Name: A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa oder A. baumannii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Erfahren Sie eine nicht-chirurgische intrabronchiale Infektionsmethode zur Erzeugung robuster bakterieller Pneumonien bei immunkompetenten Nagetieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Bewertung antibakterieller Therapien.

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JH möchte seiner Anerkennung und danken Mentor, Freund und ehemaliger Manager Valerie Berry für uns zuerst dieses Modell unterrichten; und Gary Woodnutt, der uns die Grundlagen gelehrt und inspiriert unser Engagement auf dem Gebiet der antibakteriellen PK / PD. Alle Autoren wünschen David Payne für seine Unterstützung und Anerkennung für unsere Wissenschaft zu danken. Wir möchten , dass unsere früheren In - vivo - Mikrobiologie Kollegen zu erkennen , die auf den Körper von Daten beigetragen , diese Verfahren erzeugt mit, vor allem Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Seite und Nerissa Simon. Schließlich danken wir unseren in vitro Mikrobiologie Kollegen für ihre Unterstützung, insbesondere für die Bereitstellung aller MHK wir (Lynn McCloskey, Josh Westen und Sharon Min) verlangen; und für unsere klinischen Mikrobiologie-Team, die kompetente Beratung und Unterstützung (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman und Deborah Butler) zur Verfügung stellt.

<ol><li>Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%27+vs.+%27discontinuous%27+therapy+with+penicillin%3A+the+effect+of+the+interval+between+injections+on+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy.</a> N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).</li>
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<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tricyclics+%28e.g.+GSK945237%29+as+potent+inhibitors+of+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).</li>
<li>Hoover, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics%2Fpharmacodynamics+of+peptide+deformylase+inhibitor+GSK1322322+against+Streptococcus+pneumoniae%2C+Haemophilus+influenzae%2C+and+Staphylococcus+aureus+in+rodent+models+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).</li>
<li>Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+bacteriological+efficacy+of+pharmacokinetically+enhanced+amoxicillin-clavulanate+against+Streptococcus+pneumoniae+with+elevated+amoxicillin+MICs+and+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).</li>
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<li>Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).</li>
<li>Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren sind alle Mitarbeiter von Glaxosmithkline Pharmaceuticals und eigene Aktien des Unternehmens innerhalb des Unternehmens bezahlt.

Für einen optimalen Erfolg in diesem Infektionsmodell reproduzieren, sollten die folgenden zusätzlichen Vorschläge berücksichtigt werden. 3 mal in vivo vor der Verwendung in einer Studie - Virulenz neuer Isolate können durch Passagierung 2 verbessert werden. Gefrorene Bakterien Bestände sollten immer von einem primären in vivo abgeleitetes Quelle mit möglichst wenigen Passagen wie möglich von der ursprünglichen hergestellt werden und erneutes Gefrieren oder Wiederverwendung von aufgetauten Lager wird abgeraten. kürzlich durchgeführten klinischen Isolaten von Patienten mit Lungenentzündung erholt Verwendung und / oder Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase der Vorbereitung können auch Etablierung der Infektion zu verbessern. Eine fünffache Verdünnung in den Agar (zB 2 mL Kochsalzsuspension zugesetzt 8 ml Agar) kann anstelle von verwendet werden zehnfach das bakterielle Inokulum zu erhöhen und das Inokulum Volumen eingestellt werden kann , von der Größe des Tieres basiert (beispiels 200 &amp; mgr; l / Tier wird in der Regel in 250 g Ratten geimpft). Bevor die Salzbakteriensuspension in die zum HinzufügenAgar ( das heißt bei dem Schritt 2.3) kann die Bakteriendichte durch visuelle Inspektion vorausgesagt oder geschätzt werden, MacFarland Standard oder Messungen der optischen Dichte. Es ist hilfreich , vertraut zu werden mit den in - vitro - Wachstumseigenschaften für jede der Durchführung in vivo - Experimenten vor isolieren. Konsistenz in Wachstum und Handhabung ermöglicht, die genaueste Abschätzung der Bakteriendichte für jeden gegebenen isolieren. Standard mikrobiologische Verfahren, die von denen beschrieben wird, wie beispielsweise alternative Medien und Gewebe Homogenisatoren unterscheiden, können geeignet verwendet werden zur Herstellung von Inokula und Bakterien aus infizierten Geweben aufzählt. Es wird dringend vor dem Experiment der Agar den Tag vorzubereiten oder zu schmelzen empfohlen und speichern Sie es über Nacht in einem separaten Wasserbad auf 50 ° C eingestellt. Dies wird den Prozess vereinfachen und Schutz gegen die Agar zum Zeitpunkt der Infektion zu heiß. Eine Temperatur von 41 bis 42 ° C erreicht, eine gute Balance zwischen der Wartung desning der Agar in flüssigem Zustand ohne kurzfristige Überleben der Bakterien für zu heiß. Als mögliche Alternative zu Nähragar wurde noble Agar wurde in einigen Versuchen erfolgreich eingesetzt. Ein Rohr aus Agar Inokulum in der Regel ausreichend für eine gesamte Experiment (und empfohlen wird), sondern mehrere Rohre können zum Infizieren einer großen Anzahl von Tieren hergestellt werden (beispielsweise mehr als 60) , oder wenn das infizierende Vorgang dauert länger als 30 - 45 min Wenn mehrere Inokulum Rohre erforderlich sind, fügen