Name: Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie den Zellstoffwechsel in sortierten Subpopulationen komplexer Zellgemeinschaften mit stabilem Isotopen-Tracing und Massenspektrometrie zuverlässig messen.

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Die Autoren danken Dr. Anas Kamleh für die wertvolle Hilfe bei der Optimierung der Massenspektrometrie-Methoden und Annika von Vollenhoven für die Unterstützung bei der Zellsortierung. Diese Forschung wurde von der Schwedischen Stiftung für strategische Forschung (Förder-Nr. FFL12-0220) und das Strategische Programm in der Krebsforschung (IR, RN); die Schwedische Herz-Lungen-Stiftung (CEW, HG); und Mary Kay Foundation (JW, MJ).

1. Metabolit Extraction <ol><li> Extraktion aus Gericht <ol><li> Kultur-Zellen in einer 6-Well-Platte in dreifacher Ausführung in einem stabilen Isotop Kulturmedien + dialysiert Ergänzungen (Serum oder anderen Wachstums Ergänzungen), bis die Zellen werden 75% konfluent. HINWEIS: Hier Kultur HeLa - Zellen für 48 h in RPMI mit 40% U- 13 C-Glucose und 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamin und 5% dialysiertem FBS (Fetal Bovine Serum). Dialysierter FBS wird verwendet, der mit geringem Molekulargewicht Metaboliten, um loszuwerden, die den markierten Medien kontaminieren könnten. Kultivieren von Zellen in dialysiert Ergänzung vor dem realen Experiment wird empfohlen Zellen wachsen üblicherweise in dem Medium zu gewährleisten. Zuschläge sind in 0,15 M NaCl-Lösung über Nacht unter Verwendung von Schlangenhaut Dialyseschlauch dialysiert. </li><li> Am Tag der Kulturmedien Extraktion zu verwerfen, spülen Vertiefungen zweimal mit 500 &amp; mgr; l kaltem HBSS und es dann zu verwerfen. Hinweis: Verwenden Sie hier HBSS 40% U-13 C-Glucose , da es auch in den Kulturmedien. </li><li> In 600 &amp; mgr; l 100% Methanol vorgekühlt auf Trockeneis. </li><li> Übertragen Sie die Schüssel Eis zu trocknen und Zellmaterial mit einem Zellschaber entfernen. </li><li> Sorgfältig Pipette die Zellextrakte auf einem Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C bis zur Massenspektrometrie-Analyse. </li></ol></li><li> Die Extraktion von Mock sortierten Zellen <ol><li> Kultur-Zellen in einer 100-mm-Schale in dreifacher Ausführung in einem stabilen Isotop Kulturmedien + dialysierten ergänzt. HINWEIS: Hier Kultur HeLa - Zellen für 48 h in 100 - mm - Schale , da eine hohe Anzahl von Zellen (~ 4 × 10 6) 500.000 sortierten Zellen zu erhalten , benötigt. Diese Anzahl von Zellen, HeLa-Extrakt wurde erforderlich gute Messung von Stoffwechselprodukten zu erhalten. Das Kulturmedium verwendet wurde , war RPMI , enthaltend 40% U- 13 C-Glucose und 70% U- 13 C, 15 N2-Glutamin und 5% dialysiertem FBS. </li><li> Am Tag der Extraktion, Discard Kulturmedien, spülen Brunnen with 1,5 ml warmem HBSS und es dann zu verwerfen. </li><li> Abzulösen Zellen durch Zugabe von 1,5 ml Trypsin / EDTA für 4 min bei 37 ° C. Führen Sie die folgenden Schritte in 4 ° C oder in Eis. </li><li> Deaktivieren Trypsin durch Zugabe von 3 ml eiskaltem HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) + dialysiert Ergänzung. </li><li> Sammeln Zellen in einem 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 750 × g für 3 min. </li><li> Das Pellet in HBSS + dialysiert Ergänzung + 1 mM EDTA in einer