dem Rückenmark kann von 0,5 bis 2 m / s eingestellt werden. Diese Verletzungsparameter replizieren die traumatischen SCI genau klinisch.

<table><tbody><tr><td>Ketamin (7,2 mg/ml)/Xylazin (0,475 mg/ml)/Acepromazin</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Buprenorphin (0,03 mg/ml)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-9756</td><td>Schmerzmittel</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Purdue Products Betadine Chirurgisches Peeling</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>für die Sterilisation der Haut</td></tr><tr><td>Dukal Mullschwämme</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>für die Sterilisation der Haut</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>für die Sterilisation der Haut</td></tr><tr><td>1 mL NORM-JECT</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>D-78532</td><td>für Anästhesie/Schmerzlinderung/Injektion von Antibiotika</td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>TERUMO</td><td>REF SS-10L</td><td>für die Injektion</td></tr><tr><td>von Kochsalzlösung Künstliche Tränen Augensalbe</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261</td><td>Provent Augen aus trockener</td></tr><tr><td>Antibiotika-Salbe</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-877-0876</td><td>Provent Chirurgie Schnitt von Infektionen</td></tr><tr><td>Baumwolle Applikatoren</td><td>Fisher Scientific</td><td>1006015</td><td>Blutstillung</td></tr><tr><td>Instrument Sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>zum Sterilisieren von chirurgischen</td></tr><tr><td>Werkzeugen Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>Greifgewebe</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Hautschnitt</td></tr><tr><td>Skalpellklinge #15</td><td>Fisher Scientific</td><td>10015-00</td><td>Hautschnitt</td></tr><tr><td>Hämostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td>Blutstillung</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>Laminektomie</td></tr><tr><td>Agricola Retraktor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td>halten Sie die OP-Ansicht offen</td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14040-10</td><td>für von der Wirbelsäule getrennte Muskeln</td></tr><tr><td>Sterile Nähte</td><td>Fine Science Tools</td><td>12051-10</td><td>Hautverschluss</td></tr><tr><td>Maus Wirbelstabilisator</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>Stabilisieren und freilegen des Wirbels</td></tr><tr><td>LISA</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>Erzeugen einer experimentellen Prellverletzung des Rückenmarks bei Mäusen</td></tr></tbody></table>

ein tissue displacement-basierte contusive spinal cord verletzung modell in mäusen

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

Die Erzeugung einer konsistenten und reproduzierbaren kontinentalen Rückenmarksverletzung (SCI) ist entscheidend für die Minimierung von Verhaltens- und histologischen Variabilitäten zwischen Versuchstieren. Mehrere konsequente SCI-Modelle wurden entwickelt, um Verletzungen mit verschiedenen Mechanismen zu produzieren. Die Schwere des SCI basiert auf der Höhe, dass ein gegebenes Gewicht fallen gelassen wird, die Verletzungskraft oder die Rückenmarksverschiebung. In der aktuellen Studie stellen wir ein neuartiges Maus-Continuous-SCI-Gerät vor, das Louisville Injury System Apparatus (LISA) Impaktor, das ein verdrängtes SCI mit hoher Verletzungsgeschwindigkeit und Genauigkeit erzeugen kann. Dieses System nutzt Laserentfernungssensoren kombiniert mit fortschrittlicher Software, um abgestufte und hochreproduzierbare Verletzungen zu erzeugen. Wir führten bei den Mäusen einen Continuous SCI bei der vierten Thoraxvertebral (T10) Ebene durch, um das Schritt-für-Schritt-Verfahren zu demonstrieren. Das Modell kann auch auf die Hals- und Lendenwirbelsäule angewendet werden.

