Name: Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Lernen Sie die Herstellung löslicher T-Zell-Rezeptor- und Peptid-HLA-Proteine für biophysikalische und strukturelle Analysen. Diese Methode liefert hochaufgelöste mechanistische Daten zur T-Zell-Aktivierung.

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BM wird von einem Cancer Research UK PhD studentship unterstützt. AG wird von einem Life Science Research Network Wales PhD studentship unterstützt. VB wird von einem Krebsforschungs Wales PhD studentship unterstützt. DKC ist ein Wellcome Trust Forschung Career Development Fellow (WT095767). AKS ist ein Investigator Wellcome Trust. GHM wird von einem Joint Life Science Research Network Wales und Tenovus Cancer Care PhD Studentship finanziert. Wir danken dem Personal an der Diamond Light Source für Einrichtungen und Unterstützung.

1. Protein Expression <ol><li> Machen Genkonstrukte für die Erzeugung von löslichen TCRs und pHLAs, wie zuvor 17 im Detail beschrieben, 18. Entwerfen jedes Konstrukt mit einer 5&#39;-BamH1 und einem 3&#39;-EcoR1-Restriktionsstelle zur Insertion in den Vektor pGMT7. </li><li> Transformation E. coli Rosetta (DE3) pLysS mit einem pGMT7 stamm Plasmidvektor die Sequenz , codierend das Protein von Interesse durch Inkubieren von 1 &amp; mgr; l von 50-200 ng / &amp; mgr; l Plasmid mit 5 &amp; mgr; l von E. coli für 5 min bei 4 ° C enthält , , 2 min bei 42 ° C und 5 min bei 4 ° C, und die Platte über Nacht bei 37 ° C auf einer LB-Agarplatte, supplementiert mit 50 mg / L Carbenicillin geführt. </li><li> Pick einzelne Kolonien und wachsen bei 37 ° C und 220 rpm in 30 ml TYP Medium (16 g / l Trypton, 16 g / l Hefeextrakt und 5 g / L HK 2 O 4) , supplementiert mit 100 uM Carbenicillin , bis die Suspension erreicht eine optische density (OD 600) zwischen 0,4 und 0,6. </li><li> Induzieren die Proteinproduktion in einem 5 ml Aliquot durch Einführung von 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) für 3 h. Halten 20 &amp; mgr; l Suspension mit und ohne Induktion für Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) -Analyse und färben das Gel. </li><li> Hinzufügen Starterkulturen zu 1 l TYP supplementiert mit 100 uM Carbenicillin und wachsen Zellen , wie oben in Schritt 1.3 beschrieben , bis die Suspension eine OD 600 zwischen 0,4 und 0,6 erreicht. </li><li> Induce Proteinexpression für 3 Stunden mit 0,5 mM IPTG. Zentrifugieren Sie die Zellen für 20 Minuten bei 3000 × g und gießen Sie den Überstand vorsichtig ab. </li><li> Auflösen des Pellets in 40 ml Lysepuffer (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM Magnesiumchlorid, MgCl 2; 150 mM NaCl; 10% Glycerin), beschallen auf Eis für 30 min bei 60% Leistung ein 2 - s - Intervall unter Verwendung von und für 30 min mit 0,1 g / l DNase bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. </li><li> Behandeln Sie die suspension die Proteine ​​in Form von inclusion bodies (IB) mit 100 ml Waschpuffer, enthaltend (0,5% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl und 10 mM EDTA). </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe für 20 Minuten bei 4 ° C und 8000 xg und gießen Sie den Überstand vorsichtig ab. Resuspendieren des Pellets in 100 ml Resuspension Puffer (50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl und 10 mM EDTA, pH 8,1), zentrifugieren wie bisher bei 8000 xg, und der Überstand vorsichtig abgießen. </li><li> Schließlich lösen sich die Pellets in 10 ml Guanidin-Puffer (6 M Guanidin, 50 mM Tris, pH 8,1; 2 mM EDTA, pH 8,1, und 100 mM NaCl) und die Proteinkonzentration bei 280 nm gemessen werden unter Verwendung eines Spektrophotometers. </li></ol> 2. pHLA und TCR Neufaltung <ol><li> Für die pHLA faltet, 30 mg von HLA-A2 mischen (oder HLA-A2 mit einem Biotin-Tag) IBs wurden 30 mg &amp; bgr; 2m IBs und 4 mg Peptid für 30 min bei 37 ° C in einem Wasserbad in einem Endvolumen von 6 ml Guanidin-Puffer mit 10 mM Dithiothreitol(DTT). </li><li> Initiieren Proteinrückfaltungs durch die vorherige Mischung in 1 l einer vorgekühlten HLA Rückfaltungspuffer verdünnt (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM L-Arginin, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM Cysteamin und 4 mM Cystamin). </li><li> Lassen Sie das HLA refold bei 4 ° C für 3 h gerührt und dann gibt sie in eine 12,4 kDa MWCO (Molekulargewicht cut-off) Dialyseschlauch und dialysiere zweimal für 24 h gegen 20 l 10 mM Tris, pH-Wert 8,1. </li><li> Für die TCR faltet, für 30 min bei 37 ° C in einem Wasserbad in 6 ml Guanidin-Puffer, ergänzt mit 10 mM DTT 30 mg der TCR α-Kette IBs und 30 mg der TCR β-Kette IBs mischen. </li><li> Initiieren Proteinrückfaltungs durch das denaturierte TCR Mischung in 1 l einer vorgekühlten TCR Rückfaltungspuffer verdünnt (50 mM Tris, pH 8,1, 2,5 M Harnstoff, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM Cysteamin und 4 mM Cystamin) für 3 h. </li><li> Übertragung der Rückfaltungs in eine 12,4-kDa MWCO Dialyseschlauch und dialysieren zweimal für 24 h gegen 20 l 10 mM Tris, pH 8,1. </li><li> Filter sowohl die pHLA oder TCR refJährigen ein 0,45-um-Membranfilter für die Reinigungsschritte verwendet wird. </li></ol> 3. Reinigung durch Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) <ol><li> Laden des gefilterten Rückfaltungs Zubereitung (entweder pHLA oder TCR) auf eine 7,9 ml, 50 &amp; mgr; m Anionenaustauscherharzsäule voräquilibriert mit 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 auf einer flexiblen und intuitive Chromatographiesystem. </li><li> Eluieren des Proteins mit 5 ml / min mit einem Salzgradienten (0-500 mM NaCl in 10 mM Tris, pH 8,1, über 8 Säulenvolumina) und sammle 1-ml-Fraktionen. </li><li> Analysieren Sie die Fraktionen an das Protein von Interesse durch SDS-PAGE entspricht, bündeln die Fraktionen, die das Protein von Interesse enthält, zusammen und konzentrieren sie mit 10-kDa MWCO bis 500 &amp; mgr; l um 20 oder 10 kDa MWCO 4 durch Zentrifugation für 20 min bei 4000 · g die durch~~POS=TRUNC verwerfen. </li><li> Legen Sie die konzentrierte Proteinpräparate in eine 2 ml Injektionsschleife auf eine 24 ml Grßenausschlußchromatographie Säule mit dem App-Pre ins Gleichgewicht gebrachtropriate Elutionspuffer: phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA und 0,005% Tensid) oder Kristall-Puffer (10 mM Tris, pH 8,1, und 10 mM NaCl ). </li><li> Eluieren der Proteine ​​mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min über 1 Säulenvolumen; sammeln 1 ml Fraktionen, die das Protein von Interesse nachgewiesen durch SDS-PAGE enthält. HINWEIS: Diese Methoden verwendet löslichen Pmel17 TCR und gp100 TZR zu erzeugen, sowie alle der pHLAs in dieser Studie verwendet: HLA-A * 0201 mit YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A) oder YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). </li></ol> 4. Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Analyse <ol><li> Führen Gleichgewichts-Bindungsanalyse oder thermodynamischen Analyse eine molekulare Wechselwirkung Analysesystem , ausgestattet mit einem CM5 - Sensorchip 19 verwendet wird . </li><li> Aktivieren Sie den CM5-Chip von fgende ein 1: 1-Mischung aus 100 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 400 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) für 10 min bei einer Flussrate von 10 &amp; mgr; l / min und bei 25 &amp; deg; C. </li><li> Last ca. 5.000 Antworteinheiten (RU) von Streptavidin (110 &amp; mgr; l von 200 &amp; mgr; g / ml in 10 mM Acetat, pH 4,5) durch kovalente Verknüpfung mit der Chipoberfläche in allen vier Strömungszellen und Verwendung von 100 &amp; mgr; l 1 M Ethanolaminhydrochlorid zu desaktivieren alle verbleibenden reaktiven Gruppen. </li><li> Paar etwa 500-600 RU von pHLA, bei ~ 1 &amp; mgr; M in kommerziellen Puffer (vom Hersteller geliefert), an den CM5-Sensorchip mit einer langsamen Flussgeschwindigkeit von 10 &amp; mgr; l / min eine gleichmäßige Verteilung auf der Chipoberfläche zu gewährleisten. </li><li> Tränken Sie den Chipoberfläche mit 1 mM Biotin in kommerziellen Puffer (vom Hersteller zur Verfügung gestellt) für 60 s. </li><li> Injizieren zehn serielle Verdünnungen der löslichen TCRs über den entsprechenden Strömungszellen mit einer hohen Strömungsrate von 30 &amp; mgr; l / min bei 25 ° C. </li><li> Berechnen Sie die Gleichgewichtsbindungskonstante(K D (E)) -Werten unter Verwendung eines nichtlinearen Kurvenanpassung (y = (P1x) / (P2 + x)) 20. HINWEIS: y = Antworteinheiten, x = Analyst Konzentration, P1 = r max, P2 = K D. </li><li> Führen Kinetik - Analyse eine 1 unter der Annahme: 1 Langmuir Bindung und passen Sie die Daten mit Hilfe eines global-Fit - Algorithmus in der Software - Paket 2. </li><li> Führen Thermodynamik Experimente durch diese Methode bei folgenden Temperaturen zu wiederholen: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C und 30 ° C 19. </li><li> Verwenden Sie die K D von SPR ermittelten Werte bei verschiedenen Temperaturen &amp; Delta; G ° unter Verwendung der Standard - thermodynamischen Gleichung (&amp; Delta; G ° = -RTlnK D) 19 zu berechnen. HINWEIS: R = Gaskonstante, T = Temperatur in K, ln = natürlicher Logarithmus. </li><li> Berechnen Sie die thermodynamischen Parameter entsprechend der Gibbs-Helmholtz - Gleichung (&amp; Delta; G ° = AH - TΔS °) 19. </li&gt; <li> Zeichnen Sie die freien Bindungsenergien, &amp; Delta; G ° (&amp; Delta; G ° = -RTlnK D), gegen die Temperatur (K) eine nicht - lineare Regression unter Verwendung der Drei-Parameter - Gleichung passen (y = &amp; Delta; H + ACp * (x-298) -x * ΔS- x * &amp; Delta; Cp * ln (x / 298)) 19. HINWEIS: y = Temperatur in K, x = &amp; Dgr; G °. </li></ol> 5. Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) <ol><li> Führen ITC Experimenten eine isotherme Titrationskalorimeter verwenden. Injizieren 30 uM pHLA in das Kalorimeter Zelle und Last 210 uM löslichen TCR in die Spritze. Verwenden Sie die folgenden Pufferbedingungen: 20 mM Hepes (pH 7,4), der 150 mM NaCl. </li><li> Führen TCR 20 Injektionen, die jeweils aus einem 2 &amp; mgr; l Volumen. Berechnen &amp; Delta; H und K D analytische Software. </li></ol> 6. Die Kristallisation, Diffraction Data Collection und Modellpflege <ol><li> Führen Sie Kristallisationsversuche einen Kristallisations Roboter. </li><li> Wachsen Kristalle von VAPoder Diffusion bei 18 ° C über der Sitz Drop - Technik in einer 96-Well - Platte mit einem Reservoir , enthaltend 60 &amp; mgr; l Kristallisationspuffer (Mutterlauge) 21. </li><li> Konzentriere das lösliche pHLA bis etwa 10 mg / ml (0,2 mM) in Kristall Puffer in einem 10-kDa-Molekulargewicht-Cut-off Zentrifugalkonzentrator bei 3.000 xg dreht. </li><li> Für die Co-komplexe Strukturen, bei einem 1 den TCR und pHLA mischen: 1-Molverhältnis eine Proteinlösung zu erhalten, bei etwa 10 mg / ml (0,1 mM). </li><li> Mit 200 nL von pHLA allein oder das 1: 1-Molverhältnis Mischung von TCR und pHLA, bis 200 nL jeder Vorratslösung aus der Kristallisations Bildschirm einen Kristallisations Roboter und für Kristalle unter einem Mikroskop nach 24 h, 48 h erzielen, 72 h und dann einmal pro Woche. </li><li> Ernte-Einkristalle durch manuell in Kryo-Schleifen unter einem Mikroskop Montage und Kryo-kühlen sie durch Untertauchen und sie in flüssigem Stickstoff zu speichern (100 K). HINWEIS: Das Laden Kristalle nimmt ein wenig pracTice, und für die Datensammlung gut genug, die Kristalle der Entscheidung kommt mit der Erfahrung. Als Faustregel gilt: Je größer und regelmäßig den Kristall, desto besser. </li><li> Sammeln von Daten in einem Strom von Stickstoffgas bei 100 K. HINWEIS: Diese Daten können bei der Diamond Light Source (DLS) nationalen Synchrotron Wissenschaft Einrichtung in Großbritannien erworben. </li><li> Analysieren Sie die Daten , die durch die Reflexionsintensitäten mit xia2 Schätzen sowohl mit MOSFLM 22 und XDS - Pakete 23, und dann skaliert die Daten mit SCALA oder ZIELLOSES 24 und dem CCP4 Paket 25. </li><li> Lösen Sie die Strukturen mit molekularen Ersatz mit PHASER 26. </li><li> Stellen Sie das Modell mit BLÄSSHUHN 27 und verfeinern das Modell mit REFMAC5 28. </li><li> Bereiten Sie grafische Darstellungen mit PyMOL 29. </li><li> Berechnen Sie die Kontakte mit dem &quot;Kontakt&quot;Programm in dem CCP4-Paket. Verwenden Sie ein 4 Å Cut-off für van der Waals-Kontakte und eine 3.4 Å Cut-off für Wasserstoffbrückenbindungen und Salzbrücken. </li><li> Berechnen Oberflächenkomplementarität die &quot;SC&quot; Programm in der CCP4-Paket. </li><li> Berechnen der Kreuzungswinkel des TCR-Komplexes pHLA, wie 30 beschrieben. HINWEIS: Für diese Studie wurden die Reflexionsdaten und endgültige Modell Koordinaten mit der PDB-Datenbank hinterlegt (Pmel17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A HVE: 5EU4 und A2 -YLE-5A HVE: 5EU5). </li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder konkurrierende finanzielle Interessen.

