Vasodilatation isolierter Gefäße und die Isolierung der extrazellulären Matrix von Fest-Haut Mäuse
24. März 2017
Wir beschreiben die Isolierung der kardialen extrazellulären Matrix von C57Bl/6J-Kontrollmäusen, Enghautmäusen und Engerhautmäusen, die mit dem IRF5-Hemmpeptid behandelt wurden. Wir beschreiben auch die Vasodilatationsstudien an den isolierten Gefäßen von C57Bl/6J, Engehautmäusen und Engerhautmäusen, die mit dem IRF5-inhibitorischen Peptid behandelt wurden.
Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren zur Isolierung der extrazellulären Matrix und zur ex vivo Vasodilatation ist die Untersuchung der IRF5-inhibitorischen Peptidbehandlung bei Nagetieren. Diese Methode kann helfen zu beantworten, wie Veränderungen in der extrazellulären Matrix das Fortschreiten der Krankheit verstärken oder abschwächen können. Der Hauptvorteil der Vasodilatationsstudien besteht darin, dass sie uns einen Einblick in die in vivo-Prozesse geben, ohne alle Signalkomponenten berücksichtigen zu müssen.
Die Isolierung der extrazellulären Matrix des Herzens kann auf andere Organe wie die Hintergliedmaßen oder die Lunge angewendet werden. Wir hatten die Idee, als wir anfingen, uns auf die Duplikation von Fibrillin bei der Tight-Skin-Maus zu konzentrieren, und erkannten die Auswirkungen einer veränderten extrazellulären Matrix und eines veränderten Zellverhaltens. Nachdem Sie die Maus betäubt und für die Operation vorbereitet haben, öffnen Sie die Haut mit einer Schere.
Schneiden Sie von der Brust bis zur Seite des Kieferknochens mit Sorgfalt, um das darunter liegende Gewebe zur Vorderseite des Kiefers hin nicht zu stören. Präparieren Sie dann die Faszienarterie, indem Sie das Weichgewebe um sie herum entfernen. Achten Sie dabei darauf, die Arterie nicht zu beschädigen.
Baden Sie das freiliegende Gewebe in Mopppuffer, damit es gesund bleibt. Sobald die Arteria fascialis vollständig freigelegt ist, fassen Sie die Faszialis proximal zur ersten Bifurkation distal bis zur Stelle, an der die Arterie durchtrennt werden soll. Schneiden Sie sie dann von der Mutterarterie ab und fassen Sie die Faszienarterie mit der Pinzette.
Schneiden Sie die beiden Äste ab, die von der Faszie kommen, und heben Sie dann das Gefäß vorsichtig an, während Sie die Verbindungen zum umgebenden Gewebe durchtrennen, bis die Bifurkation erreicht ist. Schneiden Sie an der Bifurkation beide Tochterarterien ab, um das Gefäß zu befreien, und geben Sie es in eine Schale mit Mopppuffer, wo es bis zur Verwendung hydratisiert bleibt. Um die Vasodilatation zu messen, bereiten Sie zunächst die Kanülierung der Gefäße vor.
Laden Sie Glaspipetten mit einem Enddurchmesser von 125 bis 175 Mikrometern mit Mopppuffer. Füllen Sie auch Lösungsbehälter mit Mopps. Kanülieren Sie nun die isolierten Gefäße.
Binden Sie sie mit Augennaht an Glaspipetten. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen in den Pipetten bilden. Montieren Sie anschließend die Gefäßkammern mit dem Videokamera-Aufsatz auf ein inverses Mikroskop.
Lassen Sie das Video durch das Messsystem des Videomessschiebers laufen, um eine Messung der Schiffe auf dem Bildschirm durchzuführen. Nun setzen Sie die Behälter in einem zweistufigen Verfahren unter Druck. Heben Sie zuerst die mit Mopps gefüllten Behälter in einer Höhe über dem Behälter an, um einen Quecksilberdruck von 20 Millimetern zu erzeugen.
