Name: Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung replikationsdefekter Retroviren durch transiente Transfektion von 293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Produktion viraler Stämme für die Onkogenforschung in Mausmodellen.

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<ol><li> Der Abend vor der Transformation, Platten-293T-Zellen in 3-5x10 6 Zellen / 6 cm Gewebe cultureplate. Hinweis: Wir verwenden 293T-Zellen für ihre einfache Transfektion und efficacyas Virus-produzierenden Zellen. Diese Zellen weisen einen Mangel an Verpackung des Virus sei denn, ein Helfer-Plasmid eingeführt. </li><li> Am ersten Morgen, entfernen und ersetzen Sie mit 4 ml 293T Zelle med mit 25 mM Chloroquin. Legen Sie in Inkubator für 1 Stunde. Hinweis: Die Platte sollte ca. 80% konfluent. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten Virus-machen Mischung für 2 Platten zu einer Zeit, in 5 ml Röhrchen: <ol><li> 2 x 10 mg retroviralen Plasmid-Konstrukt </li><li> 2 x 5 mg Verpackung Konstrukt (Ecopak) </li><li> 2 x 62 ml CaCl </li><li> komplette auf 1 ml mit sterilem ddH 2 O Hinweis: Während des retroviralen Plasmid kodiert das Onkogen von Interesse und ein Marker kodiert Ecopak gag-pol-env. Zusammen mit dem 293T-Zellen, werden sie erzeugen eine ecotropen Retrovirus (RV) spezifisch für Maus-Zellen, aber nicht infektiös für den menschlichen Zellen. Beide Chloroquin und CaCl 2 wurde gezeigt, dass die Transfektionseffizienz zu erhöhen. </li></ol></li><li> Add 1 ml 2x sterileHBS die Mischung tropfenweise, unter leichtem Vortexen der Röhre. </li><li> Unmittelbar fügen Sie diese Lösung, um 2 Platten, je 1 ml, sanft, Tropfen für Tropfen. </li><li> Legen Sie in Inkubator für 7 bis 11 Uhr. </li><li> Am Abend (7 bis 11 Uhr. Später), entfernen Medium, und sehr vorsichtig mit 5 ml frisch 293T Medium zu ersetzen. Legen Sie in Inkubator bis Mittag des nächsten Tages. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, da man, um aus dem Chloroquin aus den Zellen benötigt. Wenn für längere Zeit gehalten werden, ist Chloroquin giftig. Die Lösung in den Platten sieht verschwommen, durch eine sehr feine, staubförmige Fällung der Transfektion Mischung. Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Medien ändert sich mit extremen Milde zu tun, wie die Zellen wurden sensibilisiert durch die Chloroquin, und kann leicht von der Platte zu lösen. </li><li> Am nächsten Tag, 18 bis 24 Uhr. vor dem Abrufen des Virus (gegen Mittag), entfernen Medium, und sehr vorsichtig mit 3 ml frisch 293T Medium zu ersetzen. Ersetzen Sie in Inkubator O / N. </li><li> Der dritte Morgen (18 bis 24 Uhr. Höher), sanft saugen das Medium bilden die Platten mit einer 10 ml Spritze mit einer 18 G Nadel ausgestattet. Dieser Überstand enthält das Retrovirus. </li><li> Wechseln Sie die Nadel auf eine 45 mm Spritzenfilter, Invertzucker Spritze mehrmals, um die Lösung gut mischen, pass Überstand durch Filter und Aliquots in Kryoröhrchen Hinweis: Alternativ, wenn Sie machen 3 + Platten von Viren, Pool alle Überstände des gleichen Virus in eine 5 0 ml konischen Rohr. Gut mischen, dann aliquoten Überstände mit dem Retrovirus in Kryoröhrchen durch Filterung. </li><li> Das Röhrchen mit dem Virus-full Überstände werden in -80 ° C gehalten, bis verwendet. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Vier kritische Punkte sorgen für den Erfolg eines guten viralen Lager: <ol><li> Die 293T Zellen haben sich als sehr gesund, das heißt sie auf einer sehr regelmäßigen Abständen wurden aufgeteilt, wurden nie überwachsen und sind bei der optimierten Dichte von 3,5 bis 5.000.000 pro 6 cm Gewebekultur Platte ausplattiert, so dass sie eine Dichte erreichen von 80% der Platte am Morgen der Transfektion. </li><li> Die Zugabe von Chloroquin verbessert Transfektionseffizienz und anschließende Virustiter, ca. 3 - bis 5-fache, durch die...

