Name: Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung replikationsdefekter Retroviren durch transiente Transfektion von 293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Produktion viraler Stämme für die Onkogenforschung in Mausmodellen.

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<ol><li> Der Abend vor der Transformation, Platten-293T-Zellen in 3-5x10 6 Zellen / 6 cm Gewebe cultureplate. Hinweis: Wir verwenden 293T-Zellen für ihre einfache Transfektion und efficacyas Virus-produzierenden Zellen. Diese Zellen weisen einen Mangel an Verpackung des Virus sei denn, ein Helfer-Plasmid eingeführt. </li><li> Am ersten Morgen, entfernen und ersetzen Sie mit 4 ml 293T Zelle med mit 25 mM Chloroquin. Legen Sie in Inkubator für 1 Stunde. Hinweis: Die Platte sollte ca. 80% konfluent. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten Virus-machen Mischung für 2 Platten zu einer Zeit, in 5 ml Röhrchen: <ol><li> 2 x 10 mg retroviralen Plasmid-Konstrukt </li><li> 2 x 5 mg Verpackung Konstrukt (Ecopak) </li><li> 2 x 62 ml CaCl </li><li> komplette auf 1 ml mit sterilem ddH 2 O Hinweis: Während des retroviralen Plasmid kodiert das Onkogen von Interesse und ein Marker kodiert Ecopak gag-pol-env. Zusammen mit dem 293T-Zellen, werden sie erzeugen eine ecotropen Retrovirus (RV) spezifisch für Maus-Zellen, aber nicht infektiös für den menschlichen Zellen. Beide Chloroquin und CaCl 2 wurde gezeigt, dass die Transfektionseffizienz zu erhöhen. </li></ol></li><li> Add 1 ml 2x sterileHBS die Mischung tropfenweise, unter leichtem Vortexen der Röhre. </li><li> Unmittelbar fügen Sie diese Lösung, um 2 Platten, je 1 ml, sanft, Tropfen für Tropfen. </li><li> Legen Sie in Inkubator für 7 bis 11 Uhr. </li><li> Am Abend (7 bis 11 Uhr. Später), entfernen Medium, und sehr vorsichtig mit 5 ml frisch 293T Medium zu ersetzen. Legen Sie in Inkubator bis Mittag des nächsten Tages. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, da man, um aus dem Chloroquin aus den Zellen benötigt. Wenn für längere Zeit gehalten werden, ist Chloroquin giftig. Die Lösung in den Platten sieht verschwommen, durch eine sehr feine, staubförmige Fällung der Transfektion Mischung. Hinweis: Es ist wichtig, dass alle Medien ändert sich mit extremen Milde zu tun, wie die Zellen wurden sensibilisiert durch die Chloroquin, und kann leicht von der Platte zu lösen. </li><li> Am nächsten Tag, 18 bis 24 Uhr. vor dem Abrufen des Virus (gegen Mittag), entfernen Medium, und sehr vorsichtig mit 3 ml frisch 293T Medium zu ersetzen. Ersetzen Sie in Inkubator O / N. </li><li> Der dritte Morgen (18 bis 24 Uhr. Höher), sanft saugen das Medium bilden die Platten mit einer 10 ml Spritze mit einer 18 G Nadel ausgestattet. Dieser Überstand enthält das Retrovirus. </li><li> Wechseln Sie die Nadel auf eine 45 mm Spritzenfilter, Invertzucker Spritze mehrmals, um die Lösung gut mischen, pass Überstand durch Filter und Aliquots in Kryoröhrchen Hinweis: Alternativ, wenn Sie machen 3 + Platten von Viren, Pool alle Überstände des gleichen Virus in eine 5 0 ml konischen Rohr. Gut mischen, dann aliquoten Überstände mit dem Retrovirus in Kryoröhrchen durch Filterung. </li><li> Das Röhrchen mit dem Virus-full Überstände werden in -80 ° C gehalten, bis verwendet. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
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<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
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<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Vier kritische Punkte sorgen für den Erfolg eines guten viralen Lager: <ol><li> Die 293T Zellen haben sich als sehr gesund, das heißt sie auf einer sehr regelmäßigen Abständen wurden aufgeteilt, wurden nie überwachsen und sind bei der optimierten Dichte von 3,5 bis 5.000.000 pro 6 cm Gewebekultur Platte ausplattiert, so dass sie eine Dichte erreichen von 80% der Platte am Morgen der Transfektion. </li><li> Die Zugabe von Chloroquin verbessert Transfektionseffizienz und anschließende Virustiter, ca. 3 - bis 5-fache, durch die...

