Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Wir befinden uns am Molecular Oncology Research Institute des Tufts New England Medical Center. Mein Name ist Christina Lesco, und ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Rick Van. Unser Labor beschäftigt sich mit der Erforschung der chronischen myeloischen Leukämie, CML, und CML-ähnlichen Erkrankungen.

Wir modellieren diese menschliche Erkrankung in Mäusen, und zwar, indem wir das humane Onkogen mittels eines retroviralen Vektors einführen. Das Erste, was notwendig ist, um dieses humane Onkogen in Mauszellen einzubringen, ist die Herstellung des Virus selbst. Als Nächstes wird das Virus tatsächlich angereichert.

Das ist also meine Platte mit der Stammsorte, 2 9 3 T-Zellen. Ich werde das Medium mit PBS abwaschen müssen. 2 9 3 T-Zellen sind Anheftungszellen, jedoch nicht besonders stark adhäsiv, daher muss jede Bewegung sehr vorsichtig erfolgen. Nach dem Abwaschen ersetzen wir den PBS durch Trypsin.

Um die Zellen aus der Platte zu lösen, müssen wir die Platte etwa drei Minuten lang zurück in den Inkubator stellen. Nach etwa drei Minuten befinden sich die Zellen tatsächlich in Suspension. Wir werden noch einige Milliliter reguläres Medium hinzufügen.

Dies wird das Trypsin neutralisieren. An diesem Punkt pipettieren wir auf und ab, um sicherzustellen, dass alle Zellen gut in Suspension sind; anschließend überführen wir die Suspension in ein 50-ml-Röhrchen und zählen die Zellen in Gegenwart von Trypanblau unter Verwendung eines Hämozytometers manuell. Ich führe nun meine berechnete Verdünnung durch und werde danach jeweils drei mal zehn hoch sechs Zellen pro Platte aussäen.

In vier ml Medium stellen wir sicher, dass die Zellen gut ausgeplattet sind, und werden die Platten für 16 bis 18 Stunden, was gewöhnlich dem nächsten Morgen entspricht, zurück in den Inkubator stellen. Wir befinden uns nun 48 Stunden nach der GFP-Virusinfektion. Chloroquin wird verwendet, um die Aufnahme der DNA, die wir den Zellen zuführen werden, zu erhöhen.

Wir haben vorsichtig das Medium von den Zellen abgesaugt, die sich nun sanft an der Seitenwand der Platten angeheftet haben. An diesem Punkt werden wir die Platten für etwa eine Stunde wieder in die Inkubatoren zurückstellen. In der Zwischenzeit bereiten wir unsere DNA-Mischung vor, um sie auf die Zellen aufzubringen: eine, die ein Neomycin-resistentes Gen exprimiert, und eine andere, die tatsächlich GFPI exprimiert. Ich verwende XI-DNA, um die gesamte Transfektion zu kontrollieren.

Schließlich fügen wir Calciumchlorid hinzu. Die Verwendung von Calciumchlorid erhöht die Transfektionseffizienz erheblich. Eine Stunde später nehmen wir die Platten mit Chloroquin-haltigem Medium und fügen nun unsere Transfektionslösung hinzu.

Der letzte Schritt, den wir durchführen müssen, besteht darin, tatsächlich 1 ml 2x steriles HBS hinzuzufügen, während wir die H2XHBS-Lösung zugeben. Gleichzeitig müssen wir das Gefäß vortexen und dabei langsam Tropfen für Tropfen vorgehen. Dies dient dazu, Ausfällungen zu vermeiden. Anschließend verteilen wir unverzüglich 1 ml der Lösung auf die gewünschte Platte, ebenfalls tropfenweise.

An diesem Punkt sind die 2 9 3 T-Zellen sehr sensibilisiert. Aufgrund des Chloroquin-haltigen Mediums müssen Sie den gesamten Bereich abgedeckt halten und die Platten so wenig wie möglich bewegen. Beschriften Sie die Platte mit dem Konstrukt, das Sie hinzugegeben haben, und wiederholen Sie den Vorgang für das nächste Konstrukt.

Zu diesem Zeitpunkt die Platten für sieben bis elf Stunden in den Inkubator zurückstellen. Mindestens sieben, aber nicht mehr als elf Stunden, da die Zellen aufgrund des Chloroquins sehr sensibilisiert sind und wir danach das Medium wechseln müssen. Wir befinden uns nun etwa 30 Stunden nach der Transfektion.

Dies ist unsere letzte Mediumwechselung an dieser Stelle, die 293 C3T-Zellen haben Konfluenz erreicht. Auch diesmal müssen wir sehr vorsichtig sein, wenn wir das neue Medium an der Seite der Platte auftragen. Ich verwende eine 10-ml-Spritze mit einer Nadel.

Ich werde die Nadel durch einen Filter ersetzen und mische nun das Medium gut durch. An diesem Punkt haben wir unser Virus gesammelt und können es bis zur Verwendung bei minus 80 Grad lagern. Der erste Schritt besteht darin, das Virus tatsächlich anzukonzentrieren. Beim Herstellen des Virus gibt es mehrere empfindliche Schritte, wobei der erste die richtige Konzentration der 293T-Zellen ist.

Wir geben jeweils drei mal 10 hoch sechs Zellen pro Platte aus, da sie nach 18 Stunden etwa zu 80 % konfluent sein werden. Dadurch bleibt noch ausreichend Zeit zum Weiterwachsen, sodass sie 24 Stunden nach der Transfektion 100 % konfluent sein werden. Es wurde gezeigt, dass dies für eine hervorragende Virus-Titerbildung von großer Bedeutung ist.

Der nächste Schritt besteht in der Verwendung von Chloroquin, wobei Chloroquin tatsächlich die 293-Zellen sensibilisiert, und alle Mediumwechsel müssen sehr vorsichtig durchgeführt werden, damit die gesamte Schicht der 293T-Zellen nicht von der Platte abgelöst wird. Schließlich muss die DNA, die Sie zur Virusproduktion verwenden, äußerst sauber sein. Wir verwenden C-bandierte DNA.

Einmal im Besitz unseres Virus, lagern wir es bei minus 80 Grad. Normalerweise führen wir es nur einmal pro Fo durch, wodurch die Titer des Virus zweifach verringert werden. Daher bevorzugen wir es, das Virus, das wir hergestellt haben, einzufrieren und anschließend weiterzuleiten, bevor wir den eigentlichen Titer des Virus bestimmen.

Je nach Virus können wir entweder eine GFP-Expression mit dem Virus zur Verfolgung der tatsächlich infizierten Zellen haben oder eine Neomycin-Resistenz. Es ist sehr wichtig, die Virus-Titer vor der Verwendung zu bestimmen, um zwischen Experimenten oder verschiedenen Mutanten vergleichen zu können.