Name: Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Funktionalisierung von SWNTs mit bio-mimetischen Polymeren für molekulare Sensorik. Diese Methode ermöglicht die Erkennung von Neurotransmittern wie Dopamin in lebendem Gewebe mittels Nahinfrarot-Fluoreszenz.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), ein Stipendium der Simons Foundation und ein Stipendium der Brain and Behavior Research Foundation für junge Forscher.

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDS) vor dem Gebrauch. Nanomaterialien können zusätzliche Gefahren im Vergleich zu ihren Schüttgut-Pendant. Verwenden Sie alle erforderlichen Sicherheitsmaßnahmen einschließlich technische Kontrollen (Dunstabzug, Lärm-Gehäuse) und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Schutzbrille, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe). 1. Herstellung der Puffer, Tensid und Polymer Solutions <ol><li> Herstellung von 100 mM NaCl - Lösung <ol><li> Man löst 584 mg NaCl in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen. </li></ol></li><li> Herstellung von 3% Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung <ol><li> Man löst 3 g SDS in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen. </li></ol></li><li> Herstellung von 2% Natriumcholat (SC) Lösung <ol><li> Löse 2 g sodium Cholat-Hydrat in 80 ml entionisiertem Wasser. Entsalztem Wasser Gesamtvolumen auf 100 ml zu bringen. </li></ol></li><li> Herstellung von Abbildungspuffer (1x Tris: 20 mM Tris, 100 mM NaCl) <ol><li> Man löst 22,23 g Tris-Base und 58,44 g NaCl in 500 ml entsalztem Wasser ein Magnetrührstab und Platte verwendet wird. </li><li> Vorsichtig konzentrierte HCl hinzu bis ein pH von 8,1 erreicht ist. </li><li> entsalztem Wasser hinzufügen Endvolumen von 1 l zu erreichen </li></ol></li><li> Synthese von RITC-PEG-Polymer RITC <ol><li> Auflösen Amin difunktionalisierten Polyethylenglykol (PEG) (5 kDa oder 20 kDa, 0,1 mol / L) und Rhodamin-Isothiocyanat (RITC, 0,2 mol / L) in 1 mL einer 1: 1 Mischung von Dichlormethan und Dimethylformamid (DMF). </li><li> Hinzufügen 0,2 mol / l N, N - Diisopropylethylamin (DIEA). </li><li> Nach 3 h mit 10-fach Volumen Diethylether durch Vakuumfiltration gefolgt auszufällen. </li><li> Abgeblasen, in DMF und wiederholen follo Etherfällungwed durch Vakuumfiltration. Hinweis: andere Isothiocyanat modifizierten Moleküle (zB Fluoresceinisothiocyanat, FITC) an PEG oder einem anderen Amin modifizierten Polymere unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens angebracht werden. </li></ol></li><li> Herstellung von pegyliertem-DNA (PEG-DNA) <ol><li> Kombinieren von 100 &amp; mgr; l Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) -Lösung (0,5 M, pH 7,0) mit 44,9 &amp; mgr; l 5&#39;-Thiol-modifizierte DNA (1 mg / 10 &amp; mgr; l in 0,1 M NaCl) und in den 4,855 ml entionisiertes Wasser. </li><li> Rühre 1 Stunde. </li><li> Man löst 500 mg Methoxypolyethylenglykol Maleimid in 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. </li><li> Kombinieren Sie DNA und PEG-Lösungen (10 ml gesamt) und rühre 24 h. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren (SWNT) Suspensions <ol><li> Wäsche von SWNTs Katalysator und Verunreinigungen zu entfernen. <ol><li> In 200-300 mg ungewaschener SWNTs in eine Plastikzentrifugenröhrchen containing 45 ml entionisiertem Wasser. </li><li> Vortex die Lösung für 2 min und beschallen ein Ultraschallbad für 5 Minuten verwendet wird. Beachten Sie, dass Beschallungsgerät Einstellungen von Instrument zu Instrument variieren, so überprüfen Sie, dass die optische Dichte der SWNT - Lösung erhöht (dh schwarz wird ) , um sicherzustellen , dass die SWNT verteilt werden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Lösung für 20 min bei 16.100 xg und Überstand verwerfen. </li><li> In etwa 45 ml frischem entionisiertem Wasser. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2-2.1.4 bis zu 8-mal. </li><li> Entfernen Sie so viel Wasser wie möglich darauf achten, nicht pelletierten SWNTs zu stören und SWNT-Pellet an der Luft trocknen lassen. </li></ol></li><li> Nukleinsäure-Suspensionen von SWNT <ol><li> Auflösen Nukleinsäuren (NA) in 0,1 M NaCl zu einer Konzentration von 100 mg / mL. </li><li> Sie statische Elektrizität von Einweg-Spatel, Mikrozentrifugenröhrchen und SWNT Lager eine antistatische Pistole. In einem Abzug, fügen Sie 20 ul der NA-Lösung auf 980 &amp; mgr; l von 00,1 M NaCl durch Zugabe von 1 mg SWNTs gefolgt. </li><li> Verwendung eines Ultraschallgerät mit 3 mm Durchmesser Spitze beschallen die Lösung für 10 min bei 40% Amplitude in einem Eisbad. </li><li> Zentrifugieren Sie die DNA-SWNT Lösung ZWEIMAL 90 min bei 16.100 x g. Bei der Verwendung von PEG-DNA, zu reinigen überschüssiges und nicht umgesetzte DNA und PEG mit einem 100 kDa Spin-Filter. Fügen Sie genug PBS den Spin-Filter und Spin bei 9.300 × g für 1,5 Minuten zu füllen, wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 mal. </li><li> Sammeln Sie und halten Sie den Überstand, wobei darauf geachtet, nicht das Pellet zu stören enthält CNT Bündel und Aggregate. Entsorgen Sie das Pellet in Einklang mit den institutionellen Sondermüll geeigneten Verfahren für Nanomaterialien. </li><li> mit ε = 0,036 L / cm · mg entsprechend Lambert-Beer-Gesetz und dem entsprechenden Verdünnungsfaktor Messen Sie die Lösung Absorption bei 632 nm unter Verwendung eines UV / Vis-Spektralphotometer ungefähre Konzentration von suspendierten einwandigen Nanoröhren zu bestimmen. </li></ol></li><li> Amphiphile PolymersuspensionenSWNT <ol><li> Sie statische Elektrizität von Einweg-Spatel, Mikrozentrifugenröhrchen und SWNT Lager. In einem Abzug werden 5 mg SWNT bis 5 ml 2% SC-Lösung (alternativ kann SDS-Lösung verwendet werden). </li><li> Verwendung eines Ultraschallgerät mit 6 mm Durchmesser Spitze beschallen die Lösung für 1 h bei 40% Amplitude in einem Eisbad. </li><li> Centrifuge Probe bei 150.000 g für 4 h eine Ultrazentrifuge und sorgfältig Überstand zu sammeln. </li><li> Man löst 1 wt% des amphiphilen Polymers (zB RITC-PEG-RITC) in SC-SWNT - Lösung. </li><li> Dialysieren das Polymer-SC-SWNT-Lösung mit einer 3,5 kDa Dialysemembran gegen 1 l deionisiertem Wasser oder Puffer für 5 Tage verwenden. Ändern des Wasser oder Puffer für Stunde und 2 Stunde 4. Eine größere Dialysemembran verwendet werden kann, solange es die Entfernung des oberflächenaktiven Mittels der Wahl erlaubt, aber Beibehaltung sowohl der SWNT und amphiphilen Polymer. </li><li> Messen Sie die Lösung Extinktion bei 632 nm unter Verwendung eines UV / Vis-Spektrophotometer zur Bestimmungungefähre Konzentration von suspendierten einwandigen Nanoröhren mit ε = 0,036 L / cm * mg entsprechend Lambert-Beer-Gesetz und dem entsprechenden Verdünnungsfaktor. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Oberflächen Immobilisierte SWNT-Sensoren <ol><li> Herstellung von BSA-Biotin und NeutrAvidin Stammlösungen <ol><li> Man löst 10 mg gefriergetrocknet BSA-Biotin in 1 ml entsalztem Wasser eine 10 mg / ml Stammlösung und lagern bei 4 ° C zu machen. </li><li> Man löst 10 mg NeutrAvidin Protein (NAV, deglycosyliert Avidinprotein) in 2 ml entionisiertem Wasser eine 5 mg / ml Stammlösung zu machen. Store Aliquots bei -20 ° C. Aufgetaute Aliquots kann für mehrere Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Bereiten BSA-Biotin beschichtet Mikroskop - Objektträger <ol><li> Reinigen Sie einen Objektträger und 0,17 mm Deckglas (oder gegebenenfalls für das Mikroskopobjektiv) mit entsalztem Wasser, gefolgt von Methanol, Aceton und letzte Spülung von entsalztem Wasser. </li><liErstellen&gt; Kanäle, indem mehrere Stücke doppelseitigen Klebebands etwa 5 mm voneinander entfernt auf dem sauberen Mikroskop-Objektträger. Verschließen Sie die Kanäle, die durch eine lange Deckglas zu nehmen und es auf die Oberseite des doppelseitiges Klebeband drücken. Seien Sie sicher, dass es auf dem Objektträger zentriert ist, so dass die Kanten des Deckglases und Rutsche nicht bündig sind. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l BSA-Biotin-Stammlösung zu 900 &amp; mgr; l 1x Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg / mL. </li><li> Fluss 50 ul der BSA-Biotin-Lösung in den Kanal durch Pipettieren der Lösung in ein Ende und Feuchtigkeitsregulierung entfernt Lösung am anderen ein Gewebe verwendet wird. Inkubieren für 5 Minuten, gefolgt von 3-5 Spülungen mit 50 &amp; mgr; l von 0,1 M NaCl. </li><li> Verdünnen 40 &amp; mgr; l von 5 mg / ml NAV Lager in 960 ul 1x Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,2 mg / ml. </li><li> Durchfluss 50 ul der NAV-Lösung in den Kanal durch Pipettieren der Lösung in ein Ende und Feuchtigkeitsregulierung entfernt Lösung am anderen ein Gewebe verwendet wird. Inkubieren für 2-5 Minutengefolgt von 3-5 Spülungen mit 50 ul 0,1 M NaCl. </li><li> Verdünnte Stammlösungen von suspendierten SWNTs in Abbildungspuffer zu einer Konzentration von 1-10 mg / L und Strömungs 50 &amp; mgr; l der Lösung in den Kanal und Inkubation für 5 min. </li><li> Spülen Sie vorsichtig überschüssiges SWNTs unter Verwendung von 50 &amp; mgr; l von Abbildungspuffer entfernt. </li></ol></li><li> Herstellung von APTES silanisierte Objektträger HINWEIS: APTES silanisiert Folien ermöglichen eine Möglichkeit, die Oberfläche eines Glassubstrats negativ geladenen DNA-wrapped SWNTs zu immobilisieren. <ol><li> Eine 10% ige Lösung von (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) in Ethanol. </li><li> Mit Kanäle unter Verwendung der in 3.2.2 beschriebenen Schritte, fließen in 100 ul 1x Tris-Puffer. </li><li> Spülen Sie den Kanal mit APTES Lösung und Inkubation für 5 min. Waschen mit 1x Tris-Puffer. </li><li> Verdünnte Stammlösungen von suspendierten DNA-SWNTs in Abbildungspuffer zu einer Konzentration von 1-10 mg / Land Strömungs 50 &amp; mgr; l der Lösung in den Kanal und incubaß für 5 min. </li><li> Spülen Sie vorsichtig überschüssiges SWNTs unter Verwendung von 50 &amp; mgr; l von Abbildungspuffer entfernt. </li></ol></li></ol> 4. Fluoreszenzspektroskopie und Mikroskopie von SWNT-Sensoren <ol><li> nIR Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Führen Sie Abbildung der Oberflächen immobilisiert SWNT mit Laseranregung und ein inverses Mikroskop mit einer InGaAs-Sensor-Array ausgestattet für die Bildgebung. </li><li> Richten Sie den Laserstrahl mit der Hintergrundbeleuchtung Anschluss eines inversen Mikroskops zur Eingabe mit Hilfe von Spiegeln auf verstellbaren kinematischen Halterungen und ein Paar von Pfosten montiert Iris auf den Hafen Höhe. Sicherstellen, dass die Strahlebene ist und gerade durch die Bestätigung, es geht durch beide Iris, wenn zwischen aufeinanderfolgenden Spiegel gestellt und vor dem Eintritt in die Beleuchtungs Port. Falls erforderlich, stellen Sie die Strahlhöhe ein Periskop Montage verwendet wird. Entfernen Sie alle Kurzpasswärmefilter auf der Beleuchtungs Port, der den Strahl dämpfen würde. </li><li> Legen Sie einen geeigneten Filterwürfel in das Mikroskopdas Anregungslicht in das Objektiv zu reflektieren und Emissionslicht zu sammeln. Dieser besteht typischerweise aus einem dichroitischen Langpassfilter mit einer Grenz oberhalb der Anregungswellenlänge (beispielsweise 750 LP) und einer Emissionslangpassfilter (beispielsweise 850 LP) weiter gestreutes Anregungslicht zu minimieren , den Sensor vom Schlagen. Zusätzlich kann das Emissionsfilter gewählt werden, für die Emission von SWNTs einer bestimmten Chiralität selektiv. </li><li> Führen Sie Feineinstellungen für die Strahlausrichtung durch eine entsprechende Ausrichtung Würfel Einsetzen des Objektivs mit zwei versetzten, Mattscheiben, die 1 mm kleine Löcher zu ersetzen. Richten des Strahls auf die Mitte der beiden unteren und oberen Ausrichtschicht Scheiben. </li><li> Bringen Sie ein 2D InGaAs-Sensoranordnung an der Seite Imaging-Port des Mikroskops einen entsprechenden Adapter und ein 0,5-fach-Objektiv, wenn notwendig, die Sensorgröße anzupassen. </li><li> Unter Verwendung eines 100X -Ölimmersionsobjektiv (1,4 NA), gelten fluoreszenzfrei Sionsöl und legen Sie die immobilized SWNT Probe auf den Mikroskoptisch. </li><li> Heben Sie das Ziel, bis das Öl in Kontakt mit der Unterseite des Deckglases (# 1.5, 170 &amp; mgr; m Dicke). Nehmen Sie die Einstellung mit dem Ziel Kragen notwendig , wenn für Abbildungsbedingungen, zB Temperatur, Glasdicke, usw. </li><li> Langsam