Diese Vorrichtung besteht aus fünf Hauptkomponenten: (1) einem Körper mit einer Impaktorspitze (Abbildung 1C ), (2) einem Computer mit Software (Abbildung 1B ), (3) einem elektrischen Steuerkasten (Abbildung 1B ), (4) a Wirbelstabilisator (Abbildung 2A ) und (5) Druckluft für das pneumatische Steuersystem (Abbildung 1A ). Um eine präzise Gewebeverdrängung zu induzieren, beruht das System auf einem Lasersensor, um den Abstand zwischen der vollständig ausgedehnten Kolbenspitze und der zielgerichteten Rückenmarksfläche zu messen. Die Software berücksichtigt die 4-mm-Dicke der Spitze aufgrund der Tatsache, dass der Laserstrahl nur die reflektierende Oberfläche des Impaktors erreicht (Abbildung 2B und Abbildung 3A -1 ). Es gibt zwei Positionen, an denen die Kolbenspitze platziert werden kann: (1) iN der Weg des Laserstrahls ( Fig. 3A- 1 ) oder (2) in einer seitlichen Position weg von dem Laserstrahl ( Fig. 3B- 1 ). Wenn sich der Kolben im Laserstrahlengang befindet (Abbildung 3A -1 ), misst er den Abstand von der Impaktorspitze und überwacht die Geschwindigkeit der Impaktorspitze während der Bewegung zwischen Aus- und Rückzug. Wenn sich der Kolben in der seitlichen Position weg von dem Laserstrahlengang befindet ( Fig. 3B- 1 ), wird der Abstand zwischen dem Laser und dem Rückenmark gemessen. Die Stabilisierung des T10-Wirbels mit unserem Wirbelstabilisator ist ein integraler Bestandteil des Verfahrens (Abbildung 2A ) 10 , 11 . Zuverlässige Distanzmessungen mit dem Lasersensor sind abhängig von der sDie Tabilität des Ziels, die verzerrt werden kann, wenn Bewegung vorhanden ist. Um die Genauigkeit und Konsistenz dieses Systems zu bestimmen, wurden 8 Mäuse 0,5-mm-Verdrängungsverletzungen ausgesetzt. Diese Tiere zeigten eine Verschiebungsvariabilität von ± 0,001 mm (± SD), was darauf hinweist, dass das System hochgenau und reproduzierbar ist. Fig. 4 zeigt die immobilisierten Zielwirbel in dem Stabilisator ( Fig. 4A ) und dem freiliegenden T10-Rückenmark vor ( Fig. 4B ) und nach ( Fig. 4C ) unter einem chirurgischen Mikroskop. Der Druck der Druckluft steuert die Geschwindigkeit des Impaktors zum Zeitpunkt der Verletzung. Unsere Daten zeigen, dass die Aufprallgeschwindigkeit bei einem Druck von 138 kPa 0,81 ± 0,0345 m / s (Mittelwert ± SD) beträgt. Der Drehknopf ( Bild 1B ) am Steuergerät steuertDie Dauer des Kofferkontaktes (Verweilzeit) nach der Verletzung und kann zwischen 0 und 5.000 ms eingestellt werden. Die Trinkgeldzeit in den meisten Experimenten liegt bei 0,32 ± 0,0177 s (Mittelwert ± SD) (Abbildung 5 ). Mit dieser Vorrichtung können mit Gewebeverschiebungen von 0 mm (Scheinkontrolle), 0,2 mm (leichte Verletzung), 0,5 mm (mäßige Verletzung) und 0,8 mm (schwere Verletzungen) bei erwachsenen Mäusen schwerwiegende Verletzungen auftreten (Abbildung 6 ). <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig1.jpg"> Abbildung 1: Das Louisville Injury System Apparatus (LISA). ( A ) Das System besteht aus einem Impaktor, einem Kontrollsystem und einer Druckluftquelle. ( B ) Das Steuerungssystem umfasst eine Steuerbox und einen Laptop-Computer. Die Software und die