Name: Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Lernen Sie die gerüstgestützte Transplantation von Inseln in die epididymale Fettauflage diabetischer Mäuse. Diese Methode demonstriert die Isolierung muriner Inseln und deren Einpflanzung auf dezellularisierte Gerüste zur Umkehrung der Hyperglykämie.

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Die Autoren danken Wei Zhang von Guanhao Biotech für die Bereitstellung der dezellularen Gerüste. Wir danken Xiao-hong Peng für die hilfreichen Diskussionen. Diese Forschung wurde finanziell unterstützt von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Projekt Nr.31322021).

Alle Experimente wurden vom Peking University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, IACUC Nr. COE-LuoY-1) genehmigt. 1. Islet Isolation <ol><li> Vorbereitung von Reagenzien und Geräten. <ol><li> Rekonstituieren Sie Collagenase P Pulver (2 U / mg) in HBSS, um eine 5 mg / ml Lösung herzustellen, und filtrieren Sie sie durch einen 0,22 μm Filter, um die Bakterien zu entfernen. 0,6 ml Aliquot-Lösungen von Collagenase P in 15-ml-konischen Röhrchen vorbereiten und bei -20 ° C aufbewahren. HINWEIS: Während des Gebrauchs wird jedes Aliquot mit HBSS verdünnt, um 6-ml-Arbeitslösungen mit Endkonzentrationen von 0,5 mg / ml oder 1 U / ml (ausreichend zur Behandlung von 3 Mäusen) zu ergeben. Die Arbeitslösung wird innerhalb von 1 h auf Eis für den sofortigen Gebrauch aufbewahrt. Die Arbeitslösung sollte nicht für einen zusätzlichen Gebrauch wiederhergestellt oder wieder eingefroren werden. </li><li> Vorbereitung der Neutralisationslösung durch Zugabe von FBS (2,5%) und P / S (1%) in HBSS; Halten Sie die Lösung auf Eis. 60 ml Neutralisationslösung auf Trea vorbereitenT 6 Mäuse </li><li> Für das Islet-Kulturmedium wird D-Glucose (7 mM), FBS (10%) und P / S (1%) zu RPMI 1640 Medium gegeben. </li><li> Autoklavieren Sie die Chirurgiegeräte bei 115 ° C für 30 min und 15 psi Druck. </li></ol></li><li> Inflation der Bauchspeicheldrüse <ol><li> 12 ml Kollagenase-Arbeitslösung, wie in Schritt 1.1.1 angegeben, für 6 Mäuse (12 Wochen alt) vorbereiten. Füllen Sie die 10 ml Spritze mit 9 ml Arbeitslösung und verbinden Sie die Spritze mit der 27 G intravenösen Nadel. Die Spritze auf Eis aufbewahren und die Lösung innerhalb von 1 h verwenden. </li><li> Euthanisieren Sie die Maus durch zervikale Versetzung. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Papiertuch, wobei der Schwanz auf den Bediener zeigt. Spray den ganzen Körper mit 70% Ethanol, so dass es völlig nass. </li><li> Machen Sie eine V-Inzision, beginnend mit dem Genitalbereich und erstreckt sich bis zum Zwerchfell, mit Sektionsscheren und Pinzetten. Falten Sie die Haut über die Brust, um die Bauchhöhle vollständig zu enthüllen. </li><li> BewegungDen Darm auf der rechten Seite der Maus und setzen die Bauchspeicheldrüse und gemeinsame Gallengang. Greifen Sie den Duodenum sorgfältig mit Pinzette und ziehen Sie ihn, bis der Gallengang straff ist ( Abbildung 1A -1 und A-2 ). </li><li> Finde die Pfortader und Gallengang in die Leber. Klemmen Sie die Pfortader und den Gallengang mit einer mikroskopischen hämostatischen Klemme. HINWEIS: Die Klemmung verhindert eine übermäßige Blutung und den Eintritt der Kollagenase in die Leber. </li><li> Während sie den Darm noch mit der Pinzette halten, finden Sie die Lage der Ampulle, die den Gallengang und den Duodenum verbindet. Setzen Sie die 27G intravenöse Nadel in den gemeinsamen Gallengang durch die Ampulle ein ( Abbildung 1B -1 und B-2 ). </li><li> Geben Sie etwa 200 μl Collagenase-Arbeitslösung an, um zu überprüfen, ob die Kanüle den ganzen Weg durch Gallengang ist. Wenn die Kollagenase-Lösung beginnt, den Kanal zu füllen ( 1 und C2 ), die Nadel befindet sich im Lumen des Kanals; Klemmen Sie das Kanalsegment, das die Nadel enthält, mit einer hämostatischen Arterie-Klemme und geben den Rest der 2-ml-Lösung mit einer langsamen und konstanten Geschwindigkeit innerhalb von 1 min ab ( Abbildung 2A- 1 , A-2 und B-1 ). HINWEIS: Wenn das Gewebe, das den Kanal umgibt, aufzublasen beginnt ( Abbildung 2B -2 ), hat sich die Nadel durch die Wand des Gallenganges gestoßen, was es notwendig macht, die Nadel neu zu positionieren und den Gallengang wieder zu kanieren. Ähnlich, wenn das Duodenum beginnt zu blasen ( Abbildung 2C -1 und C-2 ), muss die Arterie hämostatische Klemme angepasst werden und die Gallengang wieder kanüliert werden. Als die Kollagenase-Lösung die Bauchspeicheldrüse füllt, pflanzt sich das Gewebe in der Nähe des Duodenums zuerst, gefolgt von der RegioN in der Nähe des Bauchspeicheldrüsenschwanzes Die Perfusion des Pankreasschwanzes (der Milzlappen) ist wichtig, um die Islet-Ausbeute zu maximieren. </li><li> Nach dem vollständigen Aufblasen der Bauchspeicheldrüse ( Abb. 2C -1 ) schieben Sie den Darm auf die linke Seite der Maus und entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse, indem Sie am absteigenden Dickdarm beginnen. Benutze die Pinzette, um den Darm zu heben und ihn von der Pankreas mit einer anderen Pinzette zu trennen. Weiter, um die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, bis sie von der Oberseite des Magens ungebunden ist. Schließlich hebe die Bauchspeicheldrüse aus dem Bauch und