heben das Ziel mit der Anregungsquelle auf und das Fluoreszenzsignal der InGaAs-Kamera zu überwachen. Die Fluoreszenzintensität sollte schrittweise zu erhöhen, wie die Fokusebene der Oberfläche nähert, und die immobilisierten Sensoren in den Fokus gerückt. </li></ol></li><li> nIR Fluoreszenzspektroskopie HINWEIS: Fluoreszenzspektroskopie kann mit dem gleichen Mikroskopaufbau durchgeführt werden, sondern durch das gesammelte Licht aus dem Mikroskopkörper lenken und in ein Spektrometer und InGaAs Lineararray-Detektor. <ol><li> Mit kinematischen Halterungen und Spiegel für nIR bewertet, lenken das Licht Weg zu den Eintrittsspalt des Spektrometers. Konzentrieren Sie das Licht auf einen poi untennt auf den Eingang einer Fokussierlinse geschlitzt mit (zB plankonvexe, f = 150 mm). Diese Ausrichtung durch Dämpfen der Laserleistung auf &lt;1 mW und Ersetzen des Mikroskopobjektiv mit einem 1 &quot;Spiegel und unter Verwendung eines 50/50 Strahlteilungsfilterwürfel erreicht wird. Das Anregungslicht wird dann den Mikroskopkörper durch die Austrittsöffnung verlassen können und verwendet werden, die Spiegel und die Linse zu fokussieren den Strahl auf den Eintrittsspalt einzustellen. </li><li> das Mikroskopobjektiv und Langpassfilter, legen Sie eine Well-Platte auf die Bühne und notieren Sie die Spektren von einem Scharf Probe unter Verwendung des Spektrometers und InGaAs-Array nach dem Ersetzen. </li></ol></li><li> Die Messung der reversiblen Reaktion von (GT) 15 DNA-SWNT zu Dopamin <ol><li> Berg Sensorkanäle auf den Mikroskoptisch und bringen in den Fokus mit einem 100X Öl-Objektiv und InGaAs-Kamera beschichtet. Zugabe von 50 ul 100 uM Dopamin-Lösung in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit dem Strömungskanal und Aufzeichnungsdie Änderung in der Fluoreszenzintensität. </li><li> Waschen Sie die Dopamin Lösung phosphatgepufferte Salzlösung mit und die Veränderung der Fluoreszenz der einzelnen SWNT-Sensoren beobachten. </li></ol></li><li> Well-Platten - Screening für Analyten Antwort von SWNT - Sensoren HINWEIS: Screening von verschiedenen Analyten kann mit einem motorisierten Tisch gesteuert mit Hilfe eines transparenten Well-Platte durchgeführt werden. Eine ideale Well-Platte ist transparent für sichtbares und IR und hat schwarze Seitenwände Übersprechens zwischen den Vertiefungen zu minimieren. <ol><li> Pipette gleichen Volumina von suspendierten SWNT - Sensor (zB 5 mg / l Konzentration) in jede Vertiefung, genug , um den Boden des Bohrlochs gleichmäßig abzudecken, in der Regel&gt; 100 &amp; mgr; l für eine 96-Well - Platte und&gt; 30 &amp; mgr; l für eine 384-Well - Platte . </li><li> Pipette Analyten ( zum Beispiel 2 &amp; mgr; l, 100 &amp; mgr; M Endvolumen) vom Screening - Bibliothek in die Well - Platten. Bereiten Sie jeden Analyten in dreifacher Ausfertigung für potenzielle Rechnung zu tragen und zu gut Variation, fluctuatIonen der Anregungsintensität oder der Temperatur. </li><li> Heben Sie das Ziel (zB 20X Achroplan, 0,45 NA) , während die Emissionsspektren Überwachung des Spektrometers und InGaAs - Array verwendet wird . Optimale Position des Ziels wird der Brennebene etwa in der Mitte des Probenvolumens in dem Bohrloch gesetzt, die zu einem Maximum der gemessenen Intensität entsprechen. </li><li> Für jede Probe gut, notieren Belichtung eines 1-10 s ein Spektrum zu sammeln. </li><li> Vergleichen Sie die Emissionsspektren für jede Vertiefung zu einem Steuerelement enthält nur SWNT ohne zusätzliche Analyt die Fluoreszenzantwort zu quantifizieren. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

SWNTs werden in wässriger Lösung durch direkte Beschallung mit SDS oder ssDNA leicht suspendiert, wie durch eine Zunahme der optischen Dichte durch die kolloidale Dispersion des resultierenden SWNT-Polymer-Hybrid vorgesehen angegeben. SDS und ssDNA streut und solubilisiert Bündel von einwandigen Nanoröhren durch durch hydrophobe oder pi-pi-Wechselwirkungen auf die SWNT Oberfläche zu adsorbieren. Zusätzlich können andere Polymere, wie genomische DNA, amphiphile Polymere, konjugierte Polymere und Lipiden, auf die Oberfläc...

Einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren (SWNT) sind atomar dünne Schichten aus Kohlenstoffatomen rollten in lange, dünne Zylinder, die einzigartige elektronische und optische Eigenschaften aufweisen. 1 Derartige Eigenschaften umfassen eine Bandlücken Herstellung nahen Infrarot (NIR) Fluoreszenzemission über Exziton Rekombination , die sehr empfindlich gegenüber ihrer lokalen Umgebung ist. NIR- Emission von SWNTs fällt in den nahen Infrarot-Fenster, in dem die Eindringtiefe des Lichts für biologisches Gewebe maximal ist. 2,3 Zusätzlich zeigen SWNT einige einzigartige Eigenschaften atypisch im Gegensatz zu organischen Fluorophore: SWNT weisen eine große Stokes - Verschiebung, nicht photobleach, und nicht blinken. 4 In jüngster diese Eigenschaften ausnutzt , hat zur Entwicklung einer Zusammenstellung der neuen molekularen Sensoren mit Anwendungen in der Biologie geführt. 5,6 Unveränderte sind jedoch SWNTs in Wasser unlöslich und Suspensionen einzelner SWNT zu erhalten , kann eine Herausforderung sein. 7,8 Bundling und Aggregation von einwandigen Nanoröhren in Lösung können ihre Bandlückenfluoreszenz, 2 macht sie ungeeignet für Sensoranwendungen zu verschleiern. Dispergier- einzelnen Kohlenstoff-Nanoröhren in wässriger Lösung erfordert ihre oberflächenmodifizierenden Hydrophobizität getriebenen Aggregation zu verhindern. 9 Während Modifikation kovalente kann SWNT wasserlöslich machen, 10 sowie vermitteln spezifische Bindungschemie, Defektstellen im SWNT Gitter reduzieren oder ihre Fluoreszenzemission abklingen. 13 , die durch hydrophobe und pi-pi Stapel - Wechselwirkungen an die Nanoröhrenoberfläche adsorbieren - Stattdessen kann SWNT Funktionalisierung unter Verwendung von Tensiden, Lipiden, Polymeren und DNA 9,11 erreicht werden. Die sich ergebende chemische Umgebung umgebende Oberfläche funktionalisierte SWNTs wird als seine corona Phase. Störeinflüsse auf die Corona-Phase kann einen großen Einfluss auf Exzitonen haben auf der Oberfläche von Nanoröhren reisen, Modulationen verursacht fluor zu SWNTescence Emission. Es ist dieses empfindliche Beziehung zwischen der Koronaphase und SWNT Fluoreszenz, die durch den Einbau von spezifischen Bindungsmodalitäten auf die große Oberfläche von SWNT neuen molekularen Sensoren zu entwickeln, ausgenutzt werden kann. Störeinflüsse auf die SWNT Corona Phase bei Analyt-Bindung kann in der lokalen dielektrischen Umgebung zu Veränderungen führen, Ladungstransfer oder Gitterfehler einführen, die alle die Fluoreszenzemission der SWNTs modulieren kann als Signalübertragungsmechanismus zu dienen. 14 Dieser Ansatz in der Entwicklung neuer Fluoreszenzsensoren für den Nachweis von vielen verschiedenen Klassen von Molekülen , einschließlich DNA, 15,16 Glucose 17 und kleine Moleküle, wie ATP, 18 reaktive Sauerstoffspezies 19 und Stickstoffmonoxid verwendet wird. 20,21 Jedoch sind diese Ansätze beschränkt, daß sie sich auf die Existenz eines bekannten Bindungs Modalität für die Zielanalyten verlassen. Vor kurzem wurde eine allgemeinere AppRotauge Fluoreszenzsensoren zur Gestaltung wurde SWNTs nicht-kovalent funktionalisiert mit amphiphilen Hetero, Phospholipide und Polynucleinsäuren entwickelt wurden. Diese Moleküle adsorbieren an Kohlenstoff - Nanoröhrchen - Oberflächen zu produzieren hochstabile Suspensionen einzelner SWNT 22-25 mit einzigartigen Corona - Phasen , die spezifisch Proteine 26,27 oder kleine Moleküle einschließlich des Neurotransmitters Dopamin binden kann. 28-30 Engineering the Corona Phase SWNTs und spezifisch binden Zielanalyten zu dispergieren , wird als Corona - Phase molekulare Erkennung (CoPhMoRe) bezeichnet. 28 Die kleine Größe, geringe Toxizität, hohe Stabilität und unbleaching nIR Fluoreszenz von CoPhMoRe SWNT - Sensoren machen sie zu ausgezeichneten Kandidaten für die in vivo Mess für längere zeitaufgelöste Messungen. 6 Neuere Arbeiten zur optischen Detektion von reaktivem Stickstoff und Sauerstoff - Spezies ihre Anwendungen in Pflanzengewebe gezeigt. 31Eine besonders spannende Anwendung für CoPhMoRe SWNT - Sensoren ist das Potenzial für markierungsfreie Detektion von Neurotransmittern wie Dopamin in vivo, wo andere Techniken, wie elektrochemische Mess oder Immunhistochemie, leiden an einem Mangel an räumlicher Auflösung, zeitliche Auflösung und Spezifität. Die Projektierung und die Entdeckung CoPhMoRe SWNT-Sensoren hat bisher von der Größe und chemische Vielfalt der Dispersions Bibliothek zurückgehalten worden, um die Wahrscheinlichkeit zu begrenzen eines Sensors für ein bestimmtes Ziel zu finden. Bisher haben Forscher verkratzt nur die Oberfläche der verfügbaren konjugierten, co-block, biologische und biomimetische Polymere, die als funktionell aktives Dispergiermittel für SWNT-Sensoren dienen. Hier stellen wir verschiedene Methoden für beide SWNT Dispergieren und ihre Fluoreszenz für Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung für einzelne SWNT-Sensor-Analyse. Insbesondere beschreiben wir das Verfahren zur Beschichtung von SWNT mit Polynukleinsäure oligomers