Konzentration von 1 bis 2 x 10 6 Zellen / ml, durch 40 &amp; mgr; m Zelle Siebe passieren zu einzelnen Zellen zu erhalten, und in ein 5 ml - Röhrchen. </li><li> Sortier Zellen durch Gating Zellsortierer nur für Singuletts und zentrifugieren sortierten Zellen bei 750 × g für 3 min bei 4 ° C. HINWEIS: Hier sortieren HeLa-Zellen mit einer Rate 1.000 Veranstaltungen / s, mit Instrumentendruck 27 psi und unter Verwendung einer 100 &amp; mgr; m Düse. HeLa-Zellen sind groß, so sollten sie in einem langsamen Ereignisrate und große Düse sortiert werden als intakte Pellet wie möglich zu erhalten. Halten Sie die Zellen in kalten Blöcke throughout Sortieren des Metabolismus zu verringern. Eine ausführliche Beschreibung der Sortierverfahren wird zuvor 12 beschrieben. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 50 &amp; mgr; l eiskaltem dH 2 O , um eine homogene Pellets zu erhalten , bevor Zugabe von Methanol. Zugabe von kaltem Methanol direkt zu Pellets bildet eine feste Pellet, das schwer zu resuspendieren. </li><li> Extrahieren Sie Metaboliten durch Zugabe von 540 &amp; mgr; l Methanol in Trockeneis gehalten und halten Extrakte bei -80 ° C bis zur Flüssigchromatographie - hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HRMS) Analyse. </li></ol></li><li> Die Extraktion von Zellzyklus - sortierten Zellen <ol><li> Kultur-Zellen in einer 100-mm-Schale in dreifacher Ausführung in Kulturmedien + dialysiert Ergänzungen. HINWEIS: Hier Kultur HeLa - Zellen Geminin Fucci Green (mag1-hGem) Sonde 13 , die für die Sortierung von G1 (negativ) ermöglicht und SG2M (positive) Zellen enthält. Die Zellen können in einem stabilen Isotop Tracing Medien für eine kultiviert werdens lange wie erforderlich. Hier haben wir kultiviert sie für 46 h in unmarkierten Medien, dann haben wir umgeschaltet RPMI mit 40% U- 13 C-Glucose und 70% U- 13 C, 15 N 2-Glutamin 2 h vor dem Start zu sortieren. Dies wurde getan, um in der Lage sein, die Zellzyklusphasen zu untersuchen, die eine kurze Pulsmarkierung erfordert. </li><li> Am Tag der Extraktion, Discard Kulturmedien, spülen Brunnen mit 1,5 ml warmem HBSS und es dann zu verwerfen. </li><li> Abzulösen Zellen durch Zugabe von 1,5 ml Trypsin / EDTA für 4 min bei 37 ° C. Führen Sie die folgenden Schritte in 4 ° C oder in Eis. </li><li> Deaktivieren Trypsin durch Zugabe von 3 ml eiskaltem HBSS + dialysierten ergänzen. </li><li> Sammeln Zellen in einem 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 750 × g für 3 min. </li><li> Das Pellet in HBSS + dialysiert Ergänzung + 1 mM EDTA in einer Konzentration von 1 bis 2 x 10 6 Zellen / ml, durch 40 &amp; mgr; m Zelle Siebe passieren zu einzelnen Zellen zu erhalten, und in ein 5 ml - Röhrchen. </li><li> Sortier Zellen durch den Zellsortierer gtriebs aus Schutt und Dubletts, dann für die Zellmarker von Interesse Gating und zentrifugieren sortierten Zellen bei 750 × g für 3 min bei 4 ° C. HINWEIS: Hier sortieren HeLa-Zellen mit einer Rate 1.000 Veranstaltungen / s, mit Instrumentendruck 27 psi und unter Verwendung einer 100 &amp; mgr; m Düse. Halten Sie die Zellen in kalten Blöcke im gesamten Sortier die Stoffwechselrate zu verringern. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 50 &amp; mgr; l eiskaltem dH 2 O , um eine homogene Pellets zu erhalten , bevor Zugabe von Methanol. Zugabe von kaltem Methanol direkt zu Pellets bildet eine feste Pellet, das schwer zu resuspendieren. </li><li> Extrahieren Sie die Metaboliten durch Zugabe von 540 &amp; mgr; l Methanol in Trockeneis gehalten und halten Extrakte bei -80 ° C bis LC-HRMS-Analyse. </li></ol></li></ol> 2. Massenspektrometrie-Analyse Hinweis: Hier haben wir das Protokoll zur Analyse von Zellextrakten auf einem LC-HRMS-System zu beschreiben. Jegliche metabolomics Verfahren zur Analyse von Zellextrakten verwendet werden. Kompletter SuchlaufAnalyse könnte zum Erfassen einer Vielzahl von Stoffwechselprodukten nützlich sein. <ol><li> Kalibrieren Sie das Gerät eine Massenspektrometrie Referenzkalibrierungsmischung verwendet wird. </li><li> Thaw Zellextrakten auf Eis für 30 min und Vortex für 15 s. </li><li> Transfer von 100 &amp; mgr; l des Zellextraktes auf ein Spinfilter und Zentrifuge für 10 min bei 13000 × g bei 4 ° C. </li><li> Injizieren 12,5 &amp; mgr; l des Filtrats auf das LC-HRMS-System. </li><li> Separate Metaboliten ein zwitterionischer hydrophiler Wechselwirkungen FLÜSSIGCHROMATOGRAPHIE (ZIC-HILIC) Säule (150 mm x 4,6 mm, 5 &amp; mgr; m Partikelgröße) mit einem ZIC-HILIC-Schutzsäule (20 mm × 2,1 mm) unter Verwendung einer Gradientenelution von 0,1% Ameisensäure ausgestattet Säure in Wasser (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B). Starten Sie die Gradientenelution bei 20% Lösungsmittel A und erhöhen in 17 min bis zu 80%. Aufrechterhaltung dieser Prozentsatz während 4 min mit einem Strom von 400 &amp; mgr; l min -1 und die Säulentemperatur und die Probenschale bei 23 ° C und 4 ° C. </li><li> Verwenden Sie ein instrument zur chromatographischen Trennung gekoppelt Metaboliten Detektion einer beheizten Elektrosprüh (H-ESI II) in sowohl positive als auch negative Betriebsarten als Ionisationsquelle und einen Scan Erfassungsmodus bei einem Massenauflösungsvermögen von 70.000 Full Width Half Maximum (FWHM) ( m / z 200). </li><li> Verwenden Sie Stickstoff (Reinheit&gt; 99,995%) für den Mantel Gas und Hilfsgas mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 45 und 10 au (willkürliche Einheiten), und stellen Verdampfertemperatur bei 350 ° C und der Elektrospannung bei 4 kV im positiven Modus und -3,5 kV in negativen Modus. </li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Wählen Sie eine Reihe von Metaboliten, für die Normen verfügbar sind und die zeigen eine gute Qualität Spitzen in den Proben. Gute Qualität Spitzen haben hohes Signal-Rausch-Verhältnis. Es ist wichtig, Spitzenqualität zu überprüfen und sicherstellen, dass keine falschen Isotope enthalten. Isotopen-Peaks, die in Form und / oder Retentionszeit unterscheiden, sind wahrscheinlich falsch. </li><li> Für isotopenmarkierten Proben berechnen Masse Isotopomer (MI) Fraktionen, die durch den Spitzenbereich jedes MI mit Gesamtpeakflächen aller Infarkte zu teilen. </li><li> Berechnen der markierten Kohlenstoff / Stickstoff - Fraktionen, Anreicherung von 13 C und 15 N, jeweils als <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" /> wobei n die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome (oder Stickstoffe, respectively) in dem Metaboliten und mischen ist der MI Bruchteil x. HINWEIS: Alle Berechnungen können mit Programmiersprachen durchgeführt werden. </li></ol>