schneide es von der verbleibenden Milz frei. HINWEIS: Die gesamte Trennung sollte schnell durchgeführt werden, da die Verdauung während des Entfernungsvorgangs fortgesetzt wird. </li><li> Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in eine leere 15-ml-Kegelröhre und lassen Sie sie auf Eis. Wiederholen Sie den obigen Vorgang für die verbleibenden Mäuse. Alle Bauchspeicheldrüse sollten innerhalb von 1 h weiterverarbeitet werden, um sofort nach Schritt 1.3 zu verhindern, um eine Überverdauung durch Kollagenase P zu verhindern/ Li&gt; </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig1.jpg"> Abbildung 1: Fotografien, die die Kanülierung des Gallenganges und die Perfusion der Bauchspeicheldrüse mit Kollagenaselösungen zeigen. ( A1 ) Ziehen des Duodenums, bis der Gallengang straff ist (Ampulla: die dreieckige, milchige Fläche auf der Oberfläche des Duodenums, Gallengang: die kordelartige milchige Struktur auf der Oberfläche). ( B1 ) Einsetzen der Nadel in den Gallengang von der Ampulle. ( C1 ) Aufblasen der Bauchspeicheldrüse mit der Injektion von Enzym. ( A2, B2 und C2 ) Karikaturbilder der in A1, B1 und C1 gezeigten Verfahren. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2: Fehlersuche für die Kanüle. ( A1 ) Die Nadelspitze, die in das Lumen des Gallenganges eingeführt ist. ( A2 ) Der Kanal mit Enzymlösungen gefüllt. ( B1 ) Die Nadel, die in das Lumen des Gallenganges eingeführt wurde, und die mit einem blauen Farbstoff gefüllte Leitung. ( B2 ) Aufgrund der ungeeigneten Kanülen befindet sich die Nadel unter dem Gallengang, und nach der Abgabe des blauen Farbstoffs wird nur eine aufgeblasene Kapsel beobachtet. ( C1 ) Eine erfolgreiche Kanülierung wird durch die Ausdehnung der Bauchspeicheldrüse belegt. ( C2 ) Durch unangemessenes Klemmen tritt blauer Farbstoff in den Duodenum ein und verursacht eine Dehnung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54995/54995fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="3"><li> &lt;Stark&gt; Verdauung und Reinigung von Inselchen. <ol><li> Inkubieren Sie die konischen Röhrchen, die die perfundierte Pankreas bei 37 ° C für 17 min enthalten. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Alter und Tierart variieren. </li><li> Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 7 ml Neutralisationslösung hinzufügen und die Röhrchen auf Eis stellen. </li><li> Dissoziieren Sie das Gewebe, indem Sie die Röhrchen kräftig schütteln ( z. B. 20 mal in 10 s), bis feine Gewebepartikel erhalten werden. HINWEIS: Die Ertragsausbeute ist niedrig, wenn die Bauchspeicheldrüse nicht vollständig dissoziiert. </li><li> Filtern Sie die verdauten Gewebeproben durch 0,5 mm Maschendraht, um alle nicht verdauten Gewebestücke zu entfernen. Sammeln Sie die Insel-Suspensionen in einem neuen 50-ml-Kegelrohr. </li><li> Die Röhrchen für 3 min bei 230 xg und 4 ° C zentrifugieren und den Überstand sorgfältig ausgießen, ohne die Gewebepellets zu stören. </li><li> Die Pellets von 3 Mäusen in 4 ml Polysucrose-Dichtegradienten durch Vortexen sanft oder p resuspendierenDie Aufhängung auf und ab ein paar Mal. Langsam pipettieren 4 ml HBSS an der Seite des Röhrchens an die Spitze der Polysucrose-Lösungen. HINWEIS: Die beiden Lösungen sollten gut getrennte Schichten mit einer scharfen Schnittstelle sein. HINWEIS: Der Zusatz von HBSS sollte sorgfältig durchgeführt werden, ohne den Polysucrose-Dichtegradienten am Boden zu stören. </li><li> Die Suspension für 20 min bei 900 xg und 4 ° C zentrifugieren, indem man eine sehr langsame Beschleunigungsrate auswählt. Die Zentrifugation ohne Bremse beenden ANMERKUNG: Dies ist ein Schritt, um die Inselchen aus den exokrinen Zellen zu reinigen, wobei die meisten Inseln auf die Grenzfläche zwischen den Schichten von Polysucrose und HBSS und den meisten exokrinen Zellen, die sich am Boden absetzen, wandern. </li><li> Entfernen Sie die Gesamtheit der 8-ml-Überstandslösungen mit einer großvolumigen 15-ml-Pipette. Führen Sie die Lösungen durch ein umgekehrtes 70-μm-Sieb. HINWEIS: Die Inselchen werden weiter gereinigt und durch das Sieb zurückgehalten, während die exokrinen ZellenWird durch den Filter gehen. Achtung: Der Polysucorse-Dichtegradient ist zelltoxisch; Die Filtration hilft den Inselchen, die Polysucrose loszuwerden. </li><li> 2 ml kalte Neutralisationslösung in eine 35-mm-Petrischale pipettieren. Umkehren Sie den Zellsieb nach rechts, tauchen Sie die Oberfläche ein, die die Inselchen in der Lösung hält, und schütteln Sie sanft, um die Inselchen freizugeben. </li><li> Hand-Pick die Inselchen unter einem Mikroskop mit einer 20-μL-Pipette mit einer weißen Spitze. ANMERKUNG: Die Inselchen sind gelbliche, kompakte Zelle Aggregate ( Abbildung 3A ), während das kontaminierende exokrine Gewebe oder die Zellen eine schwärzliche und lockere Struktur unter dem Sektionsmikroskop haben. </li><li> Platzieren Sie etwa 200 Inseln in einer 35-mm-Schale mit 2 ml Kulturmedium und inkubieren bei 37 ° C in einem Inkubator, der mit 5% CO 2 für 12 h versorgt wird. HINWEIS: In der Regel können 150-300 Inselchen aus einer 12-wöchigen C57BL / 6J Maus geerntet werden. Die Inseln sind anfällig für die Bildung von Aggregaten während der Kultur,Und die großen Inseln (&gt; 300 μm) sind anfällig für