Die Protokolle hier skizzierte einen Rahmen für die molekulare und zelluläre Dissektion von T-Zellantworten in Zusammenhang mit jeder menschlichen Krankheit. Obwohl Krebs der Schwerpunkt dieser Studie war es , wir haben sehr ähnliche Ansätze verwendet , um T-Zell - Antworten auf Viren 32, 33, 34, 35, 36, 37 und während der Autoimmunität 38, 39, 40 zu untersuchen. Weiterhin haben wir diese Techniken im weiteren Sinne zu verstehen , die molekularen Grundlagen verwendet , die T-Zell - Antigenerkennungs 2 regeln, 19, 41, 42. Tatsächlich auf die Unvorhersehbarkeit der Modifikationen Reste-Peptid, auch diejenigen,außerhalb der der TCR Kontaktreste, hat Auswirkungen auf T-Zellerkennung wichtige Implikationen für den Entwurf von heteroklitischen Peptiden. Diese Erkenntnisse haben direkt mit der Entwicklung von neuen T-Zelltherapien beigetragen, einschließlich Peptidvakzinen 6, 43 und künstliche hochaffinen TCRs 3, 4, 5, 20, 44, sowie der verbesserten Diagnostik 45, 46, 47. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls Die Erzeugung eines hochreinen, funktionelles Protein ist für alle der in diesem Dokument beschriebenen Methoden. Technische Änderungen und Fehlersuche Schwierigkeiten beziehen sich hochreines Protein erzeugen häufig zur Expression von hochiges, unlösliche IBs aus dem E. coli - Expressionssystem. Üblicherweise Modifizieren der Expression Protokoll (beispielsweise bei unterschiedlichen optischen Dichten Induzieren verschiedene E. coli - Stämme verwendet, oder unter Verwendung verschiedener Medien Formationen) löst diese Probleme. Einschränkungen der Technik Diese Techniken verwenden lösliche Proteinmoleküle (TCR und pHLA), die normalerweise an der Zelloberfläche exprimiert. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Struktur / biophysikalischen Erkenntnisse im Einklang mit zellulären Ansätzen biologische Bedeutung zu bestätigen. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / alternative Methoden Durch die Verwendung von Röntgenkristallographie und durch funktionelle Analyse begründeten Biophysik, haben wir und andere gezeigt , dass TZR spezifisch für Krebs - Epitope 48 durch niedrige Bindungsaffinitäten im Allgemeinen gekennzeichnet. Diese niedrige TCR-Affinität erklären helfen, warum T-Zellen are natürlich nicht wirksam bei Krebs zu löschen. Hochauflösende atomaren Strukturen von Komplexen zwischen Anti-Krebs-TCRs und verwandtes Tumorantigene beginnen, die molekulare Basis für diese schwache Affinität zu offenbaren. Darüber hinaus sind diese Studien nützlich für die Mechanismen zu bestimmen , die die therapeutischen Interventionen zu Grunde liegen ausgelegt , dieses Problem zu überwinden, zukünftige Verbesserungen 16 Aussaat. In dieser Studie untersuchten wir die erste Struktur eines natürlich vorkommenden αβTCR in Komplex mit einem gp100 HLA-A * 0201-restringierte Epitop Melanomen. Die Struktur, die in Kombination mit einer eingehenden biophysikalischen Untersuchung ergab die Gesamtbindungsmodus der Interaktion. Wir aufgedeckt auch einen unerwarteten molekularen Schalter, die in einer mutierten Form des Peptids aufgetreten ist , die TCR - Bindungs außer Kraft gesetzt (beurteilt Oberflächenplasmonenresonanz verwendet wird ) und CD8 + T-Zell - Erkennung (funktionelle Experimente). Es war nur möglich, diesen neuen Mechanismus der HLA-Antigen presentati nachzuweisenauf die hochauflösenden Methoden beschrieben ist. Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach dieser Technik zu meistern Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, die die Macht der Röntgenkristallographie und biophysikalische Methoden, wenn sie mit robusten Funktionsanalysen kombiniert. Mit diesen Ansätzen ist es möglich, präzise molekulare Mechanismen zu sezieren aus, die T-Zell-Antigenerkennung regeln. Tatsächlich ist es auch möglich , diesen Ansatz zu verwenden , um die Struktur von unligierte TZR zu lösen, was zeigt , wie Konformationsänderungen 49 eine Rolle bei der Antigen Diskriminierung spielen können, 50, 51. Ein besseres Verständnis der hochkomplexen und dynamischen Natur, die auch offensichtlich Auswirkungen auf die Therapie-Design hat TCR-pHLA Wechselwirkungen untermauert. Die Möglichkeit, direkt &quot;sehen&quot; die Moleküle, die therapeutisch gezielt, sowie den Effekt, dass Änderungen haben auf Antigen recognitio werdenn, wird deutlich, die Entwicklung dieser Medikamente verbessern die Zukunft. In dieser Studie zeigen wir, dass auch Änderungen in einem einzigen Peptidrest, der von einem TCR nicht stark unvorhersagbar eingreift strukturelle Änderungen an anderen Resten in der HLA-gebundene Peptid übertragen kann, die wiederum T-Zell-Erkennung drastisch verändert. Ein vollständigeres Verständnis der molekularen Mechanismen bei der Erkennung wird T-Zell-Antigen eingesetzt werden sehr vorteilhaft, wenn zukünftige Therapien für eine Vielzahl von Krankheiten beim Menschen zu entwerfen.