durch direkte Beschallung sowie wie SWNT mit amphiphilen Polymeren durch Tensid Austausch durch Dialyse zu funktionalisieren. Wir verwenden (GT) 15 -DNA und Polyethylenglykol funktionalisiert mit Rhodaminisothiocyanat (RITC-PEG-RITC) als Beispiele. Wir veranschaulichen die Verwendung von (GT) 15 -DNA SWNTs als CoPhMoRe Sensor für den Nachweis von Dopamin. Schließlich beschreiben wir Verfahren zur Einzelmolekül-Sensormessungen durchführt, die für die Charakterisierung oder Einzelmolekülmessung verwendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcholathydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>Trisbase (Trizma-Base)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Amin-PEG-Amin, NH2-PEG-NH2</td><td>Nanocs Inc</td><td>PG2-AM-5k</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamin B-Isothiocyanat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>283924</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>676853</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>673811</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5'-Thiol-modifizierte DNA&nbsp;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methoxypolyethylenglykol-Maleimid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63187</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Spin-Filter</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPCO Superreines einwandiges Kohlenstoff-Nanoröhrchen</td><td>Integris</td><td>HiPco Superreines</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepuffertes Kochsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Antistatikpistole</td><td>Milty</td><td>Milty Zerostat 3</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 D</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Cole Parmer</td><td>CV18</td><td></td></tr><tr><td>Dialysekassetten</td><td>Thermo scientific</td><td>Slide-A-Lyzer G2 87722</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Thermo scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin Protein</td><td>Thermo scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td></td></tr><tr><td>kinematische Spiegel</td><td>ThorLabs</td><td>KM200-E03</td><td></td></tr><tr><td>Periskop</td><td>ThorLabs</td><td>RS99</td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl</td><td>Zeiss</td><td>Immersol 518f</td><td></td></tr><tr><td>100X Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>Plan-Apochromat 100X Öl, 1.4NA, PH3, 420791-9911-000</td><td></td></tr><tr><td>20X Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>N-Achroplan 0.45 NA, 420953-9901-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Healthrow Scientific</td><td>HS159879H</td><td></td></tr><tr><td>Dopaminhydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Infrarot-2D-Array-Kamera</td><td>Princeton Instruments</td><td>NIRvana</td><td></td></tr><tr><td>Infrarot-1D-Sensor-Array</td><td>Princeton Instruments</td><td>PyLoN IR</td><td></td></tr><tr><td>nIR-Spektrograf</td><td>Princeton Instruments</td><td>SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>plankonvexe Linse</td><td>ThorLabs</td><td>LA1384</td><td></td></tr><tr><td>Well-Platten (Glasboden)</td><td>Corning</td><td>4580</td><td></td></tr></tbody></table>

technik molekulare erkennung mit bio-mimetikum polymers auf einwandigen kohlenstoff-nanoröhrchen

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Halbleitende einwandige Kohlenstoffnanoröhren (SWNTs) sind eine Klasse von optisch aktiven Nanomaterialien, die im nahen Infrarot fluoreszieren und mit dem optischen Fenster zusammenfallen, in dem biologische Proben am transparentesten sind. Hier skizzieren wir Techniken zur Adsorption amphiphiler Polymere und Polynukleinsäuren auf der Oberfläche von SWNTs, um ihre Koronaphasen zu manipulieren und neuartige molekulare Sensoren für kleine Moleküle und Proteine zu schaffen. Diese funktionalisierten SWNT-Sensoren sind sowohl biokompatibel als auch stabil. Polymere werden an der Oberfläche der Nanoröhre adsorbiert, entweder durch direkte Beschallung von SWNTs und Polymer oder durch Suspendieren von SWNTs unter Verwendung eines Tensids, gefolgt von einer Dialyse mit Polymer. Die Fluoreszenzemission, Stabilität und Reaktion dieser Sensoren auf Zielanalyten werden mit Hilfe von Absorptions- und Nahinfrarot-Fluoreszenzspektroskopie bestätigt. Darüber hinaus demonstrieren wir die Oberflächenimmobilisierung der Sensoren auf Objektträgern, um die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zur Charakterisierung der Polymeradsorptions- und Analytbindungskinetik zu ermöglichen.

SWNTs wurden in wässriger Lösung mit beiden Tensiden und amphiphile Polymere, die durch direkte Beschallung und durch Dialyse Börse ausgesetzt. Abbildung 1 zeigt SWNTs, gezüchtet , um die Eisencarbonyl katalysierten Verfahren (HiPCO) verwenden, suspendiert SC verwenden, RITC-PEF20-RITC und (GT) 15 -DNA. Die optische Dichte eines SWNTs mit SDS (oder Polymer) erhöht drastisch nach der Beschallung und nimmt bei Entfernung von Aggregaten und Verunreinigungen durch...