<ol><li>Gregersen, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+eQTLs+in+the+human+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific eQTLs in the human immune system.</a> Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unsere Methode basiert auf dem Prinzip, dass MIDs in zellulären Metaboliten, die die &quot;Geschichte&quot; des metabolischen Aktivitäten einer Zelle widerspiegeln. Dies macht es möglich, Stoffwechselaktivitäten in Subpopulation von Zellen zu untersuchen, wie sie in der komplexen Gemeinschaft der Zellen erfolgte vor der Zellsortierung Verfahren. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich die Peakflächen von Metaboliten deutlich zwischen Extrakten von sortierten Zellen und direkte Extraktion aus der Kulturschale <sup class="xr...

Höhere Organismen enthalten komplexe Gemeinschaften von verschiedenen Zelltypen, die über komplexere Funktionen zu bringen, zusammenzuarbeiten. Zum Beispiel enthalten Tumoren nicht nur Krebszellen, sondern auch Fibroblasten, Zellen , die Blutgefäße darstellen, und oft Immunzellen infiltriert 1; Blut enthält eine komplexe Mischung von Dutzenden von Immunzellsubtypen 2; und auch kultivierte Zelllinien können aus mehreren Subpopulationen bestehen, wie beispielsweise der luminalen und basalen Subtypen von Brustkrebszellen 3. Darüber hinaus verschiedene Zelltypen, die metabolische &quot;Zusammenarbeit&quot; zeigen nebeneinander bestehen können. Beispielsweise im Gehirn, sind Astrozyten gedacht Glukose zu Laktat zu konvertieren, die &quot;gefüttert&quot; zu Neuronen ist dann , dass dieses Substrat 4 zu oxidieren; T - Lymphozyten sind in einigen Zusammenhängen abhängig von benachbarten dendritischen Zellen als eine Quelle für Cystein 5; und Krebszellen können mit asso zusammenarbeitengehörigen Fibroblasten in Tumoren 6. Um das metabolische Verhalten solcher Systeme zu verstehen, ist es wichtig, zu trennen und die Stoffwechselaktivitäten der verschiedenen Zelltypen zu messen. Bei weitem das am häufigsten verwendete Verfahren zur Abtrennung von Zelltypen ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung. Dieses Verfahren ist breit anwendbar, vorausgesetzt, dass der Zelltyp oder Zustand von Interesse kann unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern, die Expression von gentechnisch fluoreszierende Proteine ​​oder andere Farbstoffe &quot;markiert&quot; werden. Eine Möglichkeit besteht darin , zunächst getrennte Zelltypen durch einen Zellsortierer, wieder Kultur die einzelnen Zelltypen erhalten, und dann Metabolismus - Untersuchungen dieser Kulturen 7 durchführen. Dies ist jedoch nur möglich, wenn der Zelltyp oder Phänotyps in Kulturbedingungen stabil ist, und nicht die Übergangsverhalten, wie beispielsweise Zellzykluszustände noch die metabolischen Kooperation in Kokulturen erfassen kann. Für solche Fälle müssen Stoffwechsel direkt auf so gemessen werden,rtet Zellen. Das ist eine Herausforderung , da die Zelle Verfahren Sortierfächer Zellen zu Spannungen, die ihren Stoffwechsel 8 verzerren, und wir sind nur wenige Studien bewusst diesen Ansatz 9, 10. Insbesondere haben wir die Hauptmetaboliten wie Aminosäuren gefunden in Zellsortierpuffer gehalten von Zellen austreten kann, so dass die Messungen des absoluten Metabolitenfluss sind nicht mehr zuverlässig 11 (obwohl relativen Vergleich zwischen sortierten Fraktionen immer noch wertvoll sein kann). Um diese Probleme zu umgehen, wir beschriften Zellen mit stabilen Isotopen vor der Sortierung und konzentrieren sich auf die MIDs in zellulären Metaboliten, anstatt Metaboliten Abundanzen. Da MIDs über längere Zeitskalen gebildet werden, sollten sie weniger durch Sortierung Bedingungen kurzfristige Exposition. Wir quantifizieren MIDs Full-Scan-hochauflösende Massenspektrometrie, die empfindlich genug ist, da bietenta auf Hunderten von Metaboliten von rund 500.000 sortierten Zellen beginnen, was etwa 30-60 Minuten von Zellsortierung Zeit. Ein Vergleich zwischen einem &quot;mock sortiert&quot; Kontrolle (Zellen durch den Zellsortierer Instrument weitergegeben, ohne spezifische Bevölkerungs Gating) und Metaboliten Extraktion direkt aus der Kulturschale gewährleisten gemacht, dass die beobachteten MIDs sind repräsentativ für diejenigen, die in der ursprünglichen Kultur. Je nach Wahl der stabilen Isotopen Tracern können verschiedene Stoffwechselwege mit diesem Verfahren untersucht werden.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>INFLUX (inFlux v7 Sorter)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-13C-Glukose</td><td>Cambridge Isotope</td><td>40762-22-9 / GLC-018</td><td></td></tr><tr><td>U-13C,15N2-Glutamin</td><td>Cambridge Isotope</td><td>CNLM-1275-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (JT Baker), HPLC-Qualität</td><td>VWR</td><td>BAKR8402.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree - MC - VV Zentrifugalfilter. Durapore PVDF 0.1 & Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3.000 UHPLC</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC Säule (150 mm x 4,6&nbsp; mm, 5 & Mikro; m)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.50444.0001</td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC Vorsäule (20 mm x 2,1 mm)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril Optima LC-MS, Braunglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Wasser</td><td>Millipore</td><td></td><td>Hergestellt mit einem Milli-Q Gradientensystem</td></tr><tr><td>Myrsyra 99,5% Optima (Ameisensäure)</td><td></td><td>Fisher Scientific 11423423</td><td></td></tr><tr><td>X100 Schraubfläschchen 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, braun, 100</td><td>Stück Thermo Fisher scientific</td><td>10560053</td><td></td></tr><tr><td>X100 Lock Skruv Vitt PTFE Packung 8-425 (Schraubverschlüsse)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>12458636</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MSCAL5</td><td>Kalibrierkit</td></tr><tr><td>SNAKESKIN 10K MWCO&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>Mathematica v.10&nbsp;</td><td>Wolfram Forschung</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein verfahren zur messung des metabolismus in sortierter subpopulationen von komplexen zell gemeinschaften verwendung stabiler isotopen-tracing