Röntgenkristallographie wurde und wird auch weiterhin sein, eine extrem leistungsfähige Technik, um die Art von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen zu verstehen. Durch diese Wechselwirkungen in atomarer visualisieren, ist es nicht nur möglich, die molekularen Mechanismen regeln vielen biologischen Prozessen zu verbreiten, aber es ist auch möglich, direkt Kontaktschnittstellen für einen therapeutischen Nutzen zu verändern. In Verbindung mit Techniken wie Oberflächenplasmonresonanz und isothermen Titrationskalorimetrie (um nur ein Paar), können solche Änderungen dann biophysikalisch analysiert werden, um die direkte Auswirkungen auf die Bindungsaffinität zu beurteilen, Interaktion Kinetik und Thermodynamik. Schließlich wird durch funktionelle Experimente an relevanten Zelltypen durchgeführt wird, ein detailliertes Bild von der molekularen und funktionellen Auswirkungen von Modifikationen an Rezeptor-Ligand-Interaktionen können sehr spezifische mechanistische Informationen entnommen, weitergeben. Insgesamt bieten diese Arten von Methoden, um eine atomare Auflösung Bild der Abschreckung ermöglicht<html> Digen, wie biologische Systeme funktionieren, mit den damit verbundenen Auswirkungen auf die diagnostische und therapeutische Fortschritte. Unser Labor routinemßig verwendet diese Techniken die Rezeptoren zu untersuchen, die menschliche T-Zell-Immunität gegen Krankheitserreger und Krebs, Autoimmunität in und während der Transplantation vermitteln. Hier konzentrieren wir uns auf den menschlichen CD8 + T-Zellantwort auf Krebs, vermittelt durch eine Wechselwirkung zwischen dem T-Zell - Rezeptor (TCR) und Human - Leukozyten - Antigen (HLA) -restringierten tumor-abgeleiteten Peptide (pHLA). Dies ist wichtig , weil, obwohl CD8 + T - Zellen können Krebszellen zu zielen, haben wir und andere zuvor dass TCRs suboptimal ihrer kognaten pHLA 1 binden , anti-Krebs gezeigt, 2. So haben viele Laboratorien versucht zu verändern entweder die TCR 3, 4, 5 oder 6 der Peptidligand,class = &quot;xref&quot;&gt; 7, 8 , um die Immunogenität und zu einer besseren Zielkrebszellen zu erhöhen. Jedoch sind diese Ansätze nicht immer wirksam und können schwere Nebenwirkungen haben, einschließlich off-target Toxizitäten 4, 9, 10. Weitere Untersuchungen der molekularen Mechanismen erforschen, die T-Zell-Erkennung von Krebsantigene regieren wird entscheidend sein, diese Defizite zu überwinden. In der vorliegenden Studie haben wir uns auf die Antworten gegen autologe Melanomzellen durch CD8 + T - Zellen spezifisch für ein Fragment des Antigens Differenzierung Melanozyten Glykoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, präsentiert durch HLA-A * 0201 (die am häufigsten es ausdrücklich menschlichen pHLA Klasse I). Dieses Antigen wurde für Melanome Immuntherapie eine weitgehend untersucht Ziel und hat sich als so genannte &quot;heteroklitischen&quot; Peptid in dem ein Valin Alanin ersetzt entwickeltan Ankerposition 9 11 pHLA Stabilität zu verbessern. Dieser Ansatz wurde verwendet , um die Induktion von Melanom-reaktive CTLs in vitro zu verbessern und 12 in klinischen Versuchen erfolgreich verwendet wurde. Modifikationen an Peptidreste können durch die schlechte Wirksamkeit der meisten heterolitic Peptide in der Klinik unvorhersehbare Wirkungen auf T-Zellspezifität, 6 gezeigt, 13 haben jedoch. Tatsächlich andere heteroklitischen Form von gp100 280-288, in der Peptidrest Glu3 für Ala ersetzt wurde, außer Kraft gesetzt Anerkennung durch einen polyklonalen Population von gp100 280-288 -spezifische T - Zellen 14, 15. Wir haben bereits gezeigt , dass auch geringfügige Änderungen in der Peptidankerreste können T-Zell - Erkennung in unvorhersehbarer Weise 6, im Wesentlichen 16 ändern. So konzentrierte sich die Studie auf Buildein detaillierteres Bild von ing wie CD8 + T - Zellen erkennen gp100 und wie Änderungen der Interaktion zwischen TZR und pHLA könnte diese Funktion auswirken. Hier erzielten wir hochreine, lösliche Formen von zwei TZR spezifisch für gp100 280-288 präsentiert von HLA-A * 0201 (A2-YLE), sowie die natürlichen und veränderten Formen von pHLA. Diese Reagenzien wurden verwendet, Proteinkristalle zu erzeugen, um die ternäre Atomstruktur eines humanen TCR in Komplex mit dem heteroklitischen Form von A2-YLE sowie zwei der mutanten pHLAs in unligierten Form zu lösen. Wir haben dann ein Ansatz Peptid-Scanning durch die Durchführung in eingehenden biophysikalischen Experimenten die Wirkung von Peptid-Substitutionen auf TZR zu demonstrieren. Schließlich haben wir einen genetisch veränderten CD8 + T-Zelllinie erzeugt, neu programmiert eine der A2-YLE-spezifischen TZR zum Ausdruck bringen, um funktionelle Experimente auszuführen, um die biologischen Auswirkungen der verschiedenen Peptidmodifikationen zu testen. Diese Daten zeigen, daß selbst modikationen Reste an Peptid, die außerhalb des TCR-Bindungsmotiv sind, können auf benachbarten Peptidreste unberechenbar Folgewirkungen haben, die TCR-Bindung und T-Zell-Erkennung außer Kraft setzen. Unsere Ergebnisse stellen das erste Beispiel der strukturellen Mechanismen, T-Zell-Erkennung dieses wichtigen therapeutischen Ziel für Melanome zugrunde liegen.