Wir präsentieren ein Protokoll für die Entwicklung der Koronaphase von fluoreszierenden einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWNTs) im nahen Infrarot unter Verwendung von amphiphilen Polymeren und DNA, um Sensoren für molekulare Ziele ohne bekannte Erkennungselemente zu entwickeln.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, im nahen Infrarot fluoreszierende einwandige Kohlenstoffnanoröhren für die molekulare Sensorik herzustellen, die mit biomimetischen Polymeren funktionalisiert wurden. Diese Nanosensoren können eine zeitaufgelöste Bildgebung in lebendem Gewebe ermöglichen. Zum Beispiel können sie zum Nachweis von Dopamin im Gehirn verwendet werden.Der Hauptvorteil dieser Sensoren ist ihre inhärente Nahinfrarot-Fluoreszenz, die eine Bildgebung tiefer in das Gewebe ermöglicht. Synthetische Sensoren ermöglichen die Detektion von Molekülen ohne natürliche molekulare Erkennungselemente, was diese generische Methode der Sensorentwicklung besonders nützlich für die Detektion kleiner Moleküle macht. Um eine Nukleinsäuresuspension von SWNTs herzustellen, lösen Sie zunächst Nukleinsäuren in 0,1 molaren Natriumchlorid auf eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter.Entfernen Sie in einem Abzug mit einer antistatischen Pistole die statische Elektrizität aus dem Einwegspatel, den Mikrozentrifugenröhrchen und dem SWMT-Schaft. Fügen Sie als nächstes 20 Mikroliter der Nukleinsäurelösung zu 980 Mikrolitern 0,1 molaren Natriumchlorid hinzu. Geben Sie dann 1 Milligramm gewaschene SWNTs in die resultierende Nukleinsäurelösung, bevor Sie die Mischung beschallen.Die Positionierung der Sondenspitze während der Beschallung ist von entscheidender Bedeutung. Wenn Schaumbildung auftritt, positionieren Sie die Sondenspitze neu und versuchen Sie, die Amplitude zu verringern. Alternativ können Sie es mit Impulsen der Beschallung oder der Badbeschallung versuchen, wenn die Suspension schlecht bleibt.Mit einem Ultraschallgerät mit einer Spitze von 3 Millimetern Durchmesser wird die Lösung 10 Minuten lang bei 40 % Amplitude in einem Eisbad beschallt. Die DNA-SWNT-Lösung wird zweimal für 90 Minuten bei 16.100 xg zentrifugiert. Sammeln und bewahren Sie den Überstand auf, wobei Sie darauf achten müssen, das Pellet, das die Bündel und Aggregate der Kohlenstoffnanoröhren enthält, nicht zu stören.Entsorgen Sie das Pellet gemäß den für Nanomaterialien geeigneten institutionellen Verfahren für gefährliche Abfälle. Die Lösungsextinktion wird bei 632 Nanometern mit einem UV-Vis-Spektralphotometer gemessen, um die ungefähre Konzentration der suspendierten SWNTs gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz und den entsprechenden Verdünnungsfaktor zu bestimmen. Bei amphiphilen Polymersuspensionen entfernen Sie zunächst die statische Elektrizität aus dem Einwegspatel, den Mikrozentrifugenröhrchen und dem SWNT-Material.In einem Abzug fünf Milligramm SWNTs auf fünf Milliliter 2%ige Natriumcholatlösung geben. Mit einem Ultraschallgerät mit einer Spitze von sechs Millimetern Durchmesser wird die Lösung eine Stunde lang bei 40 % Amplitude in einem Eisbad beschallt. Die Probe wird vier Stunden lang mit einer Ultrazentrifuge bei 150.000 xg zentrifugiert, bevor der Überstand vorsichtig entnommen wird.Als nächstes lösen Sie 1 % des Gewichts des amphiphilen Polymers in der scSWNT-Lösung. Anschließend dialysieren Sie die Polymer-scSWNT-Lösung fünf Tage lang mit einer 3,5-Kilodalton-Dialysemembran gegen einen Liter deionisiertes Wasser oder Puffer. Wechseln Sie das Wasser oder den Puffer in der zweiten und vierten Stunde.Messen Sie die Lösungsextinktion bei 632 Nanometern mit einem UV-Vis-Spektralphotometer, um die ungefähre Konzentration der suspendierten SWNTs zu bestimmen. Zur Vorbereitung der BSA-Biotin-beschichteten Objektträger reinigen Sie einen Objektträger und ein 0,17 Millimeter großes Deckglas mit deionisiertem Wasser, gefolgt von Methanol, Aceton und einer abschließenden Spülung mit deionisiertem Wasser. Erstellen Sie Kanäle, indem Sie mehrere Stücke doppelseitiges Klebeband im Abstand von etwa fünf Millimetern auf den sauberen Objektträger legen.Versiegeln Sie die Kanäle, indem Sie einen langen Glasabdeckzettel nehmen und ihn auf die Oberseite des doppelseitigen Klebebandes drücken. Achten Sie darauf, es auf dem Objektträger so zu zentrieren, dass die Kanten des Deckglases und des Objektträgers nicht bündig sind. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter BSA-Biotin-Stammlösung zu 900 Mikrolitern 1x Tris-Puffer bis zu einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu.Fließen Sie 50 Mikroliter der BSA-Biotin-Lösung in den Kanal, indem Sie die Lösung in ein Ende pipettieren und die Lösung am anderen Ende mit einem Taschentuch ableiten. Nachdem Sie die Lösung fünf Minuten lang inkubiert haben, führen Sie drei bis fünf Spülungen mit 50 Mikrolitern 0,1 molar Natriumchlorid durch. Als nächstes verdünnen Sie 40 Mikroliter mit fünf Milligramm pro Milliliter NAV-Stammlösung in 960 Mikroliter 1x Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter.Fließen Sie 50 Mikroliter der NAV-Lösung in den Kanal, indem Sie die Lösung in ein Ende pipettieren und die Lösung am anderen Ende mit einem Taschentuch ableiten. Nachdem Sie den Objektträger zwei bis fünf Minuten lang inkubiert haben, führen Sie drei bis fünf Spülungen mit 50 Mikrolitern 0,1 molaren Natriumchlorid durch. Anschließend werden die Stammlösungen der suspendierten SWNTs und des bildgebenden Puffers auf eine Konzentration von 1 bis 10 Milligramm pro Liter verdünnt.Lassen Sie 50 Mikroliter dieser Lösung in den Kanal und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Spülen Sie überschüssige SWNTs vorsichtig mit 50 Mikrolitern Bildgebungspuffer ab. Um die reversible Reaktion von GT15-DNA-SWNTs auf Dopamin zu messen, montieren Sie zunächst die mit Sensoren beschichteten Kanäle auf den Fluoreszenzmikroskoptisch.Bringen Sie die Kanäle mit einem 100-fachen Ölobjektiv und einer Indium-Galliumarsenid-Kamera in den Fokus. Geben Sie dann 50 Mikroliter 100 mikromolare Dopaminlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung in den Strömungskanal und zeichnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität auf. Waschen Sie die Dopaminlösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus und beobachten Sie die Veränderung der Fluoreszenz der einzelnen SWNT-Sensoren.Um das Well-Platten-Screening auf die Analytreaktion von biomimetischen Polymer-SWNTs durchzuführen, pipettieren Sie gleiche Volumina des suspendierten SWNT-Sensors in jede Well. Verwenden Sie genügend Volumen, um den Boden der Vertiefung gleichmäßig zu bedecken. Pipettieren Sie dann Analyten aus der Screening-Bibliothek in die Well-Platten.Bereiten Sie jeden Analyten in dreifacher Ausfertigung vor, um potenzielle Schwankungen von Bohrung zu Bohrung und Schwankungen der Anregungsintensität oder der Temperatur zu berücksichtigen. Heben Sie das Objektiv an, während Sie die Emissionsspektren mit dem Spektrometer und dem Indium-Gallium-Arsenid-Array überwachen. Bei optimaler Position des Objektivs wird die Fokusebene ungefähr in der Mitte des Probenvolumens in der Vertiefung platziert, was einem Maximum der gemessenen Intensität entsprechen sollte.Nehmen Sie für jede Probenvertiefung eine Belichtungszeit von ein bis 10 Sekunden auf, um ein Spektrum zu sammeln. Vergleichen Sie die Emissionsspektren für jede Vertiefung mit einer Kontrolle, die nur SWNTs ohne zusätzlichen Analyten enthält, um die Fluoreszenzreaktion zu quantifizieren. Das Absorptionsspektrum von GT15-DNA-Nanoröhren-Sensoren zeigt mehrere Peaks, die gut dispergierten Kohlenstoffnanoröhren unterschiedlicher Chiralität entsprechen.Gezeigt wird die Nahinfrarotfluoreszenz von GT15 DNA-Nanoröhren-Sensoren. Interessanterweise verdoppelt sich die Fluoreszenzintensität als Reaktion auf Dopamin ungefähr. In dieser Abbildung zeigt die Nahinfrarot-Fluoreszenzmikroskopie einzelne GT15-DNA-Nanoröhrensensoren, die auf der Oberfläche eines Glasdeckglases immobilisiert sind.In Zukunft ist es wichtig, den Sensor für den In-vivo-Einsatz zu testen, z. B. die Erweiterung der Analytbibliothek um molekulare Konkurrenten, die Prüfung der Linearität der Reaktion im biologisch relevanten Konzentrationsbereich und auch die Prüfung der Reversibilität. Sobald dieser Ansatz beherrscht ist, kann er verwendet werden, um eine Bibliothek verschiedener synthetischer Sensoren aus Molekülen ohne bekannte molekulare Erkennungselemente zu erstellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Erfahren Sie die Funktionalisierung von SWNTs mit bio-mimetischen Polymeren für molekulare Sensorik. Diese Methode ermöglicht die Erkennung von Neurotransmittern wie Dopamin in lebendem Gewebe mittels Nahinfrarot-Fluoreszenz.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

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