Öffnen Sie die Leitung mit den Mopps zum Gefäß. Wenn das Gefäß unter Druck gesetzt wird, suchen Sie nach Anzeichen von Undichtigkeiten um die Schwellen herum und über die gesamte Länge des Behälters. Wenn keine Lecks gefunden werden, heben Sie die Behälter an, um einen Druck von 60 Millimetern Quecksilber zu erzeugen.
Prüfen Sie anschließend die Behälter erneut auf Undichtigkeiten. Sobald der Druck ohne Leckagen aufrechterhalten wird, wird das Gefäß 30 Minuten lang bei diesem Druck ausgeglichen. Messen Sie nach der Äquilibrierung die Vasodilatation als Reaktion auf einen Zinseszins.
Zuerst wird das Gefäß durch Zugabe von U46619 um die Hälfte bis zu drei Viertel verengt. Lassen Sie die Lösung die Gefäße sechs Minuten lang baden, damit sie sich stabilisiert. Geben Sie dann nach und nach die Testverbindung wie Acetylcholin in die Badlösung.
Erhöhen Sie alle zwei Minuten die Konzentration der Testlösung im Bad um 10, beginnend bei 000001 Molaren und fortschreitend auf 001 Molaren. Die Veränderungen in der Vasodilatation warfen Fragen zur Signalübertragung auf. Aber unser Fokus liegt auf dem Herzen.
Um den Einsatz von Tieren zu reduzieren, haben wir uns entschieden, die kardiale extrazelluläre Matrix zu isolieren, um uns auf die von außen initiierte Signalübertragung zu konzentrieren. Beginnen Sie damit, das Herz von einer betäubten Maus zu sammeln. Übertragen Sie es in ein Becherglas, das mit 15 Millilitern hypertonischem einprozentigem Natriumdodecylsulfat beladen ist.
Lassen Sie die Lösung unter leichtem Rühren auf einer Rührplatte bei Raumtemperatur 18 Stunden lang stehen. Ändern Sie die Lösung am nächsten Tag für 30 Minuten auf 15 Milliliter 5 Prozent Triton X100, gefolgt von 15 Millilitern PBS für 15 Minuten. Dann frieren Sie das ECM und den flüssigen Stickstoff in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein.
Nach dem Einfrieren das Tuch in einen vorgekühlten Mörser und Stößel geben und zu einem Pulver mahlen. Suspendieren Sie das Pulver in PBS mit einem zugesetzten Antibiotikum in einer Konzentration von 1:100 in einer viskosen Lösung. Beschallen Sie die Suspension 30 bis 60 Sekunden lang in einem Eisbad bei hoher Beschallungseinstellung.
Das ECM-Protein ist nun isoliert und muss kalt bleiben. Messen Sie vor der Verwendung des Proteins seine Konzentration mit einem Bradford-Assay. Das IRF5D-Peptid ist ein inhibitorisches Peptid, das sich stark von normalem IRF5 unterscheidet.
IRF5D hat nur 17 Aminosäuren und bindet an die Phosphorylierungsstelle von IRF5. Dadurch wird die Phosphorylierung und Homodimerisierung verhindert und somit die Bildung des aktiven Zustands von IRF5 gestört. Heterozygote Mäuse mit straffer Haut wurden drei Wochen lang subkutan mit IRF5D behandelt.
Die Anzahl der Neutrophilen und CD64 war, immunhistochemisch bestimmt, in der durchschnittlichen Anzahl der gefärbten Zellen pro Sichtfeld verringert. IRF5D-Behandlungen verbesserten die Acetylcholin-induzierte Vasodilatation der Fasziala-Arterien bei heterozygoten Mäusen mit enger Haut, die mit IRF5D behandelt wurden, im Vergleich zu denen, die mit Phosphatpuffer behandelt wurden. In kultivierten Myozyten, die aus dem Herzgewebe der transgenen Mäuse stammten, gab es mehr IRF5-positive Zellen in Kulturen von heterozygoten Mäusen mit enger Haut als in Kontrollmäusen.
Die Behandlung beider Kulturen mit IRF5D führte zu einer Reduktion der IRF5-positiven Zellkerne. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Herz dezellularisiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik auf viele Organe übertragen werden und hilft, eine Vielzahl von Fragen zu beantworten Und denken Sie daran, dass es wichtig ist, die Matrix nicht zu überverdauen.
Sie sollten auch ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Faszienarterie präpariert und aufhängt. Sobald diese Technik gemeistert ist, sollte sie etwa 60 Minuten dauern und kann auf nahezu jedem Gefäßbett angewendet werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, wie zerbrechlich das Endothel ist, gehen Sie bei der Dissektion mit Vorsicht vor.
Es ist nicht ungewöhnlich, eine gesunde glatte Muskulatur und ein geschädigtes Endothel zu haben.
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Übersicht
In diesem Artikel wird die Isolierung der extrazellulären Matrix des Herzens aus verschiedenen Mausmodellen und die anschließenden Untersuchungen zur Vasodilatation beschrieben. Der Schwerpunkt liegt auf dem Verständnis der Auswirkungen einer Behandlung mit einem IRF5-hemmenden Peptid auf den Krankheitsverlauf.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Kardiovaskuläre Biologie
- Forschung zur extrazellulären Matrix
Hintergrund
- Die Isolierung der extrazellulären Matrix ist entscheidend, um ihre Rolle bei der Krankheitsentstehung zu untersuchen.
- IRF5 ist an der Progression bestimmter Erkrankungen beteiligt.
- Tight-skin-Mäuse weisen veränderte Eigenschaften der extrazellulären Matrix auf.
- Studien zur Vasodilatation liefern Erkenntnisse zur vaskulären Funktion.
Zweck der Studie
- Isolierung der kardialen extrazellulären Matrix zur weiteren Analyse.
- Beurteilung des Einflusses des IRF5-hemmenden Peptids auf vaskuläre Reaktionen.
- Verständnis, wie Veränderungen der extrazellulären Matrix den Krankheitsverlauf beeinflussen.
Verwendete Methoden
- Isolierung der kardialen extrazellulären Matrix aus Mausmodellen.
- Ex-vivo-Vasodilatationsstudien an isolierten Gefäßen.
- Vergleich der Reaktionen zwischen Kontroll- und behandelten Mäusen.
- Chirurgische Vorbereitung der Mäuse zur Matrixisolierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung der extrazellulären Matrix des Herzens aus verschiedenen Mausstämmen.
- Die Vasodilatationsantworten unterschieden sich zwischen Kontroll- und IRF5-Peptid-behandelten Mäusen.
- Erkenntnisse über die Rolle der extrazellulären Matrix bei der vaskulären Funktion gewonnen.
- Mögliche Anwendungen der Isolationsmethode auf andere Organe.
Schlussfolgerungen
- Die Studie unterstreicht die Bedeutung der extrazellulären Matrix für die kardiovaskuläre Gesundheit.
- Die Behandlung mit einem IRF5-hemmenden Peptid zeigt Potenzial bei der Modifikation vaskulärer Reaktionen.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die Auswirkungen für das Krankheitsmanagement zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die mechanistische Absicherung von IRF5 als therapeutischem Ziel durch die Verknüpfung der Umgestaltung der extrazellulären Matrix mit vaskulärer Dysfunktion bei entzündlicher Fibrose. Der ex vivo-Vasodilatationsassay liefert quantitative, reproduzierbare Messwerte der endothelialen Funktion unabhängig von systemischen Störgrößen und unterstützt so die Zielvalidierung in präklinischen Modellen. Die Isolierung der krankheitsrelevanten extrazellulären Matrix erleichtert das phänotypische Screening und die Aufklärung von Signalwegen für die Entdeckung antifibrotischer Wirkstoffe.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft die therapeutische Hypothese, dass die Hemmung von IRF5 die proinflammatorische Signalübertragung und die Ablagerung der extrazellulären Matrix bei Tight-Skin-Mäusen verringert.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch Messung der nukleären Translokation von IRF5 und der downstreamen Expression von ICAM in Herzmuskelfasern.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem eine verbesserte endotheliale Vasodilatation als funktioneller Biomarker für die Zielinteraktion nachgewiesen wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Die isolierte extrazelluläre Matrix des Herzens bietet ein standardisiertes, krankheitsrelevantes System zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf das Zellverhalten und die Signalübertragung.
- Quantitative Ausgabe: Die ex vivo-Messung der Vasodilatation unter Verwendung von Dosis-Wirkungs-Kurven mit Acetylcholin ermöglicht eine präzise Beurteilung der endothelialen Funktion in isolierten Arteriae faciales.
- Plattformnutzung: Das Protokoll zur ECM-Isolierung kann auf den Hinterlauf, die Lunge oder andere Gefäßbetten übertragen werden, um die Validierung von Zielstrukturen über Organe hinweg zu unterstützen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verwendet das Tight-Skin-Mausmodell, das eine Fibrose und vaskuläre Dysfunktion aufweist, die der humanen Sklerodermie ähnelt.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Hemmung von IRF5 mit einer verminderten Veränderung der extrazellulären Matrix und einer verbesserten Vasodilatation und unterstützt damit die mechanistische Risikominderung für die klinische Translation.
- Nutzen des präklinischen Modells: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem eine zielgerichtete Verbesserung der vaskulären Funktion nach chronischer subkutaner Applikation gezeigt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in die Entdeckungskette von der Zielvalidierung bis zur präklinischen Wirksamkeitsbewertung integriert und ermöglicht die iterative Entwicklung von IRF5-modulierenden Verbindungen basierend auf vaskulären und Matrix-Phänotypen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Isolierung der extrazellulären Matrix, um die Outside-in-Signalgebung zu untersuchen, die die IRF5-Aktivierung und proinflammatorische Reaktionen antreibt.
- Screening: Stellt assaysbereite vaskuläre Gewebe mit reproduzierbaren Vasodilatationsreaktionen bereit, um die Wirkstoffpotenz und -selektivität zu bewerten.
- Analytik: Bietet quantitative abhängige Variablenmessungen (Gefäßdurchmesseränderungen) und statistische Auswertungen (EC50, Vasodilatation %), um Behandlungseffekte zwischen Gruppen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die molekulare Targetbindung (Reduktion von IRF5 im Kern) mit gewebeebenen Effekten (Umbau der extrazellulären Matrix) und funktioneller Verbesserung (Vasodilatation) in einem krankheitsrelevanten System.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kapazität zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen extrazellulärer Matrix und vaskulärem Gewebe über mehrere Organsysteme und Krankheitsmodelle hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die vaskuläre Funktion von systemischen Variablen isoliert wird, und erhöht so das Vertrauen in Zielstruktur-Krankheits-Beziehungen.
- Operationaler Wert: Standardisiert Verfahren zur Vasodilatation und ECM-Isolierung, verbessert die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren und ermöglicht die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten, indem die Hemmung des Zielmoleküls mit funktionellen vaskulären Ergebnissen verknüpft wird, wodurch das biologische Risiko in späteren Stadien bei Fibroseprogrammen verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von IRF5-gerichteten Therapien basierend auf nachgewiesener Verbesserung der endothelialen Funktion und der Matrixhomöostase.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrovaskulärer Dissektion, Druck-Myographie und Biochemie der extrazellulären Matrix.
- Benötigt spezialisierte Instrumente wie Video-Abstandsmesssysteme, inverse Mikroskope und Druckreservoirs für Vasodilatationsstudien.
- Erfordert die Standardisierung der Gewebehandlung, der Pufferzusammensetzung (MOPS) und der Kontraktionsprotokolle (U46619-Vorkonstriktion), um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung der ECM-Isolierung an nicht-kardiale Gewebe, einschließlich der Optimierung von Dekellularisierungsreagenzien (SDS, Triton X-100) und der Dauer.
- Praktische Einschränkung: Die Zerbrechlichkeit des isolierten Endothels erfordert eine sorgfältige Technik, um mechanische Schäden während der Kanülierung und Druckbeaufschlagung der Gefäße zu vermeiden.