zentrale Nekrose ( Abbildung 1B , Inset). Schütteln Sie die Suspension gut, um die Inseln in der Schale gleichmäßig zu verteilen und das Klumpen zu reduzieren. </li></ol></li></ol> 2. Inselkultur auf dem Gerüst HINWEIS: DCS hat eine Porosität von etwa 79%, eine Dicke von etwa 0,6 mm und eine Porengröße im Bereich von 12 bis 300 μm. <ol><li> Schneiden Sie die Gerüste in 7-mm-Scheiben, tränken Sie sie in 70% Ethanol und waschen Sie sie mit HBSS. Legen Sie die Gerüste in die 24-Well-Gewebekultureinsätze. HINWEIS: Wenn frische Inseln nach der Übernachtkultur gewonnen werden, erscheinen die Inseln hell und dicht mit glatten Rändern ( Abbildung 3B ). </li><li> Stanzen Sie die Schale und sammeln Sie die Inselchen aus der Mitte der Schale mit einer 20 μl Pipette mit einer weißen Spitze. Übertragen Sie die Inselchen auf die Gerüste (250 Inselchen / Gerüst) mit einer Pipette und fügen Sie 2 ml Kulturmedium hinzuder Brunnen. Kultur die Inselchen für 12 Stunden vor der Transplantation. </li></ol> 3. Insertransplantation auf der EFP-Seite <ol><li> Diabetes-Induktion bei Empfänger-Mäusen. <ol><li> Legen Sie C57BL / 6J Mäuse (mehr als 10 Wochen alt) in einem frischen Käfig mit einer Wasserversorgung aber kein Essen. Schnell die Mäuse für 10 Stunden vor der Induktion von Diabetes. </li><li> Vorbereiten von Pufferlösungen mit pH-Werten von 4,2-4,5 durch Mischen von 0,1 M Zitronensäure mit 0,1 M Natriumcitrat. Lösen Sie STZ (10 mg / ml) in den frisch hergestellten Puffer und sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch ein 0,22 μm Filter passieren. HINWEIS: STZ ist lichtempfindlich und verliert innerhalb von 10 min die Aktivität. Immer die frische STZ-Lösung vor der Injektion vorbereiten. </li><li> Injizieren Sie jede Maus intraperitoneal mit STZ in einer Dosis von 140-150 mg / kg für jede C57BL / 6J Maus. HINWEIS: Die Dosis variiert je nach Alter und Tierart. Es wird empfohlen, eine kleine Dosierungsoptimierung durchzuführenSt für die gegebene Spezies vor Beginn des formalen Experiments. </li><li> Sammle das Schwanzvenenblut und überwache den Blutzucker mit einem Glukosemessgerät an den Tagen 2, 3 und 4 nach der STZ-Injektion. HINWEIS: Wenn die Tiere an zwei aufeinanderfolgenden Tagen hyperglykämisch (nicht-fastender Blutzucker&gt; 16,7 mM) sind, sind sie bereit für die Inseltransplantation. </li></ol></li><li> Transplantation von Inselchen zur EFP-Stelle. <ol><li> Betäubt die Mäuse mit pentobarbital intraperitoneal (50 mg / kg). Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Papiertuch, wobei der Schwanz auf den Bediener zeigt. Rasieren Sie den Bauch ausgiebig, um das Fell von der Inzisionsstelle zu entfernen. Tape down die vier Gliedmaßen und tupfen Sie die Haut komplett mit wechselnden Alkohol und Iodophor Wipes bewegt sich kreisförmig, um die Inzisionsstelle zu sterilisieren. Drapieren Sie die Maus mit einem sterilen Tuch, nur den Zugang zum Schnittbereich. Machen Sie einen 7 mm Einschnitt durch die Peritonealwand in derMittellinie, nah am Genitalbereich. HINWEIS: Alle Instrumente, die während der Operation verwendet werden, einschließlich Handschuhe, sollten steril sein. </li><li> Vorsichtig holen und entfernen Sie die EFP aus der Bauchhöhle mit Pinzette. Verbreiten Sie die EFP auf benetzte sterile Gaze. Legen Sie das Gerüst, das Inselchen enthält, auf dem EFP und falten Sie das EFP, um das Transplantat zu wickeln. Sichern Sie den direkten Kontakt zwischen den Inselchen und EFP, indem Sie das EFP mit resorbierbaren 6-0 Nahtnähten nähen. Benetzen Sie die Oberfläche des EFP mit steriler Kochsalzlösung mit einem getränkten Wattestäbchen, um zu verhindern, dass das EFP austrocknet. </li><li> Legen Sie den EFP vorsichtig wieder in die Bauchhöhle. Schließen Sie den Schnitt durch Nähen der Peritonealwand und Klemmen der Dermalschicht mit Wundclips. </li><li> Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan als Analgetikum injizieren. </li><li> 1 ml Salzlösung subkutan injizieren, um eine Austrocknung zu verhindern. </li><li> Lege die Maus in einen Käfig auf ein Heizkissen, bis sich die Maus von der Anästhesie erholt. </li><li> Überprüfen Sie die nicht-fastenden Glukose leVels zwei Tage später durch das Sammeln von Blut aus der Schwanzvene. Wenn Sie das Transplantat abholen, wiederholen Sie die oben genannten Transplantationsverfahren, ziehen Sie den EFP vorsichtig heraus, verwenden Sie 3-0 Naht, um das Ende des Fettkissens neben dem Nebenhoden zu lindern, die Blutgefäße zu verschließen, das EFP-Transplantat zu explantieren und es für die Histologie zu bewahren . ANMERKUNG: Das Explantieren der Inselchen sollte den Empfänger Mäusen hyperglykämisch innerhalb von 3 Tagen wiedergeben, was die Funktion des Transplantats bestätigt. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Pankreas-Perfusion und Verdauungszeit sind zwei Schlüsselparameter, die die Ertragsausbeute und -qualität beeinflussen. Moskalewski berichtete zuerst über die Verwendung einer rohen Kollagenase-Mischung, um gehackte Meerschweinchen-Pankreas zu verdauen 11 . Lacy et al. die Injektion von Enzymen in das Kanalsystem berichtet , die Bauchspeicheldrüse perfundieren, die die Insel Ausbeute 12 stark erhöht. Die duktale Perfusion des Enzyms ermöglicht die maximale Exposit...

