Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, im nahen Infrarot fluoreszierende einwandige Kohlenstoffnanoröhren für die molekulare Sensorik herzustellen, die mit biomimetischen Polymeren funktionalisiert wurden. Diese Nanosensoren können eine zeitaufgelöste Bildgebung in lebendem Gewebe ermöglichen. Zum Beispiel können sie zum Nachweis von Dopamin im Gehirn verwendet werden.

Der Hauptvorteil dieser Sensoren ist ihre inhärente Nahinfrarot-Fluoreszenz, die eine Bildgebung tiefer in das Gewebe ermöglicht. Synthetische Sensoren ermöglichen die Detektion von Molekülen ohne natürliche molekulare Erkennungselemente, was diese generische Methode der Sensorentwicklung besonders nützlich für die Detektion kleiner Moleküle macht. Um eine Nukleinsäuresuspension von SWNTs herzustellen, lösen Sie zunächst Nukleinsäuren in 0,1 molaren Natriumchlorid auf eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter.

Entfernen Sie in einem Abzug mit einer antistatischen Pistole die statische Elektrizität aus dem Einwegspatel, den Mikrozentrifugenröhrchen und dem SWMT-Schaft. Fügen Sie als nächstes 20 Mikroliter der Nukleinsäurelösung zu 980 Mikrolitern 0,1 molaren Natriumchlorid hinzu. Geben Sie dann 1 Milligramm gewaschene SWNTs in die resultierende Nukleinsäurelösung, bevor Sie die Mischung beschallen.

Die Positionierung der Sondenspitze während der Beschallung ist von entscheidender Bedeutung. Wenn Schaumbildung auftritt, positionieren Sie die Sondenspitze neu und versuchen Sie, die Amplitude zu verringern. Alternativ können Sie es mit Impulsen der Beschallung oder der Badbeschallung versuchen, wenn die Suspension schlecht bleibt.

Mit einem Ultraschallgerät mit einer Spitze von 3 Millimetern Durchmesser wird die Lösung 10 Minuten lang bei 40 % Amplitude in einem Eisbad beschallt. Die DNA-SWNT-Lösung wird zweimal für 90 Minuten bei 16.100 xg zentrifugiert. Sammeln und bewahren Sie den Überstand auf, wobei Sie darauf achten müssen, das Pellet, das die Bündel und Aggregate der Kohlenstoffnanoröhren enthält, nicht zu stören.

Entsorgen Sie das Pellet gemäß den für Nanomaterialien geeigneten institutionellen Verfahren für gefährliche Abfälle. Die Lösungsextinktion wird bei 632 Nanometern mit einem UV-Vis-Spektralphotometer gemessen, um die ungefähre Konzentration der suspendierten SWNTs gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz und den entsprechenden Verdünnungsfaktor zu bestimmen. Bei amphiphilen Polymersuspensionen entfernen Sie zunächst die statische Elektrizität aus dem Einwegspatel, den Mikrozentrifugenröhrchen und dem SWNT-Material.

In einem Abzug fünf Milligramm SWNTs auf fünf Milliliter 2%ige Natriumcholatlösung geben. Mit einem Ultraschallgerät mit einer Spitze von sechs Millimetern Durchmesser wird die Lösung eine Stunde lang bei 40 % Amplitude in einem Eisbad beschallt. Die Probe wird vier Stunden lang mit einer Ultrazentrifuge bei 150.000 xg zentrifugiert, bevor der Überstand vorsichtig entnommen wird.

Als nächstes lösen Sie 1 % des Gewichts des amphiphilen Polymers in der scSWNT-Lösung. Anschließend dialysieren Sie die Polymer-scSWNT-Lösung fünf Tage lang mit einer 3,5-Kilodalton-Dialysemembran gegen einen Liter deionisiertes Wasser oder Puffer. Wechseln Sie das Wasser oder den Puffer in der zweiten und vierten Stunde.

Messen Sie die Lösungsextinktion bei 632 Nanometern mit einem UV-Vis-Spektralphotometer, um die ungefähre Konzentration der suspendierten SWNTs zu bestimmen. Zur Vorbereitung der BSA-Biotin-beschichteten Objektträger reinigen Sie einen Objektträger und ein 0,17 Millimeter großes Deckglas mit deionisiertem Wasser, gefolgt von Methanol, Aceton und einer abschließenden Spülung mit deionisiertem Wasser. Erstellen Sie Kanäle, indem Sie mehrere Stücke doppelseitiges Klebeband im Abstand von etwa fünf Millimetern auf den sauberen Objektträger legen.

Versiegeln Sie die Kanäle, indem Sie einen langen Glasabdeckzettel nehmen und ihn auf die Oberseite des doppelseitigen Klebebandes drücken. Achten Sie darauf, es auf dem Objektträger so zu zentrieren, dass die Kanten des Deckglases und des Objektträgers nicht bündig sind. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter BSA-Biotin-Stammlösung zu 900 Mikrolitern 1x Tris-Puffer bis zu einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu.