Alle Reagenzien bei der Transfektion verwendet werden müssen sterilfiltriert (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) und steril gehalten.

produktion von replikationsdefekte retrovirus durch transiente transfektion von 293t-zellen

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Unsere Laborstudien menschlichen myeloproliferativen Erkrankungen durch solche Onkogene als Bcr-Abl-oder Wachstumsfaktor-Rezeptor-derived Onkogene (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) induziert. Wir sind in der Lage zu modellieren und zu studieren eine dem Menschen ähnliche Erkrankung in unserem Mausmodell durch die Transplantation von Knochenmarkzellen zuvor mit einem Retrovirus Ausdruck des Onkogens von Interesse infiziert. Replikationsdefekte Retrovirus-Codierung ein menschliches Onkogen und ein Marker (GFP, RFP, Antibiotika-Resistenz-Gen, etc.) wird durch eine transiente Transfektion Protokoll mit 293T-Zellen, eine humane, renale epitheliale Zelllinie durch das Adenovirus E1A Genprodukt transformiert. 293-Zellen haben die ungewöhnliche Eigenschaft, sehr transfizierbare von Calciumphosphat (CaPO 4), mit bis zu 50-80% Transfektionseffizienz leicht erreichbar. Hier, Co-Transfektion wir 293-Zellen mit einem retroviralen Vektor, das Onkogen von Interesse und ein Plasmid, das die gag-pol-env Verpackung Funktionen, wie die Single-Genom Verpackung Konstrukte kat oder PCL, in diesem Fall die Ecopak Plasmid exprimiert. Die ersten Transfektion wird durch Verwendung von Chloroquin verbessert. Die Bestände an ecotropen Virus, wie Kulturüberstand 48 Stunden gesammelt. nach der Transfektion kann bei -80 ° C gelagert werden und zur Infektion von Zell-Linien im Hinblick auf die Transformation und in vitro-Untersuchungen oder primäre Zellen, wie zB Knochenmarkszellen der Maus, die dann für die Transplantation in unserem Mausmodell verwendet werden können .

Diese Technik zeigt eine effiziente Möglichkeit, replikationsdefekte retroviralen Aktien Kodierung eines menschlichen Onkogen vorzubereiten, und anschließend zur Induktion der myeloproliferativen Erkrankung im Mausmodell verwendet.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Unser Labor untersucht myeloproliferative Erkrankungen beim Menschen, die durch Onkogene wie Bcr-Abl oder aus Wachstumsfaktorrezeptoren abgeleitete Onkogene (ZNF198-FGFR1, ...

Wir befinden uns am Molecular Oncology Research Institute des Tufts New England Medical Center. Mein Name ist Christina Lesco, und ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Rick Van. Unser Labor beschäftigt sich mit der Erforschung der chronischen myeloischen Leukämie, CML, und CML-ähnlichen Erkrankungen.Wir modellieren diese menschliche Erkrankung in Mäusen, und zwar, indem wir das humane Onkogen mittels eines retroviralen Vektors einführen. Das Erste, was notwendig ist, um dieses humane Onkogen in Mauszellen einzubringen, ist die Herstellung des Virus selbst. Als Nächstes wird das Virus tatsächlich angereichert.Das ist also meine Platte mit der Stammsorte, 2 9 3 T-Zellen. Ich werde das Medium mit PBS abwaschen müssen. 2 9 3 T-Zellen sind Anheftungszellen, jedoch nicht besonders stark adhäsiv, daher muss jede Bewegung sehr vorsichtig erfolgen. Nach dem Abwaschen ersetzen wir den PBS durch Trypsin.Um die Zellen aus der Platte zu lösen, müssen wir die Platte etwa drei Minuten lang zurück in den Inkubator stellen. Nach etwa drei Minuten befinden sich die Zellen tatsächlich in Suspension. Wir werden noch einige Milliliter reguläres Medium hinzufügen.Dies wird das Trypsin neutralisieren

production-replication-defective-retrovirus-transient-transfection

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Um Lentiviren, sind DNA-Vektoren in humanen 293-Zellen transfiziert. Nach der Ernte und die Konzentration der Überstand wird Virustiter mittels Fluoreszenz-Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Lentivirus Produktion

Lentiviren sind eine wertvolle Recherche-Tool für die Erkundung der Genfunktion, aber Forscher möge Produktion von pantropic Lentivirus Kodierung bekannten oder vermuteten Onkogene zu vermeiden. Als Alternative stellen wir ein sicheres Protokoll für die Verwendung von ecotropen Lentivirus auf menschliche Zellen geändert, um die ecotropen Rezeptor mSlc7a1 auszudrücken.

Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

In diesem Protokoll beschreiben wir Produktion, Reinigung und Titration von lentiviralen Vektoren. Wir bieten ein Beispiel für lentiviralen Vektor-vermittelte Gentransfer in primär kultivierten Neuronen und Astrozyten. Unsere Verfahren können auch auf andere Bauarten...

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von...

DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

Wir verwenden hier retrovirale Transduktion und Transfektion konkatemeren eine Zelllinie, die die Komponenten eines lentiviralen Vektors (LV) in der Abwesenheit von Tetracyclin Ausdruck zu erstellen. Das LV kodiert GFP und mit einem Glykoprotein, SVGmu, die spezifisch für einen Rezeptor auf dendritischen Zellen pseudotypisiert.

Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in voll funktionsfähige und stabile Trophoblasten-Stammzellen durch zehntägige Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Wir skizzieren ein 9-Tage-Protokoll für die Transduktion und Expansion von rhesus-makaken peripheren Mononuklezellen im Blut, das Zellen mit hervorragender Koexpression der Gene von Interesse in ausreichender Anzahl für Infusionsstudien zur Zellwirksamkeit ergibt.

Transduktion und Erweiterung von primären T-Zellen in neun Tagen mit Erhaltung des Zentralen Speicherphänotyps

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Erfahren Sie die Herstellung replikationsdefekter Retroviren durch transiente Transfektion von 293T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die effiziente Produktion viraler Stämme für die Onkogenforschung in Mausmodellen.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

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