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Säugetierzelltypen weisen einen spezialisierten Stoffwechsel auf, und es gibt zahlreiche Beweise dafür, dass verschiedene nebeneinander existierende Zelltypen in metabolischer Kooperation stehen. Darüber hinaus können selbst Kulturen eines einzigen Zelltyps Zellen in unterschiedlichen Stoffwechselzuständen enthalten, wie z. B. ruhende oder zyklische Zellen. Methoden zur Messung der metabolischen Aktivitäten solcher Subpopulationen sind wertvolle Werkzeuge zum Verständnis des zellulären Stoffwechsels. Komplexe Zellpopulationen werden am häufigsten mit einem Zellsortierer getrennt, und Subpopulationen, die mit dieser Methode isoliert wurden, können mit Metabolomik-Methoden analysiert werden. Ein Problem bei diesem Ansatz ist jedoch, dass das Zellsortierverfahren die Zellen Belastungen aussetzt, die ihren Stoffwechsel verzerren können.
Um diese Probleme zu überwinden, haben wir argumentiert, dass die Massenisotopomerverteilungen (MIDs) von Metaboliten aus Zellen, die mit stabilen isotopenmarkierten Nährstoffen kultiviert wurden, wahrscheinlich stabiler sind als absolute Metabolitenkonzentrationen, da MIDs über längere Zeiträume gebildet werden und weniger durch kurzfristige Exposition gegenüber Zellsortierbedingungen beeinflusst werden sollten. Hier beschreiben wir eine Methode, die auf diesem Prinzip basiert und die Zellsortierung mit Flüssigchromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HRMS) kombiniert. Das Verfahren umfasst die Analyse von drei Arten von Proben: (1) Metabolitenextrakte, die direkt aus der komplexen Population gewonnen werden; (2) Extrakte von "mock sortierten" Zellen, die durch das Zellsortierinstrument geleitet wurden, ohne eine bestimmte Population zu bestimmen; und (3) Auszüge aus den tatsächlich sortierten Populationen. Die simuliert sortierten Zellen werden mit der direkten Extraktion verglichen, um sicherzustellen, dass die MIDs tatsächlich nicht durch den Zellsortiervorgang selbst verändert werden, bevor die tatsächlich sortierten Populationen analysiert werden. Wir zeigen beispielhafte Ergebnisse von HeLa-Zellen, sortiert nach Zellzyklusphasen, die Veränderungen im Nukleotidstoffwechsel aufzeigen.

