Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing
February 4th, 2017
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels in komplexen Gemeinschaften mehrerer Zelltypen, wobei eine Kombination aus stabiler Isotopenverfolgung, Zellsortierung zur Isolierung spezifischer Zelltypen und Massenspektrometrie verwendet wird.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, mit Hilfe der Isotopenverfolgung den Metabolismus von sortierten Populationen komplexer Zellgemeinschaften zu messen. Mit dieser Methode können wir also die metabolischen Unterschiede zwischen Subpopulationen komplexer Zellgemeinschaften und auch die metabolische Zusammenarbeit zwischen diesen Subpopulationen untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir durch die Kombination von Isotopenverfolgung und Zellsortierung ein zuverlässigeres Maß für den Stoffwechsel erhalten und auch validieren können, wie zuverlässig die Methode ist.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie verschiedene Techniken kombiniert und die Art und Weise, wie Zellen behandelt werden, und die Dauer des Verfahrens den Zellstoffwechsel beeinflussen können. Für die Metabolitenextraktion aus einer Schale werden zunächst Zellen in einer Sechs-Well-Platte in einem mit stabilen Isotopen markierten Kulturmedium kultiviert, das dialysierte Zusätze enthält. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 75 % erreichen, spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit 500 Mikrolitern kaltem HBSS, das gleichmäßig markierte Glukose enthält.
Geben Sie dann 600 Mikroliter 100 % vorgekühltes Methanol aus Trockeneis in jede Vertiefung und geben Sie die Platte auf das Trockeneis. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lösen, und übertragen Sie dann die Extrakte aus jeder Vertiefung vorsichtig in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie die Zellen bis zur massenspektrometrischen Analyse bei minus 80 Grad Celsius.
Für die Metabolitenextraktion von sortierten Zellen werden Zellen in einer 100-Millimeter-Schale in markiertem Kulturmedium mit dialysierten Zusätzen kultiviert, so dass sie am Sortiertag eine Konfluenz von 75 % erreichen. Für die Impulsmarkierung von zellzyklussortierten Zellen kultivieren Sie die Zellen in unmarkiertem Medium, das dialysierte Nahrungsergänzungsmittel enthält, bis sie eine Konfluenz von 75 % erreichen. Dann markieren Sie die Zellen zwei Stunden lang mit Impulsen, indem Sie das Medium durch frisch markiertes Kulturmedium ersetzen.
Spülen Sie das Gericht mit warmem HBSS aus, das gleichmäßig markierte Glukose enthält, und lösen Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius. Nach vier Minuten wird das Trypsin mit drei Millilitern eiskaltem HBSS mit markierter Glukose und dialysierten Nahrungsergänzungsmitteln deaktiviert und die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Resuspendieren Sie das Pellet in HBSS, das markierte Glukose, dialysierte Nahrungsergänzungsmittel und EDTA in einer ein- bis zweifachen Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter enthält, und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40-Mikron-Sieb, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
Füllen Sie die Zellen in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen und sortieren Sie sie auf einem Durchflusszytometer. Für die Metabolitenextraktion aus scheinsortierten Zellen entfernen Sie die Trümmer und sortieren nur die Singuletts. Für die Metabolitenextraktion aus zellzyklussortierten Zellen werden die Trümmer und Dubletten herausgeschliffen und die Zellen in G1 und SG2M sortiert, basierend auf der Fluoreszenz der Gemininsonde.
Am Ende der Sortierung werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in 50 Mikrolitern eiskaltem destilliertem Wasser resuspendiert, um ein homogenes Pellet zu erhalten. Extrahieren Sie dann schnell die Metaboliten, indem Sie 540 Mikroliter trockeneisgekühltes Methanol hinzufügen. Lagern Sie die Probe bis zur LCMS-Analyse bei minus 80 Grad Celsius.