die Salzbakteriensuspension in jedes Röhrchen Agar, wie es benötigt wird. Dies reduziert das Risiko, dass bakterielle Überleben und / oder Eignung wird durch verlängerte Exposition gegenüber einer erhöhten Temperatur vor der Inokulation berührt. Es sollte beachtet werden, dass die Verwendung mehrerer Inokulum Rohre auch zusätzliche Randomisierung Tierverfahren erfordern. Wann immer möglich, infizieren alle Tiere aus dem gleichen Inokulumzubereitung. Es wird empfohlen, die Größe der Experimente auf dem aktuellen Stand der Kenntnisse im Umgang mit dem te zuzuschneidenchnique. Ein erfahrener Wissenschaftler kann ein Tier in weniger als 30 s intubieren und impfen und impfen bis 5 - 6 Tiere pro Charge (dh mit einer Spritze voller Agar Inokulum). Für diejenigen, die Technik zu lernen, ist die Geschwindigkeit wichtig wie die Agar beginnt zu verfestigen; jedoch eine genaue Platzierung des Inokulums ist wichtiger. Beginnen Sie mit 1 oder 2 Tiere pro Charge, und erhöhen so die Technik vertrauter wird. Die Tiere auch weiterhin während der Intubation zu atmen; Somit hängt die Zeitfenster für die Inokulation ab, wie schnell sich das Tier erholt sich von Isofluran, die etwa 2 sein sollte - 3 min. Tiere, die während des Prozesses erwecken können wieder narkotisiert und ein zweites Mal versucht, aber es wird nicht empfohlen, so wiederholt zu tun. Erfolgreiche Impfung beim ersten Versuch wird in fast 100% der Tiere zu erwarten, wenn Fähigkeits erreicht wird. Beachten Sie, dass es einfacher ist, die Technik unter Verwendung von Ratten zu erlernen zuerst; Mäuse sind empfindlicher und je kleiner zuls sind anfälliger mit verfestigten Agar zur Verstopfung, wenn nicht schnell manipuliert. Vorwärmen Spritzen, Schläuche und Kochsalzlösung sowie die Intubation Gerät an einem warmen (nicht heißen) Oberfläche, wie ein Heizkissen auf niedriger Einstellung zu halten, helfen Verfestigung des Agar verhindern kann. Wenn die Technik lernen, ist es auch hilfreich, die richtige Platzierung des Inokulums zu praktizieren unter Verwendung eines dunkel gefärbten Farbstoff (wie konzentrierte Methylenblau) anstelle der Bakteriensuspension in Agar. Führen Sie das Verfahren wie beschrieben, aber einschläfern das Tier unmittelbar nach der Inokulation des Farbstoffs (nicht erlaubt, das Tier zwischen Anästhesie und Euthanasie zu erholen). Sezieren, um zu bestimmen, wo der Farbstoff angeordnet ist, und entsprechend anpassen Technik. Der primäre Endpunkt in diesem Modell ist CFU aus infizierten Lunge. Überleben ist kein guter Indikator für die bakterielle Belastung und ist keine empfohlene Endpunkt. Für Wirksamkeitsstudien ist die vorgeschlagene N 5 - 6 Tiere pro Gruppe, wie dies predicte istd ≥1 log 10 CFU Unterschiede zwischen den Gruppen mit mindestens 90% Leistung zu erfassen. Tiere können in Gruppen angesteckt werden, so dass Käfiggenossen zusammen bleiben, oder eine wahre Randomisierung Prozess verfolgt werden kann. Beachten Sie, dass, wenn Gruppen von Käfig zugeordnet sind, sollten die Gruppen mit den am Ende der Studie Wachstumskontrollen in einer zufälligen Sequenz infiziert werden zuletzt infiziert (um die bakterielle Überlebens bestätigen / Fitness wurde nicht durch die Länge der Zeit einer erhöhten Temperatur ausgesetzt betroffen im Wasserbad). Keine Daten censoring Methoden sollten notwendig sein, und keine sind, mit Ausnahme der unmittelbaren Entfernung von jedem Tier zu empfehlen, die offensichtlich falsch inokuliert zu Beginn der Studie (vor der Einleitung irgendwelcher Behandlungen) gewesen ist. Tiere , die vor dem Ende der Studie eingeschläfert werden sollte , es sei denn für den Ausschluss eines triftigen Grundes im Datensatz abgetastet und die Ergebnisse einbezogen werden prospektiv identifiziert (dh ein Ereignis in keinem Zusammenhang mit der Infektion oder Behandlung). Drug Verschleppung kann affeinige Proben ect und ist eine wichtige Überlegung für alle in vivo Infektionsmodellen. Wenn eine Verbindung häufig gegeben ist, in der Nähe der Zeit der Euthanasie oder hat eine lange Halbwertszeit, kann es bei einer ausreichend hohen Konzentration im Gewebe Homogenat vorhanden sein , um weiterhin Bakterien ex vivo während der bakteriellen Enumerationsprozess (Verdünnung und Plattierung des Tötens die Proben oder auf den Agarplatten während der Inkubation über Nacht). Um dem vorzubeugen, Aktivkohle und / oder ein Additiv, das das aktive Molekül abbaut, ohne die Bakterienzellen schädigen können vor der Homogenisierung zu der Probe gegeben werden. Andere Verfahren umfassen die Proben Zentrifugieren der Mehrheit der aktiven Verbindung zu entfernen (die im Überstand bleiben soll) und unterschiedliche Verdünnungs Verwendung und Plattieren Schemata ausreichend den Wirkstoff in eine nicht-inhibitorische Konzentration verdünnen. Wie in Abbildung 2, dieses Modell durch die i gezeigten Beispielen belegt erfolgreichnduces Lungeninfektionen bei Nagetieren mit einem breiten Spektrum von Organismen einschließlich derer, die in anderen Modellen (zB H. influenzae) nicht gut wachsen. Diese Infektionen sind konsistent und reproduzierbar, was die Wahrscheinlichkeit reduziert wird, die Experimente benötigen aufgrund der Modellversagen wiederholt werden und / oder eine schlechte Leistung mit einem gegebenen Isolat. Obwohl die Tiere immunokompetenten sind, sind sie nicht in der Lage, die Infektion zu schnell zu lösen, wenn überhaupt. Dies ermöglicht eine größere Flexibilität bei der Studie der Länge, wie viele Isolate eine tragfähige Infektion durch mindestens 96 h, ohne die Notwendigkeit halten für wiederholte