Typ 1 Diabetes mellitus (T1D) ist eine autoimmune endokrine Störung, in der Inselzellen durch das Immunsystem ablatiert werden, wodurch Patienten abhängig von der Injektion von exogenem Insulin für ihr ganzes Leben sind. Das Edmonton-Protokoll stellt einen Meilenstein in klinischen Studien der Inselentransplantation dar; Inselchen wurden durch die Pfortader infundiert und an der intrahepatischen Stelle transplantiert 1 . Doch zwei Haupthindernisse - unzureichende Quellen von Spenderinseln und schlechte Inselentransplantation - verhindern den breiten Erfolg der Inselentransplantation 2 . Normalerweise müssen Inselchen von drei kadaverischen Spendern gesammelt werden, um den hyperglykämischen Zustand eines Patienten umzukehren; Dies ist auf die geringe Ausbeute an Islet-Isolationsverfahren und den Inselverlust nach der Transplantation zurückzuführen. Insbesondere, obwohl die Nachtransplantationsinseln in sauerstoffreichem Blut gebadet wurden, zeigte der direkte Kontakt mit dem Blut oft das augenblicklich blutvermittelte Entzündungsmittel(IBMIR), die den akuten Verlust der Inselchen verursachen könnten. Langfristig wird angenommen, dass der allmähliche Verlust von Inselchen bei Patienten für den Tropfen der Diabetes-Umkehrraten in den klinischen Gruppen verantwortlich war, die im ersten Jahr 90% erreichen konnten und auf 30% und 10% um 2 und 5 sanken Jahre nach der Transplantation bzw. 3 . Die Islet-Transplantation an extrahepatischen Stätten war eine attraktive Strategie, um den direkten Kontakt von Inselchen mit Blut zu reduzieren und die Transplantationen im Vergleich zur intrahepatischen Infusion an definierbare Stellen zu beschränken. In den Nierenkapseln, Augen, Muskeln, Fettpolstern und subkutanen Räumen wurden in den vergangenen Jahren Untersuchungen durchgeführt, die zeigen, dass Inselchen an diesen Standorten in der Lage sind, zu überleben und zu funktionieren, um die Normoglykämie wiederherzustellen 4 . Darüber hinaus sind die Inselchen an diesen Standorten abrufbar, was eine Biopsie oder sogar für weitere Ersatzverfahren ermöglicht. Extrahepatische sDaher zeigen sie ein großes Potential für die klinische Transplantation 5 . Biomaterialbasierte Gerüste wurden intensiv für Zelltransplantation und Tissue Engineering untersucht. Dreidimensionale (3D) Gerüste enthalten in der Regel poröse Strukturen und können als zelluläre Schablonen dienen, um räumliche Struktur / Organisation von Zellen oder als Reservoirs zu erzeugen, um die kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Cues zu ermöglichen. Gerüste wurden auch aus polymeren Materialien wie Poly (glycolid-L-lactid) 6 , Poly (dimethylsiloxan) 7 und thermoplastischem Poly (urethan) 8 hergestellt , um Inselchen im EFP zu transplantieren. Im Vergleich zur direkten Transplantation von Inselchen wurde festgestellt, dass die Verwendung von Gerüsten den Islet-Verlust verringert, indem das Auslaufen von Inselchen in den intraperitonealen Hohlraum 9 , 10 verhindert wird , was mechanischen Schutz und modu bereitstelltDie lokale entzündliche Reaktion. Die Gerüste können so entwickelt werden, um die Inselentransplantation an den Transplantationsstellen zu fördern 7 . In dieser Studie beabsichtigen wir, ein Paradigma der Inselentransplantation im EFP zu demonstrieren, das in Mäusemodellen mit einem DCS durchgeführt wird. Gerüste aus extrazellulären Matrizen haben in den letzten Jahren großes Interesse an der überlegenen Biokompatibilität und natürlicheren porösen Strukturen im Vergleich zu synthetischen Produkten. Hier beschreiben wir ein robustes Isolationsprotokoll, um Pankreasinseln mit hohen Ausbeuten von C57BL / 6J-Mäusen zu erhalten. DCSs, die aus dem Rinderpericardium verarbeitet wurden, wurden dann mit Eseln ausgesät und die Transplantate wurden in syngene diabetische Modelle in die EFP transplantiert. Die Normoglykämie bei Mäusen wurde innerhalb von 10 Tagen erreicht und bis zu 100 Tage bis zur Entfernung der Transplantate aufrechterhalten.