Alle Reagenzien bei der Transfektion verwendet werden müssen sterilfiltriert (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) und steril gehalten.

produktion von replikationsdefekte retrovirus durch transiente transfektion von 293t-zellen

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Unsere Laborstudien menschlichen myeloproliferativen Erkrankungen durch solche Onkogene als Bcr-Abl-oder Wachstumsfaktor-Rezeptor-derived Onkogene (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) induziert. Wir sind in der Lage zu modellieren und zu studieren eine dem Menschen ähnliche Erkrankung in unserem Mausmodell durch die Transplantation von Knochenmarkzellen zuvor mit einem Retrovirus Ausdruck des Onkogens von Interesse infiziert. Replikationsdefekte Retrovirus-Codierung ein menschliches Onkogen und ein Marker (GFP, RFP, Antibiotika-Resistenz-Gen, etc.) wird durch eine transiente Transfektion Protokoll mit 293T-Zellen, eine humane, renale epitheliale Zelllinie durch das Adenovirus E1A Genprodukt transformiert. 293-Zellen haben die ungewöhnliche Eigenschaft, sehr transfizierbare von Calciumphosphat (CaPO 4), mit bis zu 50-80% Transfektionseffizienz leicht erreichbar. Hier, Co-Transfektion wir 293-Zellen mit einem retroviralen Vektor, das Onkogen von Interesse und ein Plasmid, das die gag-pol-env Verpackung Funktionen, wie die Single-Genom Verpackung Konstrukte kat oder PCL, in diesem Fall die Ecopak Plasmid exprimiert. Die ersten Transfektion wird durch Verwendung von Chloroquin verbessert. Die Bestände an ecotropen Virus, wie Kulturüberstand 48 Stunden gesammelt. nach der Transfektion kann bei -80 ° C gelagert werden und zur Infektion von Zell-Linien im Hinblick auf die Transformation und in vitro-Untersuchungen oder primäre Zellen, wie zB Knochenmarkszellen der Maus, die dann für die Transplantation in unserem Mausmodell verwendet werden können .

Diese Technik zeigt eine effiziente Möglichkeit, replikationsdefekte retroviralen Aktien Kodierung eines menschlichen Onkogen vorzubereiten, und anschließend zur Induktion der myeloproliferativen Erkrankung im Mausmodell verwendet.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Unser Labor untersucht myeloproliferative Erkrankungen beim Menschen, die durch Onkogene wie Bcr-Abl oder aus Wachstumsfaktorrezeptoren abgeleitete Onkogene (ZNF198-FGFR1, ...

Wir befinden uns am Molecular Oncology Research Institute des Tufts New England Medical Center. Mein Name ist Christina Lesco, und ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Rick Van. Unser Labor beschäftigt sich mit der Erforschung der chronischen myeloischen Leukämie, CML, und CML-ähnlichen Erkrankungen.Wir modellieren diese menschliche Erkrankung in Mäusen, und zwar, indem wir das humane Onkogen mittels eines retroviralen Vektors einführen. Das Erste, was notwendig ist, um dieses humane Onkogen in Mauszellen einzubringen, ist die Herstellung des Virus selbst. Als Nächstes wird das Virus tatsächlich angereichert.Das ist also meine Platte mit der Stammsorte, 2 9 3 T-Zellen. Ich werde das Medium mit PBS abwaschen müssen. 2 9 3 T-Zellen sind Anheftungszellen, jedoch nicht besonders stark adhäsiv, daher muss jede Bewegung sehr vorsichtig erfolgen. Nach dem Abwaschen ersetzen wir den PBS durch Trypsin.Um die Zellen aus der Platte zu lösen, müssen wir die Platte etwa drei Minuten lang zurück in den Inkubator stellen. Nach etwa drei Minuten befinden sich die Zellen tatsächlich in Suspension. Wir werden noch einige Milliliter reguläres Medium hinzufügen.Dies wird das Trypsin neutralisieren. An diesem Punkt pipettieren wir auf und ab, um sicherzustellen, dass alle Zellen gut in Suspension sind; anschließend überführen wir die Suspension in ein 50-ml-Röhrchen und zählen die Zellen in Gegenwart von Trypanblau unter Verwendung eines Hämozytometers manuell. Ich führe nun meine berechnete Verdünnung durch und werde danach jeweils drei mal zehn hoch sechs Zellen pro Platte aussäen.In vier ml Medium stellen wir sicher, dass die Zellen gut ausgeplattet sind, und werden die Platten für 16 bis 18 Stunden, was gewöhnlich dem nächsten Morgen entspricht, zurück in den Inkubator stellen. Wir befinden uns nun 48 Stunden nach der GFP-Virusinfektion. Chloroquin wird verwendet, um die Aufnahme der DNA, die wir den Zellen zuführen werden, zu erhöhen.Wir haben vorsichtig das Medium von den Zellen abgesaugt, die sich nun sanft an der Seitenwand der Platten angeheftet haben. An diesem Punkt werden wir die Platten für etwa eine Stunde wieder in die Inkubatoren zurückstellen. In der Zwischenzeit bereiten wir unsere DNA-Mischung vor, um sie auf die Zellen aufzubringen: eine, die ein Neomycin-resistentes Gen exprimiert, und eine andere, die tatsächlich GFPI exprimiert. Ich verwende XI-DNA, um die gesamte Transfektion zu kontrollieren.Schließlich fügen wir Calciumchlorid hinzu. Die Verwendung von Calciumchlorid erhöht die Transfektionseffizienz erheblich. Eine Stunde später nehmen wir die Platten mit Chloroquin-haltigem Medium und fügen nun unsere Transfektionslösung hinzu.Der letzte Schritt, den wir durchführen müssen, besteht darin, tatsächlich 1 ml 2x steriles HBS hinzuzufügen, während wir die H2XHBS-Lösung zugeben. Gleichzeitig müssen wir das Gefäß vortexen und dabei langsam Tropfen für Tropfen vorgehen. Dies dient dazu, Ausfällungen zu vermeiden. Anschließend verteilen wir unverzüglich 1 ml der Lösung auf die gewünschte Platte, ebenfalls tropfenweise. An diesem Punkt sind die 2 9 3 T-Zellen sehr sensibilisiert. Aufgrund des Chloroquin-haltigen Mediums müssen Sie den gesamten Bereich abgedeckt halten und die Platten so wenig wie möglich bewegen. Beschriften Sie die Platte mit dem Konstrukt, das Sie hinzugegeben haben, und wiederholen Sie den Vorgang für das nächste Konstrukt.Zu diesem Zeitpunkt die Platten für sieben bis elf Stunden in den Inkubator zurückstellen. Mindestens sieben, aber nicht mehr als elf Stunden, da die Zellen aufgrund des Chloroquins sehr sensibilisiert sind und wir danach das Medium wechseln müssen. Wir befinden uns nun etwa 30 Stunden nach der Transfektion.Dies ist unsere letzte Mediumwechselung an dieser Stelle, die 293 C3T-Zellen haben Konfluenz erreicht. Auch diesmal müssen wir sehr vorsichtig sein, wenn wir das neue Medium an der Seite der Platte auftragen. Ich verwende eine 10-ml-Spritze mit einer Nadel.Ich werde die Nadel durch einen Filter ersetzen und mische nun das Medium gut durch. An diesem Punkt haben wir unser Virus gesammelt und können es bis zur Verwendung bei minus 80 Grad lagern. Der erste Schritt besteht darin, das Virus tatsächlich anzukonzentrieren. Beim Herstellen des Virus gibt es mehrere empfindliche Schritte, wobei der erste die richtige Konzentration der 293T-Zellen ist.Wir geben jeweils drei mal 10 hoch sechs Zellen pro Platte aus, da sie nach 18 Stunden etwa zu 80 % konfluent sein werden. Dadurch bleibt noch ausreichend Zeit zum Weiterwachsen, sodass sie 24 Stunden nach der Transfektion 100 % konfluent sein werden. Es wurde gezeigt, dass dies für eine hervorragende Virus-Titerbildung von großer Bedeutung ist.Der nächste Schritt besteht in der Verwendung von Chloroquin, wobei Chloroquin tatsächlich die 293-Zellen sensibilisiert, und alle Mediumwechsel müssen sehr vorsichtig durchgeführt werden, damit die gesamte Schicht der 293T-Zellen nicht von der Platte abgelöst wird. Schließlich muss die DNA, die Sie zur Virusproduktion verwenden, äußerst sauber sein. Wir verwenden C-bandierte DNA.Einmal im Besitz unseres Virus, lagern wir es bei minus 80 Grad. Normalerweise führen wir es nur einmal pro Fo durch, wodurch die Titer des Virus zweifach verringert werden. Daher bevorzugen wir es, das Virus, das wir hergestellt haben, einzufrieren und anschließend weiterzuleiten, bevor wir den eigentlichen Titer des Virus bestimmen.Je nach Virus können wir entweder eine GFP-Expression mit dem Virus zur Verfolgung der tatsächlich infizierten Zellen haben oder eine Neomycin-Resistenz. Es ist sehr wichtig, die Virus-Titer vor der Verwendung zu bestimmen, um zwischen Experimenten oder verschiedenen Mutanten vergleichen zu können.

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Forschung

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Biology

Biologie

Um Lentiviren, sind DNA-Vektoren in humanen 293-Zellen transfiziert. Nach der Ernte und die Konzentration der Überstand wird Virustiter mittels Fluoreszenz-Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Lentivirus Produktion

Lentiviren sind eine wertvolle Recherche-Tool für die Erkundung der Genfunktion, aber Forscher möge Produktion von pantropic Lentivirus Kodierung bekannten oder vermuteten Onkogene zu vermeiden. Als Alternative stellen wir ein sicheres Protokoll für die Verwendung von ecotropen Lentivirus auf menschliche Zellen geändert, um die ecotropen Rezeptor mSlc7a1 auszudrücken.

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In diesem Protokoll beschreiben wir Produktion, Reinigung und Titration von lentiviralen Vektoren. Wir bieten ein Beispiel für lentiviralen Vektor-vermittelte Gentransfer in primär kultivierten Neuronen und Astrozyten. Unsere Verfahren können auch auf andere Bauarten...

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Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

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