Fließen Sie 50 Mikroliter der BSA-Biotin-Lösung in den Kanal, indem Sie die Lösung in ein Ende pipettieren und die Lösung am anderen Ende mit einem Taschentuch ableiten. Nachdem Sie die Lösung fünf Minuten lang inkubiert haben, führen Sie drei bis fünf Spülungen mit 50 Mikrolitern 0,1 molar Natriumchlorid durch. Als nächstes verdünnen Sie 40 Mikroliter mit fünf Milligramm pro Milliliter NAV-Stammlösung in 960 Mikroliter 1x Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter.

Fließen Sie 50 Mikroliter der NAV-Lösung in den Kanal, indem Sie die Lösung in ein Ende pipettieren und die Lösung am anderen Ende mit einem Taschentuch ableiten. Nachdem Sie den Objektträger zwei bis fünf Minuten lang inkubiert haben, führen Sie drei bis fünf Spülungen mit 50 Mikrolitern 0,1 molaren Natriumchlorid durch. Anschließend werden die Stammlösungen der suspendierten SWNTs und des bildgebenden Puffers auf eine Konzentration von 1 bis 10 Milligramm pro Liter verdünnt.

Lassen Sie 50 Mikroliter dieser Lösung in den Kanal und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Spülen Sie überschüssige SWNTs vorsichtig mit 50 Mikrolitern Bildgebungspuffer ab. Um die reversible Reaktion von GT15-DNA-SWNTs auf Dopamin zu messen, montieren Sie zunächst die mit Sensoren beschichteten Kanäle auf den Fluoreszenzmikroskoptisch.

Bringen Sie die Kanäle mit einem 100-fachen Ölobjektiv und einer Indium-Galliumarsenid-Kamera in den Fokus. Geben Sie dann 50 Mikroliter 100 mikromolare Dopaminlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in den Strömungskanal und zeichnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität auf. Waschen Sie die Dopaminlösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus und beobachten Sie die Veränderung der Fluoreszenz der einzelnen SWNT-Sensoren.

Um das Well-Platten-Screening auf die Analytreaktion von biomimetischen Polymer-SWNTs durchzuführen, pipettieren Sie gleiche Volumina des suspendierten SWNT-Sensors in jede Well. Verwenden Sie genügend Volumen, um den Boden der Vertiefung gleichmäßig zu bedecken. Pipettieren Sie dann Analyten aus der Screening-Bibliothek in die Well-Platten.

Bereiten Sie jeden Analyten in dreifacher Ausfertigung vor, um potenzielle Schwankungen von Bohrung zu Bohrung und Schwankungen der Anregungsintensität oder der Temperatur zu berücksichtigen. Heben Sie das Objektiv an, während Sie die Emissionsspektren mit dem Spektrometer und dem Indium-Gallium-Arsenid-Array überwachen. Bei optimaler Position des Objektivs wird die Fokusebene ungefähr in der Mitte des Probenvolumens in der Vertiefung platziert, was einem Maximum der gemessenen Intensität entsprechen sollte.

Nehmen Sie für jede Probenvertiefung eine Belichtungszeit von ein bis 10 Sekunden auf, um ein Spektrum zu sammeln. Vergleichen Sie die Emissionsspektren für jede Vertiefung mit einer Kontrolle, die nur SWNTs ohne zusätzlichen Analyten enthält, um die Fluoreszenzreaktion zu quantifizieren. Das Absorptionsspektrum von GT15-DNA-Nanoröhren-Sensoren zeigt mehrere Peaks, die gut dispergierten Kohlenstoffnanoröhren unterschiedlicher Chiralität entsprechen.

Gezeigt wird die Nahinfrarotfluoreszenz von GT15 DNA-Nanoröhren-Sensoren. Interessanterweise verdoppelt sich die Fluoreszenzintensität als Reaktion auf Dopamin ungefähr. In dieser Abbildung zeigt die Nahinfrarot-Fluoreszenzmikroskopie einzelne GT15-DNA-Nanoröhrensensoren, die auf der Oberfläche eines Glasdeckglases immobilisiert sind.

In Zukunft ist es wichtig, den Sensor für den In-vivo-Einsatz zu testen, z. B. die Erweiterung der Analytbibliothek um molekulare Konkurrenten, die Prüfung der Linearität der Reaktion im biologisch relevanten Konzentrationsbereich und auch die Prüfung der Reversibilität. Sobald dieser Ansatz beherrscht ist, kann er verwendet werden, um eine Bibliothek verschiedener synthetischer Sensoren aus Molekülen ohne bekannte molekulare Erkennungselemente zu erstellen.