Injektionen Neutropenie zu halten. Der potenzielle Nutzen des Studierens antibakterieller Wirksamkeit bei Immun Tieren wurde 20 zuvor angemerkt, 21, und es gibt Hinweise , dass für einige Verbindungen (zB oxazolidinones), Daten aus nicht neutropenischen Nagetiere genauer die Exposition des Menschen Ziele vorhersagen kann , verglichen mit denen gemacht neutropenische 5. Der Mehrzweck-Verwendbarkeit von ter Modell ist in den Figuren gezeigt , 3 und 4 und den Tabellen 1 und 2. Diese Studien sind Teil einer großen Sammlung von veröffentlichten und nicht veröffentlichten Daten , die mit diesem Modell generiert wurde , um Lead - Optimierung Anstrengungen 16, 17, 22-24, zum Vergleich unterstützen und die Bestätigung der vorgeschlagenen menschlichen Dosierungsschemata 19, 25-29 und für PK / PD - Charakterisierung 18, 30-32 .Während dieses Modell zunächst komplexer ist , mit der intranasalen Inhalation Methode zur Durchführung verglichen, gibt es viele Vorteile , wie oben beschrieben. Mit etwas Übung und Routine zu verwenden, sollten die Techniken unkompliziert geworden auszuführen. Es kann in einigen Studien festgestellt werden, dass die bakterielle Belastung zu Beginn der Studie, dass niedriger war als in der Regel in anderen Lungeninfektionsmodellen gezielt. Dies ist zum großen Teil auf die gewünschte Verdünnung in Agar und das kleine Volumen Herausforderung, insbesondere bei Mäusen. Es sollte jedoch auch beachtet werden,dass das Bakterienwachstum wurde in allen Fällen gesehen, selbst wenn die anfängliche Belastung relativ gering war. Die Zielbasisbakterienbelastung ist 6 bis 6,5 log 10 KBE / Lunge (6,8 bis 7,3 log 10 KBE / g Gewebe bei Mäusen nach durchschnittlichen Lungengewichte) , die in menschlichen Patienten mit einer schweren Lungenentzündung 33 geschätzt Dichten entspricht. Eine höhere Basislast kann durch weitere Konzentration der Bakterieninokulum oder durch Verzögerung der Beginn der Verabreichung der Verbindung zu ermöglichen, zusätzliche Bakterienwachstum erreicht werden kann; aber zu viel der Herausforderung zunehmender Belastung kann zu abnorm schwere und akute Erkrankung führen (dh Tod in weniger als 24 h), die für alle antibakterieller Therapien refraktär ist unabhängig von der Anfälligkeit. Obwohl das Inokulum anfangs vorzugsweise in die linke Lunge des Tieres gelegt wird, breitet sich die Infektion im Allgemeinen überall in beiden Lungen. Progressives Lungenerkrankung, die Verbreitung der Bakterien auf andere Organe und eventuelle Morbidität ist oft observed mit S. pneumoniae, K. pneumoniae und P. aeruginosa. Von Interesse sind Infektionen mit H. influenzae und A. baumannii in der Regel mehr enthalten und nur selten in der vorgeschriebenen bakteriellen Inokula zum Tod führen. Die Ergebnisse zur Wirksamkeit von diesem Modell erhalten haben , gut korreliert mit in - vitro - Empfindlichkeit Profile sowie definierte PK / PD - Ziele. Kürzungen bei der bakteriellen Belastung sind für die Isolate als anfällig für den Agenten getestet, während die als resistent zeigen keine Veränderung oder Bakterienwachstum über dem Ausgangswert 16, 17, 19, 24-29 routinemäßig beobachtet. Studien an Ratten Auswertung zwei Chinolone und ein Makrolid dieses Modell 32 haben gezeigt , dass die PK / PD - Ziel für eine 10 Reduktion der S. pneumoniae Vergleich zum Ausgangswert mit dem in neutropenischen Mäusen bestimmt Ziel korreliert log 1-erforderlich und, was noch wichtiger ist , mit klinische Ziele für die Gemeinschaft erworbenen bakteriellen pneumonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, ein neuartiger Mechanismus Antibiotikum, wurde gegen mehrere S. pneumoniae getestet und eine ähnliche PK / PD - Ziel , die für eine 1-log 10 Reduktion in diesem Modell Lungeninfektion 31 , wie es für ein Modell 1-log 10 Reduzierung der neutropenische Oberschenkel erforderlich 36 , wenn Lungenpenetration wurde berücksichtigt ( die Daten - Datei) übernommen. In ähnlicher Weise waren die PK / PD - Ziele bestimmt in Mäusen für GSK2251052 gegen P. aeruginosa konsistent für Stase, 1- und 2-log 10 Reduktion der CFU zwischen diesem Lungenmodell 30 und dem neutropenische Oberschenkel - Infektionsmodell bei Lungen Penetration 37 betrachtet wurde, 38 . Die Korrelation mit einer Neutropenie-Modell Lungeninfektion unter Verwendung von intranasalen Impfung war schlecht; jedoch GSK2251052 nicht produzieren mehr als eine statische Reaktion in dieser Studie 38. Dies kann auf die höhere bakterielle Inokulum zurückzuführen sein, die 8 log 10 KBE / Maus war im Vergleich mit 6 log <sub&gt; 10 KBE / Maus in die neutropenische Oberschenkel 37 und intratracheale Intubation 30 Modelle. Sammlung von Daten, wie dies ist kritisch für Benchmark, da es einen direkten Vergleich mit bestehenden Modellen und Korrelation mit klinischen Daten erlaubt die translatorische Vorhersagefähigkeit zu bewerten. Mehr weit verbreitete Verwendung des Modells Lungeninfektion intratracheale Intubation wird für diese Art von Analysen zusätzlicher Daten. Es gibt einige Einschränkungen dieser immunokompetente Pneumonie-Modell. Erstens ist es nicht gut geeignet Entstehung von spontanen Resistenz gegen die Bewertung, da die hohe allgemein bakterielle Inokulum für solche Studien führt zu streng einer Infektion erforderlich. Nach Versuchen, bakterielle Belastungen von 7 oder 8 log 10 CFU zu Beginn der Studie zu erreichen, hat eine schnelle Morbidität beobachtet (dh Tiere , immer moribund in weniger als 24 h) trotz sorgfältigem Waschen der Inokula vorbestehenden Toxine (Daten - Datei) zu entfernen. Eskann möglich sein, dieses