<table><tbody><tr><td>Präparierschere</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drahtgeflecht mit 0,5 mm Durchmesser</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Zell-Sieb</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Blutstillende Klemme für Arterien</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopische hämostatische Klemme</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämostatische Zange</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resorbierbare 6-0 PGLA-Nähte&nbsp;</td><td>JINHUAN</td><td></td><td>Mit Nadel</td></tr><tr><td>Wundclip</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Abdecktücher</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10mL Spritze</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>JINGHUAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G Nadel für intravenöse Injektion</td><td>JINGHUAN</td><td>0,45x15 RWSB</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf Röhrchen</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Unbehandelt&nbsp; Peri-Schüsseln</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m Filter</td><td>Pall</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenfüller S1</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (2-20&mu; L)</td><td>Axygen</td><td>AP-20</td><td>AXYPETTM</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s ausgewogene Salzlösung&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C14175500CP</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase P</td><td>Roche</td><td>COLLP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11879-20</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Gibco</td><td>A24940-01</td><td></td></tr><tr><td>Glukosemessgerät</td><td>Roche</td><td></td><td>ACCU-CHEK</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Sigma</td><td>V900890</td><td>VetecTM</td></tr><tr><td>Chloralhydrat</td><td>J& K</td><td>C0073</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Iodophore</td><td>Ningbo Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J, 10-12 Wochen alt</td><td>VitalRiver</td><td></td><td>Beijing, China</td></tr><tr><td>Dezellularisiertes Gerüst</td><td>Guanhao Biotec</td><td>131102</td><td>Guangzhou, China</td></tr></tbody></table>