Steuertasten der Steuerbox erlauben es dem Benutzer zu etablierenVerletzungsparameter ( C ) Der Lasersensor ist die Schlüsselkomponente des Gerätes und misst die Position des Verletzungsziels, den Abstand vom Rückenmark zum Sensor und die Verletzungsgeschwindigkeit. Die schnelle Abwärtsbewegung der Aufprallspitze erfolgt durch Druckluft. Die Lage der Verletzung und die Schwere der Gewebeverdrängung werden durch Mikrodrivers eingestellt, die die Bewegung in drei Dimensionen steuern. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig2.jpg"> Abbildung 2: Der Stabilisator und der Maushalter. ( A ) Der Wirbelsäulenstabilisator besteht aus einem U-förmigen Trog und zwei Metallarmen, um den Mauswirbel zu halten. ( B ) Der Stabilisator wird dann auf der Aufprallvorrichtung montiert. TDie rote Linie zeigt den Laserstrahlengang an. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig3.jpg"> Abbildung 3: Methode zur Herstellung eines Continuous SCI. ( A - C ) Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) mit drei Verletzungsparametern / Zonen wird angezeigt. ( A , A-1 ) Die grüne Zone (SET ZERO LEVEL) kalibriert den Abstand der Kolbenspitze. Die rote Linie zeigt den Laserstrahlengang an. ( B , B-1 ) Die blaue Zone wird verwendet, um die Verletzungsstufe einzustellen (SET INJURY LEVEL). Der Impaktor wird angehoben und seitlich zur rechten Seite bewegt, damit der Laserstrahl die Rückenfläche des Rückenmarks erreichen kann, um den Nullpegel einzustellen. Die rote Linie zeigt den Laser b an Eam pfad ( C , C-1 ) Vor dem Aufprall wird die Spitze auf den Laserstrahlengang zurückbewegt, um die Verletzung (RUN) auszuführen. Die Verletzungsparameter befinden sich unter der roten Zone (RUN EXPERIMENT). Die rote Linie zeigt den Laserstrahlengang an. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig4.jpg"> Abbildung 4: Verletzungsbelastung und Bewertung. ( A ) Die Metallarme des Wirbelsäulenstabilisators stabilisieren den T10-Wirbel. ( B ) T10 Laminektomie, um das Rückenmark zu entlarven, mit den dorsalen Gefäßen deutlich gesehen. ( C ) Die schlagbedingte Kontusion (Pfeil) auf der Rückenfläche des Rückenmarks bestätigt die Verletzung. Maßstab = 2 mm.G4large.jpg "target =" _ blank "&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig5.jpg"> Abbildung 5: Verletzungsparameter. Konsequente Verletzungsparameter umfassen Gewebeverdrängung (mm), Verletzungsgeschwindigkeit (m / s) und Spitzenverweilzeit (en). N = 8, Mittelwert ± SD. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig6.jpg"> Abbildung 6: Histologische Bewertung. Repräsentative Querschnitte von Rückenmarken, die mit Cresylviolett und Eosin gefärbt sind, zeigen verschiebungsschwere abhängige Verletzungen nach ( A ) Schein (0 mm), ( B ) mild (0,2 mm), ( C D ) schwere (0,8 mm) anfängliche SCIs bei T10 mit dem LISA-Gerät. Bilder wurden im Verletzungs-Epizentrum aufgenommen. Maßstab = 500 μm <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir führen ein Gewebeverdrängungs-basiertes Continal-Rückenmarksverletzungsmodell ein, das bei erwachsenen Mäusen eine konsistente Verletzung des Rückenmarks verursachen kann.

