A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa oder A. baumannii

Das übergeordnete Ziel dieses nicht-chirurgischen intrabronchialen Infektionsverfahrens ist es, eine robuste bakterielle Lungenentzündung bei immunkompetenten Nagetieren zu etablieren. Diese Methode bietet einen Mehrwert für die Entdeckung und Entwicklung von Antibiotika, indem sie es ermöglicht, die Wirksamkeit potenzieller Behandlungen in einem immunkompetenten Modell für schwere Lungenentzündung zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine robuste und reproduzierbare Lungeninfektion mit vielen Isolaten herstellt, einschließlich solcher, bei denen die Tiere typischerweise neutropenisch sein müssen, oder Isolate, die mit anderen Methoden keine lebensfähige Infektion erzeugen.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesem Verfahren noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben. Die richtige Intubation ist ein blindes Verfahren, das das Erlernen des richtigen Gefühls erfordert, um die Luftröhre anstelle der Speiseröhre zu intubieren. Die richtige Intubation ist für jeden Wissenschaftler anders.

Der genaue Winkel der Kanüle ist möglicherweise nicht bei jedem gleich. Das Gespür für die Kämme der Luftröhre ist der Schlüssel. Diese Technik wird von Cindy Mininger, einer Wissenschaftlerin aus unserem Labor, vorgeführt.

Bereiten Sie zunächst salzhaltige Bakteriensuspensionen aus Nachtbrühenkulturen vor, wie im Textprotokoll angegeben, oder aus Agarplatten, wie hier gezeigt. Ernten Sie das Wachstum über Nacht von Agarplatten, indem Sie eine sterile Schlaufe verwenden, um die Kolonien von der Oberfläche zu kratzen. Übertragen Sie das geerntete Material in fünf Milliliter sterile Kochsalzlösung, bis eine trübe, undurchsichtige Suspension entsteht, und wirbeln Sie die Kultur vorsichtig auf, bis sie homogen ist.

Dann wird die Verdünnung seriell verdünnt und von jeder Verdünnung ein Aliquot gemäß dem Textprotokoll plattiert. Nach der Vorbereitung des Agars und dem Zusammenbau der notwendigen Werkzeuge für den Infektionsprozess aliquotieren Sie gemäß dem Textprotokoll neun Milliliter Agar in ein steriles Röhrchen und legen das Röhrchen dann in das Wasserbad, bis sich das Agar auf etwa 42 Grad Celsius ausgleicht. Geben Sie einen Milliliter der zuvor vorbereiteten salzhaltigen Bakteriensuspension in das Agarröhrchen.

Drehen Sie dann das Rohr mehrmals um, um es zu mischen und wieder ins Wasser zu geben. Legen Sie eine saubere Einwegmatte auf die Arbeitsfläche in der Nähe des Wasserbads. Um die Arbeitsfläche und das Intubationsgerät vorzubereiten, sterilisieren Sie zunächst die Metallkanüle und den Polyethylenschlauch gemäß dem Textprotokoll und übertragen Sie sie dann in ihrem Glasaufbewahrungsrohr auf die Arbeitsfläche.

Entfernen Sie dann die Kappe vom Aufbewahrungsschlauch und schieben Sie das Griffende der Kanüle an das offene Ende des Schlauchs. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette ein Stück Polyethylenschlauch aus dem Becherglas und führen Sie ihn durch das Innere der sterilen Metallkanüle ein, wobei Sie darauf achten, dass er sich frei bewegt. Platzieren Sie eine Leitmarkierung an einer vorgegebenen Stelle mit einem unauslöschlichen Stift.

Setzen Sie als Nächstes eine sterile Einwegnadel mit 25 Gauge auf das freie Ende des Polyethylenschlauchs ein, indem Sie die Nadel einige Millimeter in den Schlauch schieben. Verwenden Sie dann eine sterile Kochsalzlösung, um eine frische Einwegspritze von einem Milliliter zu füllen. Befestigen Sie die Spritze an der Nadel, die auf dem Polyethylenschlauch angebracht ist, und spülen Sie das gesamte Volumen der Kochsalzlösung durch den Schlauch.

Entsorgen Sie die gebrauchte Spritze im Behälter für scharfe Gegenstände. Füllen Sie dann eine neue sterile Einwegspritze von einem Milliliter mit dem Inokulum auf Agarbasis aus dem Wasserbad. Bringen Sie die 25-Gauge-Nadel und den Schlauch wieder an und spülen Sie das Agar durch den Schlauch, indem Sie den Kolben drücken, bis der Schlauch vollständig mit Agar gefüllt ist.

Nachdem Sie die Ratte gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, legen Sie das Tier in Rückenlage auf die Einwegmatte, wobei der Kopf nach rechts und der Schwanz nach links zeigt. Führen Sie anschließend das freie Ende der Metallkanüle in das Maul des Tieres ein. Drehen Sie die Kanüle so, dass das freie Ende nach oben abgewinkelt ist, und schieben Sie sie vorsichtig in die Luftröhre ein, wobei Sie die Kehlkopfstrukturen vorsichtig mit einer leichten Drehbewegung umgehen.

Bestätigen Sie das Einführen in die Luftröhre im Gegensatz zur Speiseröhre, indem Sie die Kanüle mehrmals leicht nach vorne und hinten schieben, während Sie mit dem linken Zeigefinger die Trachealringe abtasten. Um eine Intubation in die Luftröhre und nicht in die Speiseröhre zu gewährleisten, bewegen Sie die Kanüle leicht hin und her und tasten Sie nach den Rippen. Wenn die Kanüle sanft den Hals hinuntergleitet und die Rillen nicht zu spüren sind, entfernen Sie das Gerät und versuchen Sie es erneut.