Als Beispiel beschreiben wir ein Experiment den Metabolismus von HeLa-Zellen Untersuchung der Zellzyklus-Phase, sortiert nach. Um eine breite Palette von zentralen Metaboliten auf beiden Kohlenstoffe und Stickstoffe beschriften, kultiviert wir Zellen für 48 Stunden unter Verwendung von U- 13 C-Glucose und U- 13 C, 15 N-Glutamin als Tracer. Um reich MIDs für die Validierung Experiment zu erhalten, haben wir hier eine Mischung aus 40% U- 13 C-Glu...

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels in komplexen Gemeinschaften mehrerer Zelltypen, wobei eine Kombination aus stabiler Isotopenverfolgung, Zellsortierung zur Isolierung spezifischer Zelltypen und Massenspektrometrie verwendet wird.

Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, mit Hilfe der Isotopenverfolgung den Metabolismus von sortierten Populationen komplexer Zellgemeinschaften zu messen. Mit dieser Methode können wir also die metabolischen Unterschiede zwischen Subpopulationen komplexer Zellgemeinschaften und auch die metabolische Zusammenarbeit zwischen diesen Subpopulationen untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir durch die Kombination von Isotopenverfolgung und Zellsortierung ein zuverlässigeres Maß für den Stoffwechsel erhalten und auch validieren können, wie zuverlässig die Methode ist.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie verschiedene Techniken kombiniert und die Art und Weise, wie Zellen behandelt werden, und die Dauer des Verfahrens den Zellstoffwechsel beeinflussen können. Für die Metabolitenextraktion aus einer Schale werden zunächst Zellen in einer Sechs-Well-Platte in einem mit stabilen Isotopen markierten Kulturmedium kultiviert, das dialysierte Zusätze enthält. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 75 % erreichen, spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit 500 Mikrolitern kaltem HBSS, das gleichmäßig markierte Glukose enthält.Geben Sie dann 600 Mikroliter 100 % vorgekühltes Methanol aus Trockeneis in jede Vertiefung und geben Sie die Platte auf das Trockeneis. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lösen, und übertragen Sie dann die Extrakte aus jeder Vertiefung vorsichtig in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Zellen bis zur massenspektrometrischen Analyse bei minus 80 Grad Celsius.Für die Metabolitenextraktion von sortierten Zellen werden Zellen in einer 100-Millimeter-Schale in markiertem Kulturmedium mit dialysierten Zusätzen kultiviert, so dass sie am Sortiertag eine Konfluenz von 75 % erreichen. Für die Impulsmarkierung von zellzyklussortierten Zellen kultivieren Sie die Zellen in unmarkiertem Medium, das dialysierte Nahrungsergänzungsmittel enthält, bis sie eine Konfluenz von 75 % erreichen. Dann markieren Sie die Zellen zwei Stunden lang mit Impulsen, indem Sie das Medium durch frisch markiertes Kulturmedium ersetzen.Spülen Sie das Gericht mit warmem HBSS aus, das gleichmäßig markierte Glukose enthält, und lösen Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius. Nach vier Minuten wird das Trypsin mit drei Millilitern eiskaltem HBSS mit markierter Glukose und dialysierten Nahrungsergänzungsmitteln deaktiviert und die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Resuspendieren Sie das Pellet in HBSS, das markierte Glukose, dialysierte Nahrungsergänzungsmittel und EDTA in einer ein- bis zweifachen Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter enthält, und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Sieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.Füllen Sie die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen und sortieren Sie sie auf einem