<table><tbody><tr><td>S.O.C. media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe New Orbit Inkubator</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain SafeStain&nbsp;</td><td>Generon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT Zentrifuge&nbsp;</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid&nbsp;</td><td>Arcos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls HD 2070&nbsp;</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanidin&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND1000&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Thermo</tr><tr><td>Peptides</td><td>Peptide Protein Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin&nbsp;</td><td>SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cysteamin &nbsp;</td><td>Fisher Cystamin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschläuche&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metricel 0,45 &mu; m Membranfilter</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA reines FPLC-System&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL Säule&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Oxoid</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore Puffer HBS&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierungskit</td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM5 Chip-Kupplungskit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>streptavidin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal VP-ITC&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon Kristallisationsroboter</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intelli-Platte&nbsp;</td><td>Art Robbins Instrumente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristallisationssiebe und Reagenzien</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Kolben&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 μm m Filter</td><td>Miller-GP, Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultrazentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP mit SW28 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 Mikroperlen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3/CD28 Dynabeads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE-Mikrokügelchen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK medium, PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TCRV&beta; mAb&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>dasatinib&nbsp;</td><td>Axon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1&beta; und TNF&alpha; ELISA&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 51Cr&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450 Microbeta-Zähler</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mit röntgenkristallographie, biophysik, und funktionelle assays zur bestimmung der mechanismen, die t-zell-rezeptor-erkennung von krebs-antigene