Die Extraktion von Metaboliten aus sortierten Zellen muss im Voraus gut geplant werden, wobei die experimentellen Arbeiten so schnell wie möglich abgeschlossen werden müssen, um die metabolischen Veränderungen zu minimieren. Für die Analyse der extrahierten Metaboliten wählen Sie zunächst eine Reihe von Metaboliten mit entsprechenden verfügbaren Standards aus, die Probenpeaks von guter Qualität aufweisen. Überprüfen Sie anschließend die Qualität der Peaks und achten Sie darauf, keine falschen Isotope zu enthalten.
Berechnen Sie das Massenisotop aus unseren Fraktionen für die isotopenmarkierten Proben, indem Sie die Peakfläche jedes Massenisotops aus unserer Fraktion durch die gesamten Peakflächen aller Massenisotope aus unseren Fraktionen dividieren. Berechnen Sie dann die markierten Kohlenstofffraktionen für die Anreicherung von Kohlenstoff-13 unter Verwendung der Formel für die Kohlenstoffanreicherung. Berechnen Sie abschließend die markierten Stickstofffraktionen für die Anreicherung von Stickstoff-15 unter Verwendung der Formel für die Stickstoffanreicherung.
In diesem repräsentativen Experiment waren 66 aus der Datenanalyse ausgewählte Metaboliten in den mock sortierten Zellen vorhanden, von denen 60 mit ähnlichen Massenisotopen aus unseren Verteilungen zwischen den Schalenextrakten und den mock sortierten Zellen markiert zu sein schienen. Zum Beispiel ist das Massenisotop aus unserer Verteilung von Glutamat zwischen den schalen- und mock-sortierten Extrakten ähnlich, was darauf hindeutet, dass das Glutamat-Massenisotop aus unserer Verteilung auch in sortierten Zellpopulationen zuverlässig ist. Die Analyse von HELA-Zellen, die entweder in G0-, G1- oder SG2M-Zellzyklusstadien eingeteilt wurden, mit der FUCCI-Geminin-Sonde zeigt eine Cytidinmarkierung in beiden Populationen mit einer höheren Anreicherung im SG2M-Stadium, was mit einer erhöhten De-novo-Synthese von Nukleotiden während der S-Phase übereinstimmt.
In diesem Experiment zeigte das Massenisotop aus unserer Verteilung das gleiche Muster in beiden zellzyklussortierten Fraktionen, was darauf hindeutet, dass derselbe Syntheseweg verwendet wird, aber im SG2M-Stadium aktiver ist, was zeigt, dass metabolische Unterschiede mit dieser Methode leicht nachweisbar sind, selbst zwischen eng verwandten Subpopulationen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Metaboliten aus sortierten Fraktionen extrahiert, und die Vorbehalte verstehen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen während der Sortierung und Metabolitenextraktion schnell zu handhaben, da die Art und Weise und die Dauer der Handhabung der Zellen ihren Stoffwechsel beeinflussen können.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann auf andere Zelltypen angewendet werden. Zum Beispiel Immunzelluntergruppen im Blut oder verschiedene Arten von Zellen innerhalb eines Tumors, wobei eine Vielzahl von Sonden, Antikörpern oder Färbemethoden zur Sortierung verwendet werden.
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Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung des Zellstoffwechsels in komplexen Gemeinschaften mehrerer Zelltypen. Die Technik kombiniert stabile Isotopenverfolgung, Zellsortierung und Massenspektrometrie, um metabolische Unterschiede und Kooperationen zwischen Subpopulationen zu analysieren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellstoffwechsel
- Isotopenverfolgung
- Massenspektrometrie
Hintergrund
- Das Verständnis des Stoffwechsels in komplexen Zellgemeinschaften ist für verschiedene biologische Studien entscheidend.
- Isotopenverfolgung ermöglicht eine detaillierte Analyse von Stoffwechselwegen.
- Zellsortierung hilft, spezifische Zelltypen für genauere Messungen zu isolieren.
- Massenspektrometrie bietet eine sensible Erkennung von Metaboliten.
Zweck der Studie
- Um den Stoffwechsel sortierter Populationen innerhalb komplexer Zellgemeinschaften zu messen.