gerüstgestützte transplantation von inseln in der epididymalen fettauflage von diabetischen mäusen

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Die Islet-Transplantation wurde klinisch als wirksam bei der Behandlung von Typ-1-Diabetes erwiesen. Allerdings kann die aktuelle intrahepatische Transplantationsstrategie akute Vollblutreaktionen hervorrufen und zu einer schlechten Inselentransplantation führen. Hier berichten wir über ein robustes Protokoll zur Transplantation von Inselchen an der extrahepatischen Transplantationsstelle - dem epididymalen Fettpolster (EFP) - bei einem diabetischen Mausmodell. Ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Inselchen mit hohen Ausbeuten von C57BL / 6J-Mäusen wird beschrieben, sowie ein Transplantationsverfahren, das durch Seeding-Inseln auf ein dezelluläres Gerüst (DCS) durchgeführt wird und sie an der EFP-Stelle in syngenen C57BL / 6J-Mäusen, die Diabetiker übertragen werden, implantiert Durch Streptozotocin. Das DCS-Transplantat, das 500 Inseln enthält, hat den hyperglykämischen Zustand innerhalb von 10 Tagen umgekehrt, während die freien Inseln ohne DCS mindestens 30 Tage benötigt werden. Die Normoglykämie wurde bis zu 3 Monate aufrechterhalten, bis das Transplantat explantiert wurde. Abschließend erhöhte DCS die Einlagerung von Inselchen in tDie extrahepatische Stelle des EFP, die leicht abgerufen werden könnte und eine reproduzierbare und nützliche Plattform für die Untersuchung der Gerüstmaterialien sowie andere Transplantationsparameter für eine erfolgreiche Insert-Engagement zur Verfügung stellen könnte.

Unsere Klemmmethode, die mit einer mikroskopischen hämostatischen Klemme durchgeführt wird, ist im Vergleich zur Naht-Ligationstechnik einfach und zeitsparend. Es dauerte etwa 4 h, um etwa 1.200 Inselchen aus 6 Mäusen zu isolieren und zu reinigen. Die frisch isolierten Inseln hatten typischerweise eine grobe Peripherie unter einem optischen Mikroskop ( Fig. 3A ). Sobald sich die Inselchen aus dem Isolationsprozeß erholten, sahen sie hell und fest und erhielt...