Durchflusszytometer. Für die Metabolitenextraktion aus scheinsortierten Zellen entfernen Sie die Trümmer und sortieren nur die Singuletts. Für die Metabolitenextraktion aus zellzyklussortierten Zellen werden die Trümmer und Dubletten herausgeschliffen und die Zellen in G1 und SG2M sortiert, basierend auf der Fluoreszenz der Gemininsonde.Am Ende der Sortierung werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in 50 Mikrolitern eiskaltem destilliertem Wasser resuspendiert, um ein homogenes Pellet zu erhalten. Extrahieren Sie dann schnell die Metaboliten, indem Sie 540 Mikroliter trockeneisgekühltes Methanol hinzufügen. Lagern Sie die Probe bis zur LCMS-Analyse bei minus 80 Grad Celsius.Die Extraktion von Metaboliten aus sortierten Zellen muss im Voraus gut geplant werden, wobei die experimentellen Arbeiten so schnell wie möglich abgeschlossen werden müssen, um die metabolischen Veränderungen zu minimieren. Für die Analyse der extrahierten Metaboliten wählen Sie zunächst eine Reihe von Metaboliten mit entsprechenden verfügbaren Standards aus, die Probenpeaks von guter Qualität aufweisen. Überprüfen Sie anschließend die Qualität der Peaks und achten Sie darauf, keine falschen Isotope zu enthalten.Berechnen Sie das Massenisotop aus unseren Fraktionen für die isotopenmarkierten Proben, indem Sie die Peakfläche jedes Massenisotops aus unserer Fraktion durch die gesamten Peakflächen aller Massenisotope aus unseren Fraktionen dividieren. Berechnen Sie dann die markierten Kohlenstofffraktionen für die Anreicherung von Kohlenstoff-13 unter Verwendung der Formel für die Kohlenstoffanreicherung. Berechnen Sie abschließend die markierten Stickstofffraktionen für die Anreicherung von Stickstoff-15 unter Verwendung der Formel für die Stickstoffanreicherung.In diesem repräsentativen Experiment waren 66 aus der Datenanalyse ausgewählte Metaboliten in den mock sortierten Zellen vorhanden, von denen 60 mit ähnlichen Massenisotopen aus unseren Verteilungen zwischen den Schalenextrakten und den mock sortierten Zellen markiert zu sein schienen. Zum Beispiel ist das Massenisotop aus unserer Verteilung von Glutamat zwischen den schalen- und mock-sortierten Extrakten ähnlich, was darauf hindeutet, dass das Glutamat-Massenisotop aus unserer Verteilung auch in sortierten Zellpopulationen zuverlässig ist. Die Analyse von HELA-Zellen, die entweder in G0-, G1- oder SG2M-Zellzyklusstadien eingeteilt wurden, mit der FUCCI-Geminin-Sonde zeigt eine Cytidinmarkierung in beiden Populationen mit einer höheren Anreicherung im SG2M-Stadium, was mit einer erhöhten De-novo-Synthese von Nukleotiden während der S-Phase übereinstimmt.In diesem Experiment zeigte das Massenisotop aus unserer Verteilung das gleiche Muster in beiden zellzyklussortierten Fraktionen, was darauf hindeutet, dass derselbe Syntheseweg verwendet wird, aber im SG2M-Stadium aktiver ist, was zeigt, dass metabolische Unterschiede mit dieser Methode leicht nachweisbar sind, selbst zwischen eng verwandten Subpopulationen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Metaboliten aus sortierten Fraktionen extrahiert, und die Vorbehalte verstehen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen während der Sortierung und Metabolitenextraktion schnell zu handhaben, da die Art und Weise und die Dauer der Handhabung der Zellen ihren Stoffwechsel beeinflussen können.Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann auf andere Zelltypen angewendet werden. Zum Beispiel Immunzelluntergruppen im Blut oder verschiedene Arten von Zellen innerhalb eines Tumors, wobei eine Vielzahl von Sonden, Antikörpern oder Färbemethoden zur Sortierung verwendet werden.