Problem zu überwinden, indem sie größere Nagetiere verwenden. Ratten, besonders schwerer Ratten (&gt; 250 g), scheinen besser höher Inokula zu tolerieren als mit Mäusen verglichen, und kann für diese Art von Untersuchungen geeignet sein. Eine zweite Einschränkung ist, dass die Verwendung von Agar als infektions Enhancer ausschließen kann das Modell zur Bewertung bestimmter Host mit: Pathogen-Interaktionen. Es wird angenommen, daß der Agar ein geschütztes Brennpunkt liefert, bis Infektion vollständig innerhalb der Lunge festgestellt wird. Es ist möglich, den Impfstoff in Kochsalzlösung statt Agar liefern zu helfen, dieses Problem zu überwinden; jedoch ist zu beachten, dass dies nur eine Infektion mit einigen Isolaten produziert. Drittens gibt es eine steile Lernkurve in der Technik vertraut zu machen erforderlich. Das Verfahren kann empfindlich, vor allem bei Mäusen sein. Es ist leicht, die Metallkanüle in die Speiseröhre fälschlicherweise zu platzieren, und eine übermäßige Kraft auf Einstich entweder der Speiseröhre oder der Luftröhre führen. Eine sorgfältige Platzierung des Inokulums ist aucherforderlich oder Tiere können entweder nicht erholen oder nicht ausreichend angesteckt werden. Doch mit Geduld und Ausdauer kann man sehr beherrschen und die Technik schnell durchführen, flüssig und präzise. Durch das Entfernen der Anforderung für Neutropenie, zunehmende Robustheit und Reproduzierbarkeit, so dass die Ermittler mehr Krankheitserreger und Isolate zu untersuchen, die Flexibilität der experimentellen Design zu verbessern und eine anspruchsvolle Infektion Pharmakodynamik für eine Lungenentzündung zu charakterisieren, diese immunokompetente Modell Lungeninfektion fügt einen wesentlichen Wert auf die Antibiotika-Entdeckung Gemeinschaft. Die verstärkte Nutzung dieses Modells durch zusätzliche Ermittler wird dazu beitragen, die notwendige Benchmarking sorgen dafür breitere Akzeptanz zu gewinnen und weiterhin unterstützende Informationen für eine angemessene Interpretation bieten.

Die Bewertung der Wirksamkeit von Wirkstoffkandidaten in Tiermodellen der Infektion ist ein wichtiger Bestandteil des antibakteriellen Wirkstoff-Forschung. In vivo liefern Wirksamkeitsstudien wichtige Daten für die Entscheidungsfindung über die Spanne der Entdeckung Bemühungen, aus Aufklären Struktur-Aktivitäts - Beziehungen (SAR) und Blei chemischen Serie durch pharmakokinetische-pharmakodynamische Bestimmung Optimierung (PK / PD) Eigenschaften von Verbindungen und die Wahl der Dosis Unterstützung für klinische Entwicklung und Zulassung. Zahlreiche Tierinfektionsmodellen sind für diese Zwecke in der Literatur beschrieben. Eines der am häufigsten und am weitesten verbreiteten Modelle ist die neutropenischen Maus Oberschenkelinfektion, die von Eagle 1, 2 und später erweitert durch Vogelman und Craig 3, 4 Pionierarbeit geleistet wurde. Dieses Modell wurde für die Unterstützung Bestimmung der bakteriellen Anfälligkeit Grenzwerte und für die Bereitstellung von PK / PD-Ziele von unschätzbarem Wert menschlichen Dosierung zu führen. Es gibt viele Prüfungples , wo die Vorhersagefähigkeit dieses Modells hat 4-7 bewährt. Allerdings ist einer der Nachteile des Oberschenkels Infektionsmodell ist das Fehlen von direkter Bedeutung für Lungeninfektionen. Es gibt jetzt eine stärkere Betonung der Ort der Infektion in Tiermodellen an den Ort der Infektion beim Menschen entspricht; und somit zu untersuchen Verbindungen zur Behandlung von Lungenentzündung, ist es ideal, eine Lungeninfektionsmodell in Tieren zu verwenden. Mehrere Verfahren zur Lungeninfektionen bei Labortieren induziert wurden für die antibakterielle Wirksamkeit Studien einschließlich intranasale Inhalation, Aspiration über den Mund - Rachen - Route, Aerosolexposition und chirurgische intratracheale Inokulation 8 beschrieben und verwendet. In vielen Fällen müssen die Tiere (vor allem Mäuse) erste neutropenische gemacht werden, um eine stabile Lungeninfektion zu erreichen. Trotz dieser stark immungeschwächten Zustand, die Anzahl der bakteriellen Pathogenen und Stämme, die tragfähige Infektionen bei Nagern zu produzieren istbegrenzt. Zum Beispiel kann es schwierig sein , erfolgreich Haemophilus influenzae oder Acinetobacter baumannii in Pneumonie Modellen 9, 10, und noch mehr virulenten Pathogenen wie Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella pneumoniae, kann pose 11-13 Herausforderungen zu etablieren. Im Jahr 1991 beschrieb Smith ein Modell Lungeninfektion bei Immun entwöhnten Ratten , bei denen eine Infektion durch Einträufeln Bakterien direkt in die Lunge über eine einfache nicht - chirurgischen intratracheale Intubation Verfahren 14 hergestellt wurde. Berry et al. später geändert , um die Verfahren für Mäuse 15 zu infizieren. Unter Verwendung eines Agar-basierten Impfstoff, diese Impfung Technik induziert robuste Lungeninfektionen in immunokompetente Ratten und Mäuse mit S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii. Es ist offen für ein breites Spektrum von Isolaten, einschließlich der Beherbergung verschiedene widerance Determinanten und solche, die nicht über eine tragfähige Infektion durch andere Impfung Wege produzieren. Es ermöglicht auch die Wirksamkeit bei immunokompetente Tieren bestimmt werden, eine Bedingung, die für Patientengruppen relevanter ist als die traditionellen neutropenische Mausmodell ist, das nicht stark immungeschwächten sind. Die Konsistenz und Zuverlässigkeit dieses Modells auf mehrere Krankheitserreger und Isolate macht es für antibakterielle Wirksamkeit Studien gut geeignet.