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Hallo zusammen, ich bin Kai Wang vom Department of Biomedical Engineering der Peking University im Labor von Dr. Lowe. Gegenwärtig werden Menschen mit Typ-1-Diabetes hauptsächlich mit Insulininjektionen behandelt, die die Insulinsekretion von Inselzellen nicht perfekt simulieren. Das Ersetzen der verlorenen Inselzellen durch den Transport von Inselzellen kann Ihnen eine stabile Blutzuckerkontrolle ohne starke Schwankungen zeigen.Die Notwendigkeit, große Mengen hochwertiger Inselzellen zu produzieren, und die schlechte Transplantationseffizienz beeinträchtigten jedoch die breite klinische Anwendung. Heute zeige ich Ihnen den Prozess der Inselisolierung und die Transplantation von gerüstgestützten Inselzellen in das Nebenhodenfettpolster von diabetischen Mäusen. Diese Schritte erfordern gute Kenntnisse der Gewebestrukturen und die geschickten Hände, um die Operation durchzuführen.Besprühen Sie den ganzen Körper mit Ethanol. Machen Sie einen V-Schnitt beginnend im Genitalbereich. Entferne den Darm durch die rechte Seite der Maus.Klemmen Sie die Pfortader und den Gallengang mit einer hämostatischen Klemme. Fassen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig mit einer Pinzette und ziehen Sie am Zwölffingerdarm, bis der Gallengang angelernt ist. Führen Sie die intravenöse Nadel durch die Ampulle in den gemeinsamen Gallengang ein.Klemmen Sie das Kanalsegment, in dem sich die Nadel befindet, mit einer ultra-hämostatischen Klemme ein. Geben Sie die kollagene Lösung langsam und konstant ab. Nach dem vollständigen Aufblasen der Bauchspeicheldrüse schieben Sie den Darm durch die linke Seite der Maus.Sie können sehen, dass der Pankreasgang vollständig aufgeblasen ist. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse, indem Sie mit dem Ende des absteigenden Dickdarms beginnen. Verwenden Sie die Pinzette, um den Darm anzuheben und ihn mit einer anderen Pinzette von der Bauchspeicheldrüse zu trennen.Fahren Sie fort, die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, bis sie sich von der Oberseite des Magens gelöst hat. Zum Schluss hebst du die Bauchspeicheldrüse aus dem Bauch und schneidest sie von der restlichen Milz frei. Legen Sie eine Bauchspeicheldrüse in die konische Röhre und geben Sie sie auf Eis.Inkubieren Sie die perfundierte Bauchspeicheldrüse. Beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von Neutralisationslösungen. Trennen Sie die beiden Suppen, indem Sie die Röhren kräftig schütteln.Filtrieren Sie die Verdauungsgewebeproben durch das Drahtgeflecht. Sammeln Sie die Inselsuspensionen in einem neuen konischen Rohr. Zentrifugieren Sie die Röhrchen.Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab, ohne die Gewebepaletten zu stören. Suspendieren Sie die Paletten mit Histopaque, indem Sie die Suspension einige Male auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie HBSS langsam an der Seite des Röhrchens entlang bis zur Oberseite der Histopaque-Lösungen.Die beiden Lösungen sollten gut getrennte Schichten mit einer scharfen Schnittstelle sein. Die Suspension 20 Minuten lang zentrifugieren. Die meisten Inselzellen werden auf die Schnittstelle der Histopaque- und HBSS-Layer migriert.Entfernen Sie die gesamten überstehenden Lösungen und leiten Sie die Lösungen durch ein umgedrehtes Sieb. Die Inselchen werden vom Sieb zurückgehalten. Tauchen Sie die Oberfläche, die die Inselchen hält, in die Lösung und schütteln Sie sie vorsichtig, um die Inseln freizugeben.Nehmen Sie die isolierten Inselzellen unter dem Mikroskop von Hand auf. Sammeln Sie Inselzellen in einer neuen Kulturschale. Wenn sich das Gewebe, das den Gallengang umgibt, aufzublähen beginnt, bedeutet dies, dass die Nadel durch die Wand des Gallengangs dringt.Es ist notwendig, die Nadel neu zu positionieren und erneut zu versuchen, den Gallengang zu kanülieren. Wenn die Lösungen die Bauchspeicheldrüse füllen, bläht sich zuerst das Gewebe in der Nähe des Zwölffingerdarms auf, gefolgt von der Region in der Nähe des Pankreasschwanzes. Wenn sich der Zwölffingerdarm aufzublähen beginnt, wie hier mit blauem Fleck gezeigt, passen Sie die Arterienklemme an und klemmen Sie den Gallengang wieder ein.Platzieren Sie die Maus in Rückenlage. Rasieren Sie den Bauch. Dann mit Iodophoren abtupfen, um die Haut zu sterilisieren.Decken Sie die Maus mit einem sterilen Tuch ab. Machen Sie einen kleinen Schnitt durch die Bauchfellwand in der Mitte in der Nähe des Genitalbereichs. Greifen Sie vorsichtig nach dem Nebenhoden-Fettpolster und ziehen Sie es aus der Bauchhöhle heraus.Verteilen Sie das Fettpolster auf einer benetzten Gaze. Platzieren Sie ein Gerüst mit Inselzellen auf dem Fettpolster und falten Sie das Fettpolster, um das Transplantat zu umwickeln. Nähen Sie das Fettpolster, um die im Fettpolster eingekapselten Inseln zu sichern.Setzen Sie das Fettpolster vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein. Schließen Sie die Maus, indem Sie die Bauchwand vernähen. Klemmen Sie die Hautschicht mit gewickelten Klammern fest.Injizieren Sie angemessene Dosen von Schmerzmitteln und Antibiotika subkutan. Die frisch isolierten Inselchen wiesen unter dem Lichtmikroskop typischerweise eine raue Peripherie auf. Nachdem sich die Inselzellen vom Isolationsprozess erholt hatten, sahen sie hell und dicht aus und erhielten eine glatte Oberfläche.Der berechnete mittlere Inseldurchmesser betrug etwa 130 Mikrometer. Die abgebremsten Gerüste sind mechanisch robust genug, um mit einer Pinzette gehandhabt zu werden. Die porösen, gerüstgestützten Inseln wurden dann auf die Oberfläche des ausgebreiteten Fettpolsters übertragen und dann von dem Fettpolster eingekapselt.In einem syngenen Transplantationsmodell kehren typischerweise 500 Inselzellen die Hypoglykämie innerhalb von 10 Tagen um. Die normale Glykämie wurde vor etwa 100 Tagen bis zur Entnahme der Transplantate aufrechterhalten. Die histologischen Untersuchungen zeigen, dass die Inselzellen revaskularisiert und vom Fettpolstergewebe und dem Gerüst umgeben waren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie mit etwas Übung die wichtigsten Schritte lernen, die mit der Isolierung und dem Transport der Insel verbunden sind. Erstens ist die Kanülierung des Gallengangs communis und die Erweiterung der Bauchspeicheldrüse der schwierigste Teil dieses Protokolls. Zweitens, verkapseln Sie das mit Inselzellen beladene Gerüst vollständig mit einem Fettpolster, da die unvollständige Verkapselung zum Scheitern der Transplantation führen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel von Mäusen. Die Zellen werden zu Pellets in den letzten Schlauch für die Transplantation der Zellen unter die Nierenkapsel verwendet konzentriert. Die Leichtigkeit dieser Technik reduziert den Stress auf die Zellen und der Maus.

Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Abdominal-solide Organtransplantationen gehören Pankreas-Transplantationen anfällig für schwere Ischämie Reperfusion Verletzungen-assoziierten Transplantat Schaden, führt schließlich zum frühen Transplantat Verlust zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt ein Modell der murinen Pankreas-Transplantation mit einer Manschette-Naht-Technik, ideal geeignet für die Analyse dieser frühen, schädlichen Schäden.

Maus-Modell für die Bauchspeicheldrüse Transplantation mit einer modifizierten Manschette-Technik

Eine Methode für die omentalis Transplantation von Inseln in einer Maus wird eingeführt. Isolierte Inseln sind mit Hydrogel vermischt und das Gemisch wird in den omentalis Beutel einer diabetischen Maus gebracht. Dann, der Blutzucker wird überwacht, und Immuno-histochemische Analyse erfolgt.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur in-vivo Validierung der Hydrogel-basierte Zelltherapie, zeigt das Beispiel der Inselversetzung. h-omentalis Matrix Inselchen füllen (hOMING) Implantation ermöglicht die Implantation einer Zelle-Hydrogel-Mischung zwischen den omentalis Schichten, in der Nähe von Blutgefäßen Engraftment in eine richtige metabolische Umgebung zu maximieren.

Intra-omentalis Islet Transplantation mittels h-omentalis Matrix Islet Füllung (hOMING)

In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Diese fettbedeckte Inseltransplantationsmethode eignet sich für den Nachweis von eingepfropften Inseln in der intraperitonealen Höhle. Insbesondere erfordert es nicht die Verwendung von Biobindemitteln oder Naht.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Hier stellen wir verfeinerte chirurgische Verfahren zur erfolgreichen Durchführung der intraportalen Inseltransplantation, einem klinisch relevanten, aber technisch anspruchsvollen chirurgischen Eingriff, bei Mäusen vor.

Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Lernen Sie die gerüstgestützte Transplantation von Inseln in die epididymale Fettauflage diabetischer Mäuse. Diese Methode demonstriert die Isolierung muriner Inseln und deren Einpflanzung auf dezellularisierte Gerüste zur Umkehrung der Hyperglykämie.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

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