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Biochemistry

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Stabile Isotope Profilierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie des Vermittlers Stoffwechselflusses ist in dem Fadenwurm...

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans</em

13 C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.

Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Die aktive Bakteriengemeinschaft mit dem Darm von Spodoptera littoralis verbunden sind, wurde von stabilen Isotopen-Probing (SIP) zu Pyrosequenzierung gekoppelt bestimmt. Mit dieser Methode wurde die Identifizierung der metabolisch aktiven Bakterienarten innerhalb der Gemeinde mit hoher Auflösung und Genauigkeit durchgeführt.

Bezeichnung des metabolisch aktiven Bakterien im Darm der Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Über DNA Stable Isotope Probing Mit<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glucose

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren, um den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen quantitativ und umfassend zu untersuchen. Dieser Workflow, basierend auf einer Kombination von isotopischen Tracer Experimente und ein Analyseverfahren ermöglicht das Schicksal der konsumierten Nährstoffe und die metabolische Herkunft der Moleküle können durch Mikroorganismen bestimmt werden.

Workflow basiert auf der Kombination der isotopischen Tracer Experimente zu untersuchen, mikrobiellen Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen

Die Fettsäure trophische Marker Ansatz, d. h. die Aufnahme von Fettsäuren als gesamte Molekül und Transfer in das Gewebe der Verbraucher ohne oder geringfügige Änderung, durch Wissenslücken im Fettsäure-Stoffwechsel der kleinen Boden Wirbellosen behindert wird. Isotopologue Profilierung dient als ein wertvolles Instrument zur trophische Interaktionen zu entwirren.

Fettsäure- 13C Isotopologue Profilierung gibt Einblick in trophische Carbon Transfer und Fettstoffwechsel der Wirbellosen Verbraucher

Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.

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Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Metaboliten in seltenen Zelltypen genau und zuverlässig zu messen. Technische Verbesserungen, darunter eine modifizierte Mantelflüssigkeit zur Zellsortierung und die Generierung relevanter Blindproben, ermöglichen eine umfassende Quantifizierung von Metaboliten mit einem Input von nur 5000 Zellen pro Probe.

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In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH), auch bekannt als Mid-Infrared Photothermal-FISH (MIP-FISH), verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren und ihren Stoffwechsel zu verstehen. Diese Methodik kann für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Kartierung des Zellstoffwechsels mit Einzelzellauflösung.

Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Dieses Protokoll integriert ein speziell angefertigtes Bioreaktorsystem mit hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie zur Messung des Pyruvatstoffwechsels in lebenden Zellen in Echtzeit und verbessert so die Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit für Stoffwechselstudien und Wirkstoffscreening-Anwendungen.

Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter 13C NMR

Erfahren Sie, wie Sie den Zellstoffwechsel in sortierten Subpopulationen komplexer Zellgemeinschaften mit stabilem Isotopen-Tracing und Massenspektrometrie zuverlässig messen.

Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing (Video) | JoVE Journal

Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing

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