<table><tbody><tr><td>TSA II Trypticase Soja Agar mit 5% Schafsblut</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321261</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate II Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321267</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Broth Modified</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>299070</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase Soja Bouillon mit 20% Glycerin</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>297808</td><td>Speichermedien für Tiefkühllager</td></tr><tr><td>Impföse</td><td>Nunc</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % Natriumchlorid, USP</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>Difco Nähr-Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>213000</td><td></td></tr><tr><td>30 mL freistehendes Zentrifugenröhrchen mit Kappe</td><td>EverGreen Scientific</td><td>222-3530-G80</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisches Polypropylen-Röhrchen 30 x 115 mm</td><td>Falcon, a Corning Brand</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polypropylen-Schlauch mit rundem Boden 17 x 100</td><td>mm Falcon, ein Corning Brand</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Guide Tool</td><td>Intek Services Ltd</td><td>GT01</td><td>maßgefertigte Metallkanüle für Ratten</td></tr><tr><td>90' Portex-Schlauch</td><td>SAI</td><td>POR-080-100</td><td>Kunststoffkanüle für Ratten</td></tr><tr><td>1 mL TB Spritzen-Slip-Spitze</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel 25 G x 5/8</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Tierfütterungsnadel - gerade 20 x 3" 2-1/4</td><td>Popper and Sons, Inc</td><td>7903</td><td>zur Herstellung einer Metallkanüle für Mäuse Intramedic</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td>Marke Clay Adams - Becton Dickinson and Company</td><td>427401</td><td>Kunststoffkanüle für Maus&nbsp;</td></tr><tr><td>75 TN 5.0 und Mikro; L Spritze 26s/2"/2</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>HPLC Glasinjektionsspritze</td></tr><tr><td>Pyrex Röhrchen, Kultur 25x150 Schraubverschluss mit Gummiauskleidung</td><td>Corning</td><td>9825-25</td><td>zum Autoklavieren/Aufbewahren von Metallkanülen</td></tr><tr><td>70% Isopropylalkohol</td><td>Vi-Jon (Schwan)</td><td>NDC 0869-0810-43</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran, USP</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher&nbsp;</td><td>Seward</td><td>Stomacher80</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 classic</td> bags <td>Seward</td><td>BA6040</td><td></td></tr><tr><td>Assay Platte, 96 Well, runder Boden</td><td>Costar, Corning Inc</td><td>3795</td><td>optional, zum seriellen Verdünnen</td></tr><tr><td>von Blut Omni Plates</td><td>Hardy</td><td>#A127</td><td>optional, rechteckige Blutplatten</td></tr></tbody></table>

a robust pneumonia modell in intaktem immunsystem nagetiere zur bewertung antibakterieller wirksamkeit gegen<i&gt; s. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; h. influenzae</i&gt;,<i&gt; k. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; p. aeruginosa</em&gt; oder<em&gt; a. baumannii</em

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Wirksamkeit von Kandidatenantibakterielle Behandlungen müssen in Tiermodellen der Infektion als Teil der Entdeckung und Entwicklung von Verfahren, vorzugsweise in Modellen gezeigt werden, die die beabsichtigte klinische Indikation nachahmen. Ein Verfahren zum Induzieren robust Lungeninfektionen bei immunkompetenten Ratten und Mäusen beschrieben , die durch S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae oder A. baumannii zur Bewertung von Behandlungen in einem Modell der schweren Lungenentzündung verursacht werden können. Die Tiere werden betäubt und ein Agar-basierten Impfstoff wird tief in die Lunge über nicht-chirurgische intratracheale Intubation hinterlegt. Die sich ergebende Infektion ist konsistent reproduzierbar und stabil für mindestens 48 h und bis zu 96 h für die meisten Isolate. Studien mit vermarktet Antibakterika haben eine gute Korrelation zwischen in vivo - Wirksamkeit unter Beweis gestellt und in - vitro - Empfindlichkeit und Übereinstimmung zwischen Pharmakokinetik / Pharmakodynamik Ziele bestimmtin diesem Modell und klinisch akzeptierten Ziele beobachtet. Obwohl es eine anfängliche Zeitaufwand, wenn die Technik Lernen, kann es schnell und effizient durchgeführt werden, sobald Eignungs erreicht wird. Die Vorteile des Modells gehören Beseitigung der neutropenische Anforderung, erhöhte Robustheit und Reproduzierbarkeit, die Fähigkeit, mehr Krankheitserreger und isoliert, eine verbesserte Flexibilität in Studiendesign und Einrichtung einer herausfordernden Infektion in einem immunkompetenten Wirts zu studieren.

