2.13: Durchführung der 1D-Dünnschichtchromatographie

1. TLC-Platten

1. Gängige Adsorbentien für DC-Toxizität sind Kieselgel, Aluminiumoxid und Zellulose. DC-Platten sind mit einer Vielzahl von Eigenschaften im Handel erhältlich. Wählen Sie eine DC-Platte und schneiden Sie sie auf eine geeignete Größe zu (ca. 5 cm x 5 cm ist für die meisten Anwendungen ausreichend). Bei DC-Platten mit Glasrücken ritzen Sie das Glas mit einem Lineal und einem Glasschneider ein und brechen Sie dann vorsichtig entlang der Linie.

2. Flecken

1. Löse die Probe in einem geeigneten Lösungsmittel auf, um eine etwa 1%ige Lösung herzustellen. Wenn möglich, sollte das Lösungsmittel unpolar sein. Säulenchromatographie-Fraktionen und andere verdünnte Lösungen können ohne Verdünnung verwendet werden, wenn der gelöste Stoff in einer Konzentration zwischen 0,2 % und 2,0 % vorliegt.
2. Markieren Sie die Grundlinie mit einem Bleistift etwa 1,0 cm vom Boden der Platte entfernt. Positionieren Sie die Spots mindestens 1,0 cm vom Rand der Platte entfernt und beschriften Sie sie entsprechend.
3. Die Spots können mit einer Glaskapillare aufgetragen werden. Um die DC-Platte zu erkennen, tauchen Sie die Kapillare in die Lösung, um eine kleine Menge Flüssigkeit aufzunehmen. Berühren Sie die Spitze vorsichtig an der gewünschten Stelle auf der DC-Platte und entfernen Sie sie sofort.
4. Alternativ können Sie Spots mit einer Mikroliterspritze auftragen, indem Sie bei jeder Anwendung etwa 1 μl Lösung abgeben.
5. Die Spots können nacheinander an jeder Stelle aufgetragen werden, wobei darauf zu achten ist, dass die Oberfläche des Adsorptionsmittels mit dem Spotter nicht gestört wird. Lassen Sie das Lösungsmittel zwischen den Anwendungen trocknen.

3. Auswahl eines Entwicklungslösungsmittels

1. Für eine gute Trennung ist es vorzuziehen, ein möglichst wenig polares Lösungsmittel zu verwenden. Zu den gängigen Lösungsmitteln für die Gleichstromversorgung gehören Hexan, Ethylacetat, Dichlormethan und Methanol (Tabelle 1).
2. Eine bequeme Möglichkeit, eine geeignete mobile Phase zu finden, besteht darin, die DC-Platte mit einer Probe zu beleuchten. Tragen Sie so viel Lösungsmittel direkt auf die Stelle auf, dass ein Kreis aus Lösungsmittel mit einem Durchmesser von 1–2 cm entsteht. Markieren Sie den Umfang des Kreises. Bei der Visualisierung zeigt ein geeignetes Lösungsmittel gut getrennte Ringe, wobei der äußerste Ring etwa 50% des Abstands von der Mitte zur Lösungsmittelfront beträgt.
3. Es kann erforderlich sein, die Polarität der mobilen Phase einzustellen, indem zwei mischbare Lösungsmittel ausgewählt und in unterschiedlichen Anteilen getestet werden. Beispiele für gängige Mischungen sind Hexane mit Ethylacetat und Dichlormethan mit Methanol.

4. Entwicklung

1. Legen Sie die gefleckte DC-Platte in eine Entwicklungskammer, die das entsprechende Entwicklungslösungsmittel enthält. Die Lösungsmittellinie sollte unter der auf der DC-Platte markierten Basislinie liegen.
2. Die Entwicklungskammer kann ein Glas mit Deckel oder ein Becherglas sein, das mit Aluminiumfolie oder Plastikfolie bedeckt ist. Verwenden Sie den kleinsten verfügbaren Behälter, der die DC-Platte aufnehmen kann.
3. Lassen Sie das Lösungsmittel nicht an die Oberkante der Platte gelangen. Wenn die Lösungsmittelfront (die Grenze, an der der nasse Teil des Adsorptionsmittels endet) 5–10 mm von der Oberseite der Platte entfernt ist, entfernen Sie die DC-Platte aus der Entwicklungskammer und markieren Sie die Lösungsmittelfront mit einem Bleistift, bevor das Lösungsmittel trocknet.

5. Visualisierung

1. Farbige Punkte können sofort sichtbar gemacht und mit einem Bleistift markiert werden. Oft sind Flecken nicht sichtbar und müssen daher mit einer anderen Methode visualisiert werden.
2. Oft enthält das DC-Adsorptionsmittel einen Fluoreszenzindikator. Flecken können mit einer tragbaren Ultraviolett (UV)-Lampe sichtbar gemacht werden. Verbindungen, die die Fluoreszenz löschen, erscheinen als dunkle Flecken, wenn die Platte mit kurzwelligem (254 nm) UV-Licht bestrahlt wird. Fluoreszierende Verbindungen erzeugen helle Flecken, wenn sie mit UV-Licht einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt werden. Markiere die Mitte jedes Punktes mit einem Bleistift.
3. Flecken können auch sichtbar gemacht werden, indem ein Visualisierungsreagenz oder eine Färbung auf die DC-Platte aufgetragen wird. Das Visualisierungsreagenz kann durch Eintauchen der Platte in das Reagenz oder durch Abwischen der Platte mit einem Wattebausch, der mit einem nicht korrosiven Reagenz getränkt ist, angewendet werden.
4. Eine 20%ige Lösung von Phosphomolybdsäure in Ethanol ist nützlich für die Visualisierung der meisten organischen Verbindungen. Die Flecken treten beim Erhitzen der Platte mit einer Heißluftpistole oder in einem Ofen auf.
5. Andere Reagenzien können zur Visualisierung spezifischer Klassen von Verbindungen verwendet werden. Zum Beispiel wird das Ninhydrin-Reagenz für die Visualisierung von Aminosäuren und 2,4-Dinitrophenylhydrazin für Aldehyde und Ketone verwendet.

6. Analyse

1. Der Verzögerungsfaktor (R_f) ist das Verhältnis zwischen der Entfernung, die eine Verbindung auf einer DC-Platte zurücklegt, und der Entfernung, die das Lösungsmittel zurücklegt. Dies kann bestimmt werden, indem der Abstand von der Basislinie zur Mitte des Spots gemessen und der Wert durch den Abstand von der Basislinie zur Lösungsmittelfront dividiert wird.
   
2. Die R_f einer Verbindung ist charakteristisch für ihre physikalischen Eigenschaften und hängt von Faktoren wie Temperatur, Probengröße sowie Dicke und Aktivität des Adsorptionsmittels, Temperatur und Probengröße ab.
3. Um zu bestätigen, dass eine unbekannte Verbindung mit einer bekannten Verbindung identisch ist, sollte ein Standard auf derselben DC-Platte entdeckt werden. Identische Stoffe haben die gleichen Eigenschaften R_f.

Die Dünnschichtchromatographie (DC) ist ein chromatographisches Verfahren zur Trennung von Gemischen nichtflüchtiger Verbindungen, das üblicherweise in der organischen Chemie verwendet wird.

Die TLC wird auf einer Platte mit Glas- oder Kunststoffrückseite durchgeführt. Auf der Platte ist eine Grundlinie zusammen mit Beschriftungen markiert. Das zu untersuchende Gemisch und die Referenzverbindungen werden in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und in der Nähe der Unterkante der DC-Platte in kleinen Flecken aufgetragen. Die Platte wird in ein Glas gegeben, und ein Lösungsmittel? (die mobile Phase) trennt das Gemisch basierend auf den physikalischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten.

Trotz der Tatsache, dass instrumentenlastigere Trenntechniken ein höheres Auflösungsvermögen haben als DC, sind es die Geschwindigkeit und die niedrigen Kosten, die TLC zu einer attraktiven Technik für die qualitative On-the-fly-Analyse machen. Dieses Video zeigt die Vorbereitung, den Betrieb und die Analyse der Dünnschichtchromatographie.

Zu den chromatographischen Techniken gehören eine stationäre und eine mobile Phase. Bei der Gleichstromversorgung besteht die stationäre Phase aus einer dünnen Materialschicht, die auf der Platte befestigt ist. Bei dem Material handelt es sich um eine polare Substanz, wie z. B. Kieselgel. Die mobile Phase ist eine unpolare Flüssigkeit, die sich durch Kapillarwirkung in der Adsorptionsschicht nach oben bewegt. Wenn sich die mobile Phase auf der Platte nach oben bewegt, zieht sie die Komponenten jedes Spots mit sich, die anschließend nach Polarität getrennt werden.

Verbindungen, die weniger polar sind, verbringen mehr Zeit in der mobilen Phase, wenn sie die Platte hochgezogen werden. Verbindungen, die polarer sind, werden stärker von der stationären Phase angezogen und bewegen sich daher nicht so weit auf der Platte nach oben.

Die Trennung erfolgt in einem Entwicklungsbehälter. Dabei kann es sich um Gläser mit Deckel oder Becher handeln, die mit Alufolie bedeckt sind. Verwenden Sie den kleinsten verfügbaren Behälter, in dem die DC-Platte untergebracht werden kann, um die Trennung zu beschleunigen.

Die mobile Phase, also das sich entwickelnde Lösungsmittel, sollte für eine gute Trennung so unpolar wie möglich sein. Hier ist eine eluotrope Reihe für Kieselgel dargestellt, eine Liste gängiger mobiler Phasen in der Reihenfolge der Erhöhung der Extraktionsleistung.

Es können mehrere mobile Phasen gleichzeitig getestet werden. Platzieren Sie die gelöste Probe auf einer sauberen Platte mehrmals, mindestens 2 cm voneinander entfernt. Tragen Sie genügend bewegliche Phase auf jede Stelle auf, um einen Kreis mit einem Durchmesser von 1-2 cm zu bilden.

Markieren Sie die Entfernung, die die mobile Phase zurücklegt. Wenn die mobile Phase nicht polar genug ist, bleibt die Probe in der Nähe des Ausgangspunkts. Wenn die mobile Phase zu polar ist, wandert die gesamte Probe mit der Lösungsmittelfront. Eine geeignete mobile Phase zeigt gut getrennte Ringe, wobei der äußerste Ring etwa 50 % des Abstands zur Lösungsmittelfront zurücklegt.

Bei Bedarf können zwei mischbare mobile Phasen in unterschiedlichen Anteilen gemischt werden, um die gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Hier war ein 1:1-Gemisch aus Ethylacetat und Hexan zu polar, aber ein 1:20-Gemisch wurde entsprechend getrennt.

Wenn Sie sich für die mobile Phase entschieden haben, können Sie mit der Entwicklung der Platte beginnen.

Um den Vorgang zu starten, schneiden Sie eine handelsübliche DC-Platte auf die gewünschte Größe zu. Wenn die Platte eine Glasunterlage hat, ritzen Sie sie mit einem Glasschneider ein und brechen Sie sie vorsichtig entlang der Linie.

Markieren Sie mit einem Bleistift eine Grundlinie etwa 1 cm vom Boden der Platte entfernt. Markieren Sie die Stelle, an der die Proben entlang der Linie gesichtet werden. Achten Sie darauf, dass die Flecken mindestens 1 cm vom Rand entfernt und 3 mm voneinander entfernt sind. Beschriften Sie sie entsprechend.

Feste Proben müssen in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden. Zu den gängigen Lösungsmitteln gehören Hexane, Ethylacetat oder Dichlormethan. Verwenden Sie das am wenigsten polare Lösungsmittel, das die Probe auflöst.

Das Proben-Lösungsmittel-Gemisch mit einer Glaskapillare aufziehen. Berühren Sie die Spitze vorsichtig an der gewünschten Stelle auf der DC-Platte und entfernen Sie sie sofort. Es ist wichtig, die stationäre Phase nicht zu stören.

Halten Sie den Fleck so klein wie möglich, da dies zu einer besseren Trennung führt. Wenn mehr Proben benötigt werden, können die Spots nacheinander an jeder Stelle aufgetragen werden. Lassen Sie das Lösungsmittel zwischen den Anwendungen trocknen. Ein Luftstrom kann zur Trocknung von weniger flüchtigen Lösungsmitteln verwendet werden.

Die DC-Platte ist nun bereit für die Entwicklung. Lege ein Stück Filterpapier in den Boden des Glases, um den Dampfdruck zu erhöhen. Fügen Sie die mobile Phase zu einer Tiefe hinzu, die die Basislinie nicht erreicht. Verschließen Sie das Glas, wenn es nicht verwendet wird, damit die Lösungsmitteldämpfe nicht entweichen.

Legen Sie die gefleckte DC-Platte vorsichtig in das Entwicklungsglas. Stellen Sie sicher, dass die mobile Phase unter der Basislinie liegt. Den Fortschritt der Lösungsmittelfront beobachten? Die Spitze der mobilen Phase? da es sich schnell auf der Platte nach oben bewegt.

Lassen Sie die mobile Phase nicht den oberen Rand der Platte erreichen, da sich die Probenbanden durch Diffusion auszudehnen beginnen. Sobald sich die Lösungsmittelfront der Oberseite nähert, entfernen Sie die Platte aus der Entwicklungskammer und markieren Sie die Lösungsmittelfront mit einem Bleistift, bevor das Lösungsmittel trocknet.

Sind die Verbindungen nicht gefärbt, kann eine UV-Lampe verwendet werden, um die Flecken sichtbar zu machen. Die Verbindung blockiert die Hintergrundfluoreszenz der Platte. Stellen Sie die Lampe auf die Kurzwelleneinstellung ein und beleuchten Sie die Trockenplatte. Umreißen Sie mit einem Bleistift alle sichtbaren Flecken unter der Lampe. Umreißen Sie mit einem Bleistift alle sichtbaren Flecken unter der Lampe.

Eine weitere mögliche Visualisierungstechnik ist die Verwendung von Kaliumpermanganat, einem Oxidationsmittel. Tauchen Sie die Platte mit einer Pinzette in den Permanganatfleck.

Überschüssige Lösung entfernen und mit einem Papiertuch abtupfen. Erhitzen Sie die Platte in einem Abzug vorsichtig mit einer Heißluftpistole, um die Flecken sichtbar zu machen. Markieren Sie mit einem Bleistift alle sichtbaren Stellen.

Nachdem die Spots visualisiert wurden, kann die interessierende Substanz mit Standards verglichen werden, wie hier gezeigt. In diesem Beispiel ist die Unbekannte 1,3-Diphenylpropynon, ein Baustein der organischen Synthese. Durch den Vergleich der Bande mit einem bekannten Standard und Benzoylchlorid, einem der Ausgangsstoffe, kann das Produkt identifiziert werden.

Der Verzögerungsfaktor (Rf) wird verwendet, um die unbekannte Verbindung zu identifizieren. Der Rf ist das Verhältnis der Entfernung, die eine Verbindung auf einer DC-Platte zurücklegt, zu der Entfernung, die die mobile Phase zurücklegt. Der Faktor wird bestimmt, indem der Abstand von der Basislinie zum Spot gemessen und durch den Abstand von der Basislinie zur Lösungsmittelfront dividiert wird.

Die Rf einer gegebenen Verbindung hängt von den im Experiment verwendeten Bedingungen ab, einschließlich der Wahl des Lösungsmittels, der Dicke und Aktivität des Adsorptionsmittels, der Temperatur und der Probengröße. Es sollte darauf geachtet werden, dass diese Faktoren zwischen den Experimenten konsistent bleiben.

Es gibt mehrere Anwendungen der Dünnschichtchromatographie.

In diesem Beispiel wurde der Triacylglyceridgehalt der Talgdrüsen von Fledermäusen untersucht. Die Lipidoberflächenfraktion wurde zunächst durch Polarität auf einer DC-Platte getrennt. Anschließend wurde die Triacylglyceridbande mit einem Spatel von der Platte entfernt. Das Kieselsäurepulver wurde mit Lösungsmittel in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Nach der Zentrifugation wurde die stationäre Phase am Boden des Röhrchens belassen, während die Verbindungen im Lösungsmittel gelöst blieben. Die Triacylglyceride wurden dann durch eine weitere physikalische Eigenschaft weiter voneinander getrennt. In diesem Fall war die zweite Dimension der Trennung die Molekülgröße.

DCC kann auch verwendet werden, um den Verlauf einer chemischen Reaktion zu überwachen. In diesem Beispiel wurde das Ausgangsmaterial der Reaktion als Standard verwendet und lief neben der Reaktionslösung auf einer DC-Platte. Dieser Vorgang wurde im Verlauf der Reaktion in bestimmten Abständen wiederholt. Mit fortschreitender Reaktion verringerte sich die Ausgangsstoffbande und die Produktbande vergrößerte sich. Wenn es keinen Wechsel der Bänder gab oder das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war, war die Reaktion abgeschlossen. ?

Schließlich können DC-Platten in Bioassays verwendet werden. In diesem Beispiel wurden Verbindungen mit TLC aus Rotklee getrennt. Jede Bande wurde dann auf Bakterien gelegt, die auf Agarplatten wuchsen. Moleküle, die ein gehemmtes Bakterienwachstum zeigten, wurden weiter auf ihre antimikrobiellen Eigenschaften analysiert.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Dünnschichtchromatographie gesehen. Sie sollten nun die zugrundeliegende Theorie der Trennung verstehen, wie Sie eine geeignete mobile Phase für Ihr Experiment auswählen und wie Sie eine DC-Platte einrichten und betreiben. Danke fürs Zuschauen!