Wenn die Kanüle die Bifurkation erreicht, an der sich die Luftröhre in die linke und die rechte Bronchie aufteilt, machen Sie eine leichte Drehbewegung zur linken Seite des Tieres, um sicherzustellen, dass die Kanüle in den linken Bronchus eingeführt wird. Ein häufiger Fehler besteht darin, die Inokula nicht tief genug in die Lunge zu bringen, was die Atemwege blockieren und die Atmung behindern kann. Wenn die Kanüle in den richtigen Winkel gedreht wird, sollte sie leicht in den linken Bronchus gleiten und sanft bis zur entsprechenden Tiefe vorrücken.

Schieben Sie die Metallkanüle vor, bis sich das Ende auf halbem Weg bis zu drei Vierteln der linken Lunge befindet, und bestätigen Sie mit der zuvor platzierten Führungsmarkierung, dass die entsprechende Tiefe erreicht ist. Wenn die Metallkanüle an Ort und Stelle ist, schieben Sie den Polyethylenschlauch einige Millimeter vor, indem Sie die zuvor angebrachte Führungsmarkierung auf dem Schlauch verwenden, um sicherzustellen, dass er nur weit genug vorgeschoben ist, um das Ende der Metallkanüle zu verlassen und die Lunge nicht zu punktieren. Wenn beide Kanülen an Ort und Stelle sind, verwenden Sie die beigefügte Spritze, um 100 Mikroliter Agarsuspension tief in den großen Lappen der linken Lunge zu injizieren.

Ziehen Sie einige Millimeter aus dem Schlauch heraus und entfernen Sie vorsichtig das intakte Intubationsgerät. Setzen Sie es wieder in das Glasvorratsrohr und setzen Sie das Tier in einen frischen Käfig, damit es sich erholen kann. Bereiten Sie die Arbeitsfläche und die Kanüle wie gerade für Ratten gezeigt vor, indem Sie die für Mäuse entsprechend dimensionierte Ausrüstung verwenden.

Verwenden Sie eine sterile 1-Milliliter-Einwegspritze und eine sterile 25-Gauge-Nadel, um die Mikroinjektionsspritze aus Glas mit steriler Kochsalzlösung zu füllen. Spülen Sie dann die Kochsalzlösung durch das wieder zusammengebaute Gerät. Verwenden Sie anschließend eine neue sterile Einwegspritze von einem Milliliter und eine sterile 25-Gauge-Nadel, um die Mikroinjektionsspritze mit dem Agar-Inokulum zu füllen.

Bauen Sie dann das Gerät wieder zusammen und spülen Sie das Agar durch den Schlauch, bis der Schlauch vollständig mit Agar gefüllt ist. Nachdem Sie die Maus gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, positionieren Sie das Tier in der gleichen Ausrichtung, wie bei der Ratte gezeigt, und intubieren Sie die Luftröhre mit gleichmäßigem, aber sanftem Druck auf ähnliche Weise wie bei der Ratte. Vermeiden Sie die Anwendung von Gewalt, da die Technik bei Mäusen heikler ist.

Stellen Sie sicher, dass die Kanüle in die Luftröhre eingeführt wird, indem Sie nach den Trachealringen tasten. Drehen Sie die Kanüle leicht und schieben Sie sie in den linken Bronchus vor, indem Sie sie mit zuvor platzierten Führungsmarkierungen tief in die Lunge einführen. Wenn die Metallkanüle an Ort und Stelle ist, schieben Sie den Polyethylenschlauch einige Millimeter vor und träufeln Sie 20 Mikroliter Agar-Suspension.

Hier ist ein repräsentatives Beispiel von Kolonien zu sehen, die auf einer Agarplatte wachsen, nachdem eine Lungenhomogenatprobe seriell verdünnt und dreifach plattiert wurde. Wie in dieser Grafik mit S. pneumoniae gezeigt, wird in der infizierten Lunge bei den meisten Bakterienisolaten typischerweise ein Anstieg der bakteriellen Belastung um mehrere KBE zur logarithmischen Basis zehn über den Ausgangswerten beobachtet, selbst 96 Stunden nach der Infektion, und die Variabilität zwischen den Tieren ist gering. In diesem Experiment wurden zwei Verbindungen gegen Chinolon-anfällige oder Chinolon-resistente Isolate von S. pneumoniae untersucht, um zu veranschaulichen, dass dieses Lungeninfektionsmodell bei der Optimierung einer Leitchemie zur Unterstützung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen verwendet werden kann.

Jedes Symbol steht für KBE, die aus der Lunge einer Ratte bestimmt wurde. Hier sind E-Max-Modelle gezeigt, die unter Verwendung von Dosisfindungs-Wirksamkeitsdaten in immunkompetenten Mäusen erstellt wurden, die in der Lunge mit Isolaten von S. pneumoniae oder H. influenzae infiziert wurden, um pharmakokinetische, pharmakodynamische Ziele für einen neuartigen Polypeptid-Deformylase-Inhibitor zu bestimmen. Die Kreise stellen die mittlere bakterielle Belastung von vier bis fünf Mäusen pro Gruppe dar, die mit unterschiedlichen Dosen der Substanz behandelt wurden.

Die offenen Kreise stellen die freie Fläche unter der Kurve dar, und die gefüllten Kreise stellen die Fläche unter der Konzentrationszeitkurve über der minimalen Hemmkonzentration dar. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 30 Sekunden pro Tier durchgeführt werden, wobei bis zu fünf oder sechs Tiere pro Spritze Agar-Inokulum geimpft werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese nicht-chirurgische intrabronchiale Infektionsmethode durchführen und in der Lage sind, sie zur Etablierung von Lungeninfektionen mit vielen verschiedenen Bakterienisolaten zu verwenden.

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