Ein Tissue Displacement-basierte Contusive Spinal Cord Verletzung Modell in Mäusen

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, ein neuartiges, auf Gewebeverdrängung basierendes Modell für kontusive Rückenmarksverletzungen vorzustellen, das bei erwachsenen Mäusen zu einer konsistenten kontusiven Rückenmarksverletzung führen kann. Dieses Kontusionsmodell kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der experimentellen Rückenmarksverletzungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zu einer sehr konsistenten Rückenmarksverletzung führt.Die Implikationen dieser Technik erstreckten sich auf die Therapie von Rückenmarksverletzungen, da dieses Modell ein zuverlässiges und reproduzierbares Werkzeug zur Untersuchung der Verletzungsmechanismen und der Auswirkungen experimenteller Therapien bietet. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, weil sie mit dem neuartigen Impaktor nicht vertraut sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da mehrere Schritte aufgrund manueller und softwarebezogener Vorgänge schwer zu erlernen sind.Beginnen Sie damit, die chirurgischen Instrumente im Autoklaven und den Wirbelsäulenstabilisator aus Metall auf den sauberen Operationstisch zu bringen. Erwärmen Sie ein Heizkissen auf 37 Grad Celsius. Legen Sie dann das Heizkissen auf den Operationstisch und decken Sie es mit sterilen OP-Tüchern ab.Für diese Studie wurden 10 Wochen altes Weibchen C57BL6J Mäuse verwendet. Nach Verabreichung einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin ist zu überprüfen, ob ein angemessenes Anästhesieniveau erreicht wird, indem keine Reaktion auf die durch das Pfotenkneifen induzierte Nozizeptionsstimulation auftritt. Verabreichen Sie Buprenorphin, ein Analgetikum, und Carprofen, ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament, subkutan.Verwenden Sie eine elektrische Haarschneidemaschine, um das Haar über der thorakolumbalen Wirbelsäule zu rasieren. Schrubben Sie die Haut mit Betadinlösung und 70%igen Alkoholtüchern. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Hornhaut auf, um die Augen vor dem Austrocknen zu schützen.Nachdem Sie einen 1,5 Zentimeter langen Hautschnitt in der Mittellinie auf dem Rücken des Tieres über die neunte bis elfte Brustwirbellamine gemacht haben, schieben Sie das subkutane Fettgewebe rostral. Präparieren Sie mit einer feinen Schere, einer feinen Pinzette und einem Agricola-Retraktor die paraspinalen Muskeln weg von den Dornfortsätzen und die Laminae in Richtung der lateralen Fascets auf jeder Seite. Positionieren Sie die Maus auf dem U-förmigen Behälter des Stabilisators, klemmen Sie die Edelstahlarme beidseitig unter die freiliegenden Facetten des t10-Wirbels und ziehen Sie die Arme mit den daran befestigten Rändelschrauben fest.Verwenden Sie ein Mikrorongeur, um den t10-Dornfortsatz und die Lamina zu entfernen, die das Dura-Modell über dem Rückenmark freilegt. Platzieren Sie den U-förmigen Behälter mit der Maus auf dem Tisch des Impaktors und fixieren Sie den Tisch, indem Sie die Rändelschrauben der Halterung festziehen. Um den Impaktor einzurichten, drehen Sie zuerst den Knopf des Druckreglers am Stickstofftank, um den komprimierten Stickstoff für die Studie auf 20 Pfund pro Quadratzoll oder 138 Kilopascal einzustellen.Sterilisieren Sie die 1,2 Milliliter Schlagspitze mit 70% Alkohol. Öffnen Sie dann das Softwarepaket auf dem Computer. Drücken Sie einen der Steuerkästen, um die Schlagdüse in eine vollständig ausgefahrene Position zu bringen.Klicken Sie auf dem Computerbildschirm unter Nullpegel einstellen auf Lesen starten, um den Abstand zur vollständig ausgefahrenen Kolbenspitze zu messen. Die Entfernung wird als Bereichsparameter in dieser Zone angezeigt. Klicken Sie dann auf Null setzen und eine Zahl in Millilitern wird in der Null-Parameterbox angezeigt.Drücken Sie anschließend den ersten Knopf an der Steuerbox, um die Schlagdüse herauszuziehen. Entriegeln Sie dann die Befestigungsschraube, ziehen