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Humane CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) sind dafür bekannt, dass sie eine wichtige Rolle bei der Tumorkontrolle spielen. Um diese Funktion erfüllen zu können, muss der zelloberflächenexprimierte T-Zell-Rezeptor (TCR) funktionell humane Leukozytenantigen (HLA)-restriktive tumorabgeleitete Peptide (pHLA) erkennen. Wir und andere haben jedoch gezeigt, dass die meisten TCRs suboptimal an Tumorantigene binden. Die Aufdeckung der molekularen Mechanismen, die diese schlechte Erkennung ausmachen, könnte bei der Entwicklung neuer zielgerichteter Therapien helfen, die diese Mängel umgehen. In der Tat waren die derzeitigen Therapien, denen dieses molekulare Verständnis fehlt, nicht universell wirksam. Hier beschreiben wir Methoden, die wir üblicherweise im Labor einsetzen, um zu bestimmen, wie die Art der Interaktion zwischen TCRs und pHLA die Funktionalität von T-Zellen steuert. Zu diesen Methoden gehören die Erzeugung von löslichen TCRs und pHLA und die Verwendung dieser Reagenzien für die Röntgenkristallographie, die biophysikalische Analyse und die antigenspezifische T-Zell-Färbung mit pHLA-Multimeren. Mit diesen Ansätzen und geleitet von einer Strukturanalyse ist es möglich, die Interaktion zwischen TCRs und pHLA zu modifizieren und anschließend zu testen, wie sich diese Modifikationen auf die Erkennung von T-Zell-Antigenen auswirken. Diese Erkenntnisse haben bereits dazu beigetragen, den Mechanismus der T-Zell-Erkennung einer Reihe von Krebsantigenen zu klären und könnten die Entwicklung von veränderten Peptiden und modifizierten TCRs für neue Krebstherapien steuern.

Hier beschreiben wir Methoden, die wir üblicherweise im Labor anwenden, um zu bestimmen, wie die Art der Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und Tumorantigenen, die von menschlichen Leukozyten-Antigenen präsentiert wird, die T-Zell-Funktionalität steuert; diese Methoden umfassen Proteinproduktion, Röntgenkristallographie, Biophysik und funktionelle T-Zell-Experimente.

Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lösliche Recumbinat-T-Zellen-Rezeptor- und Peptid-HLA-Proteine von ausreichender Qualität für den Einsatz in der biophysikalischen und strukturellen Analyse zu erzeugen. Diese Methode könnte helfen, Fragen im Bereich der T-Zell-Immunologie zu beantworten. Zum Beispiel, warum T-Zellen nicht robust auf Krebs reagieren?Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir extrem hochauflösende mechanistische Daten erhalten, die erklären, wie T-Zell-Rezeptoren ihre Ziele erkennen, was zu T-Zell-vermittelten Immunantworten führt. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose praktisch aller menschlichen Krankheiten, da T-Zellen eine zentrale Rolle bei den meisten Immunreaktionen spielen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Immunantwort von T-Zellen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die durch Rezeptor-Liganden-Interaktionen gesteuert werden.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es sehr schwierig ist, lösliche, aktive Proteine von ausreichender Qualität für biophysikalische und strukturelle Experimente zu erzeugen. Um das Peptid-HLA-Umfaltungsverfahren auf sechs Milliliter Guanidinpuffer mit 10 Milometer Dithiothreitol zu beginnen, fügen Sie 30 Milligramm HLA-A2-Einschlusskörper, 30 Milligramm Beta-2-M-Einschlusskörper und vier Milligramm des gewünschten Peptids von Interesse hinzu. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Verdünnen Sie dann die Mischung mit einem Liter HLA-Rückfaltpuffer, kühlen Sie sie auf vier Grad Celsius vor und rühren Sie die Mischung drei Stunden lang bei dieser Temperatur. Dialysieren Sie die Mischung zweimal gegen 20 Liter 10 millimolare Tris, pH 8,1, jeweils für 24 Stunden. Um das TCR-Refaltungsverfahren zu beginnen, fügen Sie zu sechs Millilitern Guanidinpuffer mit 10 millimolaren Dithiothreitol jeweils 30 Milligramm TCR-Alpha- und Beta-Ketten-IBs hinzu.Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und verdünnen Sie die Mischung in einem Liter vorgekühltem TCR-Rückfaltungspuffer. Rühren und dialysieren Sie das verdünnte TCR-Refold-Gemisch auf die gleiche Weise wie das Peptid-HLA-Gemisch. Beide dialysierten Refold-Gemische werden durch einen 0,45-Mikrometer-Membranfilter filtriert.Als nächstes wird eines der gefilterten Refold-Präparate auf eine 7,9 Milliliter 50-Mikrometer-Anionenaustauscherharzsäule geladen, die mit 20 Millilitern 10 Millimolar Tris, pH 8,1, voräquilibriert wurde. Eluieren Sie das Protein mit einem Salzgradienten-Puffersystem bei fünf Millilitern pro Minute. Sammeln Sie Ein-Milliliter-Fraktionen und analysieren Sie die Fraktionen mit SDS-Page.Kombinieren Sie die Fraktionen, die das gefaltete Protein enthalten. Geben Sie das Proteingemisch in einen Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewicht von 10 Kilodalton. Zentrifugieren Sie die Mischung 20 Minuten lang oder so lange wie erforderlich ist, bei 4000 mal g, um die Mischung auf 500 Mikroliter zu konzentrieren.Verwerfen Sie den Durchfluss. Formen Sie das konzentrierte Proteinpräparat in eine Zwei-Milliliter-Injektionsschlaufe und injizieren Sie das Protein auf eine 24-Milliliter-Ausschlusschromatographiesäule, die mit dem entsprechenden Elusionspuffer voräquilibriert ist. Eluieren Sie das Protein mit einem Spaltenvolumen Puffer bei 0,5 Millilitern pro Minute.Sammeln Sie Ein-Milliliter-Fraktionen, analysieren Sie die Fraktionen mit SDS-Page und kombinieren Sie die Fraktionen, die das interessierende Protein enthalten. Bereiten Sie 10 serielle Verdünnungen der TCR-Lösung in einem Konzentrationsbereich vor, der sich über das 10-fache über und das 10-fache unter dem KD der spezifischen TCR-Peptid-HLA-Wechselwirkung erstreckt, falls bekannt. Andernfalls beginnen Sie mit einer TCR-Konzentration von 200 Mikromolaren.Als nächstes aktivieren Sie einen mit carboxymethyliertem Dextran beschichteten Sensorchip, indem Sie eine Eins-zu-Eins-Mischung aus 100 Millimolar und N-Hydroxysuccinimid und 400 Millimolar EDC mit einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius über den Chip fließen lassen. Laden Sie dann 110 Mikroliter mit 200 Mikrogramm pro Milliliter Streptavidin und 10 Millimolaracetat pH 4,5 in alle vier Durchflusszellen, um die Chipoberfläche zu funktionalisieren. Deaktivieren Sie alle verbleibenden reaktiven Gruppen mit 100 Mikrolitern eines molaren Ethanolamidhydrochlorids.Als nächstes wird eine Lösung von etwa einem mikromolaren Peptid HLA in dem vom Chiphersteller bereitgestellten Puffer mit 10 Mikrolitern pro Minute über die Oberfläche des Chips fließen lassen, bis die Anzahl der Antworteinheiten um 500 bis 600 zunimmt. Sättigen Sie die Oberfläche des Chips 60 Sekunden lang mit einem Millimolar Biotin und dem vom Hersteller bereitgestellten Puffer. Injizieren Sie dann die 10 seriellen Verdünnungen der TCR-Lösung bei 30 Mikrolitern pro Minute bei 25 Grad Celsius.Berechnen Sie die Gleichgewichtsbindungskonstante und führen Sie eine Kinetikanalyse durch. Auf diese Weise wird eine Reihe von SPR-Experimenten durchgeführt, wobei nur die Temperatur variiert wird, bei der die TCR-Verdünnungen injiziert werden. Bestimmen Sie die Gleichgewichtsbindungskonstante für jede Temperatur und berechnen Sie die Gibbs-Energien und andere thermodynamische Parameter.Stecken Sie die Gibbs-Energien mit einer nichtlinearen Regressionsanpassung gegen die Temperatur. Konzentrieren Sie die Peptid-HLA-Lösung auf 0,2 Millimolar und Kristallisationspuffer durch Zentrifugation bei 3.000 g in einem Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewicht von 10 Kilodalton. Bereiten Sie eine 0,1 millimolare Lösung von eins zu eins TCR und Peptid HLA für die Co-Komplex-Kristallisation vor.Bereiten Sie mit einem Kristallisationsroboter und einem Screening-Kit Kristallisationsversuche mit der sitzenden Drop-Technik in einer 96-Well-Platte vor. Mit 60 Mikrolitern Kristallisationspuffer in jedem Reservoir, und jeder Tropfen besteht aus je 200 Nanolitern Proteinlösung und Puffer. Züchten Sie die Kristalle bei 18 Grad Celsius.Bewerten Sie Kristalle unter einem Mikroskop nach 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und dann wöchentlich. Sobald Einkristalle von ausreichender Qualität gewachsen sind, ernten Sie die Einkristalle mit einem kryogenkompatiblen Kreislauf und lagern Sie die Kristalle in flüssigem Stickstoff. Führen Sie Synchrotron-Röntgenbeugung unter einem Strom von Stickstoffgas bei 100 Kelvin durch, analysieren Sie die Daten und lösen Sie die Strukturen mit der entsprechenden Software.Berechnen Sie die Kontakte, die Oberflächenkomplementarität und den Kreuzungswinkel aus den gelösten Strukturen. Mit diesen Methoden wurden TCR- und Peptid-HLA-Moleküle exprimiert und in eine lösliche Form zurückgefaltet. Das Peptid in den Peptid-HLA-Molekülen war das gp100-Antigen.SPR wurde verwendet, um die Bindungsaffinität des PMEL17 TCR für das Antigen bei verschiedenen Temperaturen zu bestimmen. SPR und isotherme kalorimetrische Titration wurden dann beide verwendet, um die thermodynamischen Parameter der Protein-Protein-Wechselwirkung zu bestimmen. Der PMEL17 TCR A2-YLE-9V-Komplex wurde kristallisiert und mittels Synchrotron-Röntgenbeugung ausgewertet.Sowohl die TCR-CDR-Schleifen als auch die Peptid-HLA-Reste, die durch das TCR-Protein kontaktiert werden, wurden identifiziert und die Art der Kontakte untersucht. Auch Peptid-HLA-Moleküle mit mutierten Formen des Peptids wurden auf diese Weise aufgereinigt und kristallisiert. Es sollten strukturelle Unterschiede untersucht werden, die Bindungsinteraktionen mit TCR verhindern könnten.Es wurde festgestellt, dass die Mutation des dritten oder fünften Rests die Position von Prolin vier signifikant verändert, was viele der Kontakte mit der TCR CDR-3 Alpha-Schleife stören würde. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, nur die reinsten Proteine für die weitere Analyse auszuwählen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die Peptid-HLA-Tetramer-Färbung, unter Verwendung der löslichen Proteine durchgeführt werden, um antigenspezifische T-Zellen aus dem Blut des Patienten für die Diagnostik und weitere Analyse zu isolieren.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der T-Zell-Immunologie, um die HLA-Bindung von TCR-Peptiden im Detail zu erforschen und so die Entwicklung neuer Medikamente gegen Krebs und andere menschliche Krankheiten zu ermöglichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie TCR- und Peptid-HLA-Proteine von ausreichender Qualität für die Durchführung biophysikalischer und struktureller Analysen generieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Chromfreisetzungsassay eine gemeinsame Assay zum Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität, hat einige Einschränkungen. Mit Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen und menschlichen Mammakarzinom Tumorzelllinie, SKBR3, die in diesem Artikel wurde ein Impedanz-Ansatz für die Fähigkeit des Erfassens Zelltötung untersucht.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Ein Flow Cytometry-basierten zellulären Bindung Assay beschrieben wird, die in erster Linie als Screening-Instrument verwendet wird, um Verbindungen zu identifizieren, die die Bindung eines Eindringmittel beschrifteten CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) an den CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen.