Die Werkzeuge erforderlich, die Ausrichtung des Tieres, und die Tiefe der Intubation sind in Abbildung 1 dargestellt. ist auch ein repräsentatives Beispiel der Kolonien auf eine Agar-Platte nach serieller Verdünnung und dreifach Plattieren einer Lungenhomogenat Probe gezeigt. Eine Erhöhung der bakteriellen Belastung von mehreren log 10 CFU über dem Ausgangswert steuert , ist typischerweise in infizierten Lunge für die meisten bakteriellen Isolate, auch bei 96 h nach der Infektion beobachtet, und die Variabilität zwischen den Tieren niedrig ist (Abbildung 2). Für einige H. influenzae, kann es wenig Wachstum; Allerdings beginnen die Infektion sollte nicht selbst beheben innerhalb eines 48 oder 96 h Zeitperiode (2B). Diese Lungeninfektionsmodell kann bei der Optimierung von Blei chemischen Serie verwendet werden SAR zu unterstützen, wie 16 in Figur 3 für repräsentative Verbindungen von zwei unterschiedlichen Serien gezeigt, 17. Es bietet eine konsistente und reproduzierbare erfüllthod für PK / PD in immunokompetente Tiere Bewertung und verwendet wurde , dass der freie Arzneimittel Fläche unter der Konzentrations-Zeit - Kurve über die minimale Hemmkonzentration (fAUC / MIC) mit Wirksamkeit eines neuartigen Polypeptid Deformylase (PDF) Inhibitor gegen S. pneumoniae korreliert , um zu bestimmen und H. influenzae (Abbildung 4). Zusätzlich von der fAUC / MIC Ziele für Stase und eine 1-log Reduktion in CFU 10 Baseline - Kontrollen in 11 S. pneumoniae und H. influenzae 5 Isolaten (Tabelle 1) 18 bestimmt. Die Kopplung dieser Infektionsmodell mit einem Arzneimittelabgabesystem menschlichen pharmakokinetischen Profile in Ratten neu schafft ein leistungsfähiges Werkzeug für die menschliche Dosierungsschemata vor der klinischen Studien zu bewerten. Ein Beispiel hierfür ist in Tabelle 2 zusammengefasst , die zeigt , dass eine Extended-Release - Formulierung von Amoxicillin-Clavulanat effektiver als bestehende Dosierungsschemata für Organismen mit eleva warted MIC - Werte 19. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig1.jpg" /> Abbildung 1: Nonsurgical Intratracheale Intubation. Die Werkzeuge werden für Intubation die Ratte (A) und der Maus (B) gezeigt. Einmal betäubt, sollte das Tier positioniert werden , wie in C gezeigt, mit dem Kopf nach rechts und Schwanz nach links , wenn die Person , die Technik der Durchführung ist Rechtshänder. Stellen Sie den linken Zeigefinger sanft auf den Hals zu helfen, die Trachealringe zur Bestätigung der korrekten Kanülenplatzierung abtasten. Das Inokulum sollte tief in die linke Lunge platziert werden, wie in der ventralen Ansicht eines Rattenlunge (D) gezeigt ist . Die Kolonien wachsen auf Agar nach Reihenverdünnung und Plattierung einer Probe sollte gezeigt , dass in E ähnlich erscheinen. 1D Copyright © Gill Smith [Labortiere, Band 25 (1991), G. Smith, Aeinfache , nicht-chirurgische Methode der intrabronchiale Instillation für die Einrichtung von Atemwegsinfektionen bei der Ratte, Seiten 46-49] 14. Abdruck mit freundlicher Genehmigung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Beispiele für Bakterienwachstum in den Lungen infizierter Tiere. Mittelwert ± Standardabweichung CFU Daten von N = 5 Tiere / Gruppe wird für verschiedene Isolate von S. pneumoniae (A) gezeigt, H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) und A. baumannii (E). Der erste Balken jedes Paares (hellgrau) ist das Basis bacterial Belastung bei 1 oder 2 h nach der Infektion, während die zweite Bar ist der End-of-Studie Wachstumskontrolle erfolgt nach 48 Stunden nach der Infektion (dunkelgrau) oder 96 h nach der Infektion (schwarz). Keine Daten Zensierung Methoden angewendet wurden; Somit sind diese Ergebnisse von Daten aus allen 5 Tieren pro Gruppe. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Wirksamkeit von verschiedenen chemischen Serie während der Leitstrukturoptimierung auswerten. Lung Infektion Modelle, die beschriebenen Techniken wurden verwendet, um Struktur-Aktivitäts-Beziehungen im Rahmen der abacterial Typ IIA Topoisomerase-Programm zu erkunden. Viel versprechende Verbindungen 7 und 1 wurden gegen ausgewertet quinolone anfälligen (A) 16 oder Chinolon-resistente(B) 17 Isolate von S. pneumoniae sind. Jedes Symbol steht für CFU aus der Lunge von einer Ratte bestimmt mit Linien, die die Gruppe Mittelwert und Standardabweichung. Untere Grenze (LLQ) betrug 1,7 log 10 KBE / Lunge. Verbindungen wurden gewogen (56 oder 112 mg reines Molekül frei parent), in 9 ml sterilem Wasser gelöst, verdünnt 3 mL in 3 mL Wasser (1: 1) und durch orale Gabe von 1 ml / 125 g Ratte zweimal täglich verabreicht ( 6 - 7 h auseinander) für 2 Tage, beginnend bei 1 h nach der Infektion. Nicht-behandelten Kontrollen (NTC) wurden bei 1 h nach der Infektion für die Basislinie abgetastet oder mit Kochsalzlösung behandelt, und am Ende der Studie (48 h) zum Wachstumskontrollen abgetastet. 3A nachgedruckt von Bioorganische &amp; Medicinal Chemistry Letters, Band 21, TJ Miles et al, Roman cyclohexyl-Amide als potente antibakterielle Mittel Targeting bakterielle Typ IIA topoisomerases, Seiten 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, mit Genehmigung von Elsevier.3B nachgedruckt von Bioorganische &amp; Medicinal Chemistry Letters, Band 26, TJ Miles et al, Roman tricyclics (zB GSK945237) als potente Inhibitoren von bakteriellen Typ IIA topoisomerases, Seiten 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, mit Genehmigung von Elsevier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig4.jpg" /> Abbildung 4: PK / PD - Charakterisierung eines neuen PDF - Inhibitor. Emax - Modelle wurden unter Verwendung erstellt Wirksamkeitsdaten in immunkompetenten Mäusen Dosis im Bereich in der Lunge infiziert mit Isolaten von S. pneumoniae (A) oder H. influenzae (B) PK / PD Ziele für einen neuen PDF - Inhibitor 18 zu bestimmen. Kreisestellen die mittlere bakterielle Belastung von 4 bis 5 Mäuse / Gruppe mit unterschiedlichen Dosen der Verbindung behandelt. Die Analysen wurden durchgeführt, um korrelieren Wirksamkeit mit frei Medikament 24 h AUC (offene Kreise) oder AUC / MIC (gefüllte Kreise). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung, Copyright © Amerikanischen Gesellschaft für Mikrobiologie, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Band 60, 2016, Seiten 180-189] 18. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Stase </td><td colspan="2"> 1-log 10 Reduzierung </td><td></td></tr><tr><td> Organismus </td><td> MIC (ug / ml) </td><td> R 2 für Linie fit (%) </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> fAUC </td><td> fAUC / MIC </td><td> Max Tötung (log 10 Reduktion) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10127 </td><td> 0,25 </td><td> 99,9 </td><td> 2.0 </td><td> 8.1 </td><td> 3.6 </td><td> 14.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1316009S </td><td> 0,25 </td><td> 96,1 </td><td> 6.5 </td><td> 26.0 </td><td> 15.1 </td><td> 60.3 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> ATCC10813 </td><td> 0,5 </td><td> 100 </td><td> 8.4 </td><td> 16.9 </td><td> 22.2 </td><td> 44.5 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 1307007S </td><td> 1 </td&gt; <td> 95,8 </td><td> 16.1 </td><td> 16.1 </td><td> 20.1 </td><td> 20.1 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> ATCC6303 </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 19.8 </td><td> 19.8 </td><td> 24.8 </td><td> 24.8 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1629 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 15.8 </td><td> 7.9 </td><td> 21.2 </td><td> 10.6 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> 298443 </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 26.5 </td><td> 13.2 </td><td> 31.0 </td><td> 15.5 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> 336808 </td><td> 2 </td><td> 86 </td><td> 8.2 </td><td> 4.2 </td><td> 19.0 </td><td> 9.5 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> 338860 </td><td> 2 </td><td> 99.5 </td><td> 2.9 </td><td> 1.5 </td><td> 6.7 </td><td> 3.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> &amp; #160; 340449 </td><td> 2 </td><td> 94,6 </td><td> 8.0 </td><td> 4.0 </td><td> 14.9 </td><td> 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> L11259 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 7.1 </td><td> 3.5 </td><td> 9.0 </td><td> 4.5 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Mittelwert ± SD </td><td> NA ein </td><td> N / A </td><td> 11,0 ± 7,5 </td><td> 11,0 ± 7,9 </td><td> 17,0 ± 8,2 </td><td> 19,5 ± 17,8 </td><td> 2,3 ± 0,5 </td></tr><tr><td> Median </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 8.2 </td><td> 8.1 </td><td> 19.0 </td><td> 14.4 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> H. influenzae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1998-100-126H </td><td> 1 </td><td> 99,7 </td><td> 7.3 </td><td> 7.3 </td><td> 13.4 </td><td> 13.4 </td><td> 2.9 </td></tr><tr><td> 503-008H </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 7.1 </td><td> 7.1 </td><td> 13.9 </td><td> 13.9 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 08003H </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16.7 </td><td> 8.3 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> H128 </td><td> 2 </td><td> 96,6 </td><td> 15.3 </td><td> 7.6 </td><td> 26.0 </td><td> 13.0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 19001H </td><td> 4 </td><td> 91.9 </td><td> 14.8 </td><td> 3.7 </td><td> 37.3 </td><td> 9.3 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Mittelwert ± SD </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 11,8 ± 4,2 </td><td> 6,6 ± 1,6 </td><td> 21,5 ± 10,2 </td><td> 11,6 ± 2,6 </td><td> 2,8 ± 0,1 </td></tr><tr><td> Median </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16.7 </td><td> 13.0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> ein NA, nicht anwendbar. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1: PK / PD - Targets zur Herstellung eines neuen PDF - Inhibitor gegen S. pneumoniae und H. influenzae - Isolaten. Frei Arzneimittel AUC und die AUC / MIC Ziele für Stase und eine 1-log 10 Reduktion der CFU von der Basislinie wurden für 11 S. pneumoniae bestimmt und 5 H. influenzae in immunokompetente Mäusen in der Lunge infiziert und mit Verbindung 18 behandelt. Die data wurde verwendet, wählen Sie die menschliche Dosen für die klinische Entwicklung zu helfen. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung, Copyright © Amerikanischen Gesellschaft für Mikrobiologie angepasst und neu aufgelegt, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Band 60, 2016, Seiten 180-189] 18. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Behandlungsgruppe ein </td><td colspan="8"> Mittlere log 10 S. pneumoniae (KBE / Lunge) b ± SD für Stamm (AMX / CA MIC): </td></tr><tr><td> 05010S (2 ug / ml) </td><td> 16001S c (4 ug / ml) </td><td> 16001S (4 ug / ml) </td><td> 30005S (4 ug / ml) </td><td> 20009S (4 ug / ml) </td><td> 05003S (8 &amp; mgr; g / mL) </td><td> 404053 (8 &amp; mgr; g / mL) </td><td> 47003S (8 &amp; mgr; g / mL) </td></tr><tr><td> Steuern </strong&gt; </td><td> 7,3 ± 0,4 </td><td> 7,0 ± 0,8 </td><td> 5,7 ± 1,2 </td><td> 7,1 ± 0,7 </td><td> 7,1 ± 0,4 </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 6,8 ± 0,4 </td><td> 6,0 ± 0,3 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.000 / 125 mg zweimal täglich (Verhältnis 16: 1) </td><td> ≤ 1,7 ** </td><td> 2,8 ± 1,2 ** </td><td> 2,2 ± 0,8 ** </td><td> 2,3 ± 0,9 ** </td><td> 2,5 ± 0,9 ** </td><td> 2,0 ± 0,9 ** </td><td> 3,8 ± 1,4 ** </td><td> 1,8 ± 0,2 ** </td></tr><tr><td> 1.000 / 125 mg tid (Verhältnis 8: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 2,8 ± 0,5 ** </td><td> 2,7 ± 1,3 ** </td><td> 3,3 ± 0,9 ** </td><td> 4,9 ± 0,5 ** </td><td> 6,6 ± 1,3 </td><td> 4,7 ± 0,7 ** </td></tr><tr> &lt;td&gt; 875/125 mg tid (Verhältnis 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 3,0 ± 1,3 * </td><td> 2,1 ± 0,7 ** </td><td> 3,2 ± 0,4 ** </td><td> 5,2 ± 0,9 * </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 4,9 ± 0,4 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg zweimal täglich (Verhältnis 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,5 ± 1,2 * </td><td> 5,6 ± 1,3 * </td><td> 5,2 ± 0,7 ** </td><td> 6,3 ± 0,7 </td><td> 6,4 ± 0,7 </td><td> 5,5 ± 0,4 </td></tr><tr><td> 500/125 mg tid (Verhältnis 4: 1) </td><td> 3,1 ± 1,3 ** </td><td> 4,5 ± 0,9 ** </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td></tr><tr><td> Azithromycin, 1000/500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 5,8 ± 2,0 </td><td> 7,1 ± 0,9 </td><td> 3,1 ± 1,0 ** </td><td> 6,6 ± 0,4 </td><td> 6.07; 0,6 </td></tr><tr><td> Levofloxacin, 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,2 ± 0,8 * </td><td> 5,7 ± 0,8 * </td><td> 4,9 ± 0,8 ** </td><td> 3,0 ± 1,3 ** </td><td> 3,5 ± 0,2 ** </td><td> 3,9 ± 0,8 ** </td></tr><tr><td rowspan="2"> Behandlungsgruppe d </td><td colspan="8"> Die mittlere log 10 H. influenzae (KBE / Lunge) ± SD für Stamm: </td></tr><tr><td colspan="4"> H128 (β-Lactamase - positiv) </td><td colspan="4"> Chesterfieldsofa (β-Lactamase - negativ, Ampicillin - resistente) </td></tr><tr><td> Steuern </td><td colspan="4"> 6,4 ± 0,6 </td><td colspan="4"> 6,7 ± 0,6 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.000 / 125 mg zweimal täglich (Verhältnis 16: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,7 ** </td><td colspan="4"> 3,1 ± 0,9 ** </td></tr><tr><td> 1.000 / 125 mg tid (Verhältnis 8: 1) </td><td colspan="4"> 2,1 ± 1,0 ** </td><td colspan="4"> 3,6 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg tid (Verhältnis 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,8 ± 1,3 ** </td><td colspan="4"> 3,8 ± 1,3 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg zweimal täglich (Verhältnis 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,8 ** </td><td colspan="4"> 5,1 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> Azithromycin, 1000/500 mg od </td><td colspan="4"> 3,2 ± 1,7 * </td><td colspan="4"> 5,8 ± 1,1 </td></tr><tr><td> Levofloxacin, 500 mg od </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td></tr><tr><td colspan="9"> ein AMX / CA, Amoxicillin-Clavulanat; Gebot, zweimal täglich; tid., dreimal pro Tag; od, einmal pro Tag. </td></tr><tr><td colspan="9"> b Die Nachweisgrenze lag bei &lt;1,7; * Signifikant verschieden von der Kontrolle (P ≤ 0,05); ** Signifikant verschieden von der Kontrolle (P ≤ 0,01); NT, nicht getestet. </td></tr><tr><td colspan="9"> C - Stamm 16001S wurde in zwei getrennten Experimenten getestet. </td></tr><tr><td colspan="9"> d Amoxicillin-Clavulanat 500/125 mg (4: 1) dreimal am Tag nicht gegen die H. influenzae - Stämmen getestet. </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Wirksamkeit von Recreated Humanplasma Belichtungsprofile für unterschiedliche Amoxicillin / Clavulanate Dosierungen. Erzeugten Daten in immunokompetente Ratten in der Lunge infiziert mit Isolaten von S. pneumoniae oder H. influenzae dieses Modell gezeigt , dass eine verbesserte Formulierung von Amoxicillin-Clavulanat (2000/125 mg zweimal täglich) war wirksamer als Standard - Dosierungen gegenüber Isolaten mit erhöhten Empfindlichkeit in vitro 19. Diese Tabelle wurde mit freundlicher Genehmigung, Copyright © Amerikanischen Gesellschaft für Mikrobiologie angepasst und neu aufgelegt, [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Band 49, 2005, Seiten 908-915] 19.

Eine Methode zur Feststellung von Lungeninfektionen bei immunkompetenten Nagetieren wird beschrieben. Mit Kompetenz kann diese Methode schnell und einfach durchgeführt werden, um eine stabile Infektion mit vielen Isolaten von S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae und A. baumannii zu induzieren.

A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; oder<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Das übergeordnete Ziel dieses nicht-chirurgischen intrabronchialen Infektionsverfahrens ist es, eine robuste bakterielle Lungenentzündung bei immunkompetenten Nagetieren zu etablieren. Diese Methode bietet einen Mehrwert für die Entdeckung und Entwicklung von Antibiotika, indem sie es ermöglicht, die Wirksamkeit potenzieller Behandlungen in einem immunkompetenten Modell für schwere Lungenentzündung zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine robuste und reproduzierbare Lungeninfektion mit vielen Isolaten herstellt, einschließlich solcher, bei denen die Tiere typischerweise neutropenisch sein müssen, oder Isolate, die mit anderen Methoden keine lebensfähige Infektion erzeugen.Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesem Verfahren noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben. Die richtige Intubation ist ein blindes Verfahren, das das Erlernen des richtigen Gefühls erfordert, um die Luftröhre anstelle der Speiseröhre zu intubieren. Die richtige Intubation ist für jeden Wissenschaftler anders.Der genaue Winkel der Kanüle ist möglicherweise nicht bei jedem gleich. Das Gespür für die Kämme der Luftröhre ist der Schlüssel. Diese Technik wird von Cindy Mininger, einer Wissenschaftlerin aus unserem Labor, vorgeführt.Bereiten Sie zunächst salzhaltige Bakteriensuspensionen aus Nachtbrühenkulturen vor, wie im Textprotokoll angegeben, oder aus Agarplatten, wie hier gezeigt. Ernten Sie das Wachstum über Nacht von Agarplatten, indem Sie eine sterile Schlaufe verwenden, um die Kolonien von der Oberfläche zu kratzen. Übertragen Sie das geerntete Material in fünf Milliliter sterile Kochsalzlösung, bis eine trübe, undurchsichtige Suspension entsteht, und wirