Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lösliche Recumbinat-T-Zellen-Rezeptor- und Peptid-HLA-Proteine von ausreichender Qualität für den Einsatz in der biophysikalischen und strukturellen Analyse zu erzeugen. Diese Methode könnte helfen, Fragen im Bereich der T-Zell-Immunologie zu beantworten. Zum Beispiel, warum T-Zellen nicht robust auf Krebs reagieren?

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir extrem hochauflösende mechanistische Daten erhalten, die erklären, wie T-Zell-Rezeptoren ihre Ziele erkennen, was zu T-Zell-vermittelten Immunantworten führt. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose praktisch aller menschlichen Krankheiten, da T-Zellen eine zentrale Rolle bei den meisten Immunreaktionen spielen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Immunantwort von T-Zellen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die durch Rezeptor-Liganden-Interaktionen gesteuert werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es sehr schwierig ist, lösliche, aktive Proteine von ausreichender Qualität für biophysikalische und strukturelle Experimente zu erzeugen. Um das Peptid-HLA-Umfaltungsverfahren auf sechs Milliliter Guanidinpuffer mit 10 Milometer Dithiothreitol zu beginnen, fügen Sie 30 Milligramm HLA-A2-Einschlusskörper, 30 Milligramm Beta-2-M-Einschlusskörper und vier Milligramm des gewünschten Peptids von Interesse hinzu. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Verdünnen Sie dann die Mischung mit einem Liter HLA-Rückfaltpuffer, kühlen Sie sie auf vier Grad Celsius vor und rühren Sie die Mischung drei Stunden lang bei dieser Temperatur. Dialysieren Sie die Mischung zweimal gegen 20 Liter 10 millimolare Tris, pH 8,1, jeweils für 24 Stunden. Um das TCR-Refaltungsverfahren zu beginnen, fügen Sie zu sechs Millilitern Guanidinpuffer mit 10 millimolaren Dithiothreitol jeweils 30 Milligramm TCR-Alpha- und Beta-Ketten-IBs hinzu.

Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und verdünnen Sie die Mischung in einem Liter vorgekühltem TCR-Rückfaltungspuffer. Rühren und dialysieren Sie das verdünnte TCR-Refold-Gemisch auf die gleiche Weise wie das Peptid-HLA-Gemisch. Beide dialysierten Refold-Gemische werden durch einen 0,45-Mikrometer-Membranfilter filtriert.

Als nächstes wird eines der gefilterten Refold-Präparate auf eine 7,9 Milliliter 50-Mikrometer-Anionenaustauscherharzsäule geladen, die mit 20 Millilitern 10 Millimolar Tris, pH 8,1, voräquilibriert wurde. Eluieren Sie das Protein mit einem Salzgradienten-Puffersystem bei fünf Millilitern pro Minute. Sammeln Sie Ein-Milliliter-Fraktionen und analysieren Sie die Fraktionen mit SDS-Page.

Kombinieren Sie die Fraktionen, die das gefaltete Protein enthalten. Geben Sie das Proteingemisch in einen Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewicht von 10 Kilodalton. Zentrifugieren Sie die Mischung 20 Minuten lang oder so lange wie erforderlich ist, bei 4000 mal g, um die Mischung auf 500 Mikroliter zu konzentrieren.

Verwerfen Sie den Durchfluss. Formen Sie das konzentrierte Proteinpräparat in eine Zwei-Milliliter-Injektionsschlaufe und injizieren Sie das Protein auf eine 24-Milliliter-Ausschlusschromatographiesäule, die mit dem entsprechenden Elusionspuffer voräquilibriert ist. Eluieren Sie das Protein mit einem Spaltenvolumen Puffer bei 0,5 Millilitern pro Minute.

Sammeln Sie Ein-Milliliter-Fraktionen, analysieren Sie die Fraktionen mit SDS-Page und kombinieren Sie die Fraktionen, die das interessierende Protein enthalten. Bereiten Sie 10 serielle Verdünnungen der TCR-Lösung in einem Konzentrationsbereich vor, der sich über das 10-fache über und das 10-fache unter dem KD der spezifischen TCR-Peptid-HLA-Wechselwirkung erstreckt, falls bekannt. Andernfalls beginnen Sie mit einer TCR-Konzentration von 200 Mikromolaren.

Als nächstes aktivieren Sie einen mit carboxymethyliertem Dextran beschichteten Sensorchip, indem Sie eine Eins-zu-Eins-Mischung aus 100 Millimolar und N-Hydroxysuccinimid und 400 Millimolar EDC mit einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius über den Chip fließen lassen. Laden Sie dann 110 Mikroliter mit 200 Mikrogramm pro Milliliter Streptavidin und 10 Millimolaracetat pH 4,5 in alle vier Durchflusszellen, um die Chipoberfläche zu funktionalisieren. Deaktivieren Sie alle verbleibenden reaktiven Gruppen mit 100 Mikrolitern eines molaren Ethanolamidhydrochlorids.

Als nächstes wird eine Lösung von etwa einem mikromolaren Peptid HLA in dem vom Chiphersteller bereitgestellten Puffer mit 10 Mikrolitern pro Minute über die Oberfläche des Chips fließen lassen, bis die Anzahl der Antworteinheiten um 500 bis 600 zunimmt. Sättigen Sie die Oberfläche des Chips 60 Sekunden lang mit einem Millimolar Biotin und dem vom Hersteller bereitgestellten Puffer. Injizieren Sie dann die 10 seriellen Verdünnungen der TCR-Lösung bei 30 Mikrolitern pro Minute bei 25 Grad Celsius.

Berechnen Sie die Gleichgewichtsbindungskonstante und führen Sie eine Kinetikanalyse durch. Auf diese Weise wird eine Reihe von SPR-Experimenten durchgeführt, wobei nur die Temperatur variiert wird, bei der die TCR-Verdünnungen injiziert werden. Bestimmen Sie die Gleichgewichtsbindungskonstante für jede Temperatur und berechnen Sie die Gibbs-Energien und andere thermodynamische Parameter.

Stecken Sie die Gibbs-Energien mit einer nichtlinearen Regressionsanpassung gegen die Temperatur. Konzentrieren Sie die Peptid-HLA-Lösung auf 0,2 Millimolar und Kristallisationspuffer durch Zentrifugation bei 3.000 g in einem Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewicht von 10 Kilodalton. Bereiten Sie eine 0,1 millimolare Lösung von eins zu eins TCR und Peptid HLA für die Co-Komplex-Kristallisation vor.

Bereiten Sie mit einem Kristallisationsroboter und einem Screening-Kit Kristallisationsversuche mit der sitzenden Drop-Technik in einer 96-Well-Platte vor. Mit 60 Mikrolitern Kristallisationspuffer in jedem Reservoir, und jeder Tropfen besteht aus je 200 Nanolitern Proteinlösung und Puffer. Züchten Sie die Kristalle bei 18 Grad Celsius.

Bewerten Sie Kristalle unter einem Mikroskop nach 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und dann wöchentlich. Sobald Einkristalle von ausreichender Qualität gewachsen sind, ernten Sie die Einkristalle mit einem kryogenkompatiblen Kreislauf und lagern Sie die Kristalle in flüssigem Stickstoff. Führen Sie Synchrotron-Röntgenbeugung unter einem Strom von Stickstoffgas bei 100 Kelvin durch, analysieren Sie die Daten und lösen Sie die Strukturen mit der entsprechenden Software.

Berechnen Sie die Kontakte, die Oberflächenkomplementarität und den Kreuzungswinkel aus den gelösten Strukturen. Mit diesen Methoden wurden TCR- und Peptid-HLA-Moleküle exprimiert und in eine lösliche Form zurückgefaltet. Das Peptid in den Peptid-HLA-Molekülen war das gp100-Antigen.

SPR wurde verwendet, um die Bindungsaffinität des PMEL17 TCR für das Antigen bei verschiedenen Temperaturen zu bestimmen. SPR und isotherme kalorimetrische Titration wurden dann beide verwendet, um die thermodynamischen Parameter der Protein-Protein-Wechselwirkung zu bestimmen. Der PMEL17 TCR A2-YLE-9V-Komplex wurde kristallisiert und mittels Synchrotron-Röntgenbeugung ausgewertet.

Sowohl die TCR-CDR-Schleifen als auch die Peptid-HLA-Reste, die durch das TCR-Protein kontaktiert werden, wurden identifiziert und die Art der Kontakte untersucht. Auch Peptid-HLA-Moleküle mit mutierten Formen des Peptids wurden auf diese Weise aufgereinigt und kristallisiert. Es sollten strukturelle Unterschiede untersucht werden, die Bindungsinteraktionen mit TCR verhindern könnten.

Es wurde festgestellt, dass die Mutation des dritten oder fünften Rests die Position von Prolin vier signifikant verändert, was viele der Kontakte mit der TCR CDR-3 Alpha-Schleife stören würde. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, nur die reinsten Proteine für die weitere Analyse auszuwählen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Peptid-HLA-Tetramer-Färbung, unter Verwendung der löslichen Proteine durchgeführt werden, um antigenspezifische T-Zellen aus dem Blut des Patienten für die Diagnostik und weitere Analyse zu isolieren.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der T-Zell-Immunologie, um die HLA-Bindung von TCR-Peptiden im Detail zu erforschen und so die Entwicklung neuer Medikamente gegen Krebs und andere menschliche Krankheiten zu ermöglichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie TCR- und Peptid-HLA-Proteine von ausreichender Qualität für die Durchführung biophysikalischer und struktureller Analysen generieren können.