Sie an der Schraube, um die Spitze vom Laserstrahlengang weg zu bewegen, und drehen Sie die Schraube um 90 Grad im Uhrzeigersinn, um sie zu verriegeln. Bewegen Sie nun den Montierungstisch, indem Sie die vorderen und seitlichen Mikrotreiber so einstellen, dass der Laserstrahl auf die Mitte des freiliegenden dorsalen Rückenmarks gerichtet ist.Nachdem die Verletzungsstelle anvisiert wurde, messen Sie den Gewebeabstand, indem Sie auf die Schaltfläche "Lesen starten" unter "Verletzungsstufe festlegen" klicken. Verwenden Sie den vertikalen Mikrotreiber, um den Abstand zwischen Sensor und Rückenmark langsam einzustellen, bis der gewünschte Verschiebungsparameter erreicht ist. Dies liegt unter der eingestellten Verletzungsstufe, die in der Parameterbox für Verletzungen angegeben ist.Wenn die gewünschte Verletzungsverschiebung erreicht ist, notieren Sie den im Parameterfeld für den Bereich angezeigten Gewebeabstand und definieren Sie dann die gewünschte Verschiebung oder Verletzung, indem Sie den Gewebeabstand oder -bereich vom Spitzenabstand bei Null subtrahieren. Klicken Sie dann unter Verletzungsstufe festlegen auf Verletzung festlegen. Entriegeln Sie anschließend die Schraube, indem Sie sie um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn drehen.Schieben Sie die Aufprallspitze zurück in die Flugbahn des Laserstrahls und verriegeln Sie die Schraube, indem Sie sie um 90 Grad im Uhrzeigersinn drehen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen" unter "Experiment ausführen", um den Aufprall auszuführen. Die Parameterboxen zeigen die Verletzungszeit in Sekunden, die Kraft in Mikrovolt, die Geschwindigkeit in Metern pro Sekunde und die Verletzungsverschiebung in Millimetern an. Nachdem alle Verletzungsdaten aufgezeichnet und gespeichert wurden, entfernen Sie die U-förmige Wanne mit der Maus vom Tisch.Bestätigen Sie dann die Rückenmarksverletzung visuell unter einem Operationsmikroskop. Nachdem Sie den Schnitt in Schichten genäht haben, injizieren Sie dem Tier einen Millimeter 0,9%ige Kochsalzlösung subkutan zur Flüssigkeitszufuhr und legen Sie es auf ein temperaturkontrolliertes Pad, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Halten Sie die Maus dann in einem sauberen Käfig mit leicht zugänglichem Wasser und Futter.Diese Daten zeigen inkonsistente Verletzungsparameter und zeigen, dass der Impaktor zuverlässige und reproduzierbare Verletzungen verursachen kann. Dieser repräsentative Querschnitt, gefärbt mit Cresylviolett-Eosin, zeigt die t10-Region des Rückenmarks nach Scheinverletzung mit der 0-Millimeter-Verschiebung. Dieses Bild zeigt das Epizentrum einer leichten kontusiven Rückenmarksverletzung bei t10, wobei das Gerät mit einer Verschiebung von 0,2 Millimetern verwendet wird.Diese mittelschwere Verletzung wurde durch eine Verschiebung von 0,5 Millimetern erreicht. Schließlich ist diese schwere Verletzung die Folge einer Verschiebung um 0,8 Millimeter. Diese Bilder zeigen, dass dieser neuartige Impaktor abgestufte Prellungsverletzungen hervorrufen kann.Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Null für die Schlagkörperspitze in den Zielen des Rückenmarks zu setzen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Rückenmarksverletzungen, um Mechanismen und Therapien bei Mäusen, Ratten und nichtmenschlichen Primaten zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diesen Impaktor verwenden können, um eine kontusive Rückenmarksverletzung zu verursachen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Eine zuverlässige und wiederholbare Möglichkeit, eine zervikale einseitige Verletzung des Rückenmarks mit der Infinite Horizon Impaktor produzieren wird beschrieben. Die Methode nutzt die Vorteile eines maßgeschneiderten Rahmen und spannen, um die Wirbelsäule zu stabilisieren. Das standardisierte Verfahren und biomechanischen Parameter führen zu Verletzungen ausreichende und nachhaltige Verletzungen.

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