- Um metabolische Unterschiede zwischen Subpopulationen zu untersuchen.
- Um metabolische Kooperationen zwischen verschiedenen Zelltypen zu erforschen.
Verwendete Methoden
- Zellen in stabil-isotop-markiertem Medium kultivieren.
- Spezifische Zelltypen mithilfe von Zellsortiertechniken trennen.
- Massenspektrometrie für die Metabolitenanalyse verwenden.
- Die Zuverlässigkeit der Methode durch visuelle Demonstrationen validieren.
Hauptergebnisse
- Verbessertes Verständnis der metabolischen Unterschiede in Zellsubpopulationen.
- Nachgewiesene Zusammenarbeit im Stoffwechsel zwischen verschiedenen Zelltypen.
- Validierung der Zuverlässigkeit der kombinierten Methode.
- Bereitstellung eines visuellen Rahmens für das Verfahren und seine Auswirkungen auf den Zellstoffwechsel.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen robusten Ansatz zur Untersuchung des Zellstoffwechsels.
- Die Kombination von Isotopenverfolgung mit Zellsortierung liefert zuverlässige metabolische Daten.
- Diese Technik kann auf verschiedene Forschungsbereiche angewendet werden, die komplexe Zellinteraktionen beinhalten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method addresses a key challenge in discovery biology: obtaining reliable metabolic measurements from heterogeneous cell populations without introducing sorting-induced artifacts. By leveraging stable isotope tracing and mass isotopomer distributions (MIDs), it enables de-risking of target validation through more confident assessment of subpopulation-specific pathway activity. The approach supports predictive confidence in early discovery by distinguishing true metabolic differences from procedural noise, informing go/no-go decisions in portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by revealing metabolic differences between subpopulations, such as elevated nucleotide synthesis in SG2M versus G1 phases.
- Operational Value: Provides a validation step using mock-sorted controls to confirm that MIDs remain unaltered by sorting stress, ensuring data integrity before downstream analysis.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming pathway consistency (e.g., nucleotide synthesis) while quantifying activity differences across closely related states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible MID readouts from sorted fractions that are amenable to high-resolution mass spectrometry and scalable across sample sets.
- Screening Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation by establishing baseline metabolic profiles in defined subpopulations.
- Platform Reuse: The workflow—combining isotope labeling, sorting, and LC-HRMS—can be adapted to immune subsets or tumor microenvironments using alternative probes or staining methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase metabolic profiling to preclinical validation by enabling consistent measurement of pathway activity in sorted populations across experimental models.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates prioritization of targets or mechanisms based on subpopulation-specific metabolic dependencies, reducing false leads in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing metabolic resolution that complements genomic and proteomic subpopulation analysis.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating metabolic signals specific to sorted subpopulations, such as cell cycle phases.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative metabolite enrichment data that enable reliable comparison of compound effects across defined fractions.
- Analytics: Generates mass isotopomer distributions and labeled carbon/nitrogen fractions that serve as stable, time-integrated readouts for pathway flux assessment.
- Translational Research: Enables continuity from sorted population analysis in vitro to preclinical models by preserving metabolic state fidelity through MID-based validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for metabolic phenotyping of any sortable subpopulation, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterogeneous systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal controls (mock-sorted samples) that verify methodological robustness.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier, more accurate go/no-go decisions based on subpopulation-specific metabolic dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting metabolic vulnerabilities in distinct cell states, informing combination therapy or biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stable isotope labeling, flow cytometry sorting, and LC-HRMS data analysis for metabolite enrichment calculations.
- Depends on access to cell sorters, mass spectrometry platforms, and isotope-labeled media with dialyzed supplements.
- Necessitates standardized handling procedures to minimize metabolic drift during sorting and extraction, particularly for time-sensitive samples.
- Involves adaptation considerations when applying the method to primary cells or tissues with varying fragility or sorting efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for rapid metabolite extraction post-sort to prevent ex vivo metabolic alterations, as noted in the protocol.