Ein Flow Cytometry-basierte Assay, Verbindungen zu identifizieren, die Bindung von Eindringmittel beschriftet CXC-Chemokin-Liganden 12 an CXC-Chemokin-Rezeptor 4 stören

Dieses Papier verwendet ein Flow-Zytometrie-based Assays auf Bildschirm Bibliotheken chemische Inhibitoren für die Identifizierung von Inhibitoren und ihre Ziele, die T-Zell-Rezeptor Signalisierung beeinflussen. Die hier beschriebenen Methoden können auch für Hochdurchsatz-Screenings erweitert werden.

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der In-vivo-Lokalisierung von Antikörpern in Mäusetumor-Xenograft-Modellen vor.

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur nicht-invasiven Verfolgung von T-Zellen, die genetisch so verändert wurden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren in vivo mit einer klinisch verfügbaren Plattform exprimieren.

Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie

Hier wird ein Protokoll zur radioaktiven Markierung von Zellen mit einem Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Radioisotop, 89 Zr (t1/2 78,4 h), unter Verwendung eines gebrauchsfertigen radioaktiv markierenden Synthons, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89Zr]Zr-DBN), vorgestellt. Die radioaktive Markierung von Zellen mit [89Zr]Zr-DBN ermöglicht die nicht-invasive Verfolgung und Bildgebung von radioaktiv markierten Zellen im Körper mit PET für bis zu 7 Tage nach der...

Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung des Zelltransports: Eine Methode der radioaktiven Markierung von Zellen

Lernen Sie die Herstellung löslicher T-Zell-Rezeptor- und Peptid-HLA-Proteine für biophysikalische und strukturelle Analysen. Diese Methode liefert hochaufgelöste mechanistische Daten zur T-Zell-Aktivierung.

Mit Röntgenkristallographie, Biophysik, und funktionelle Assays zur Bestimmung der Mechanismen, die T-Zell-Rezeptor-Erkennung von Krebs-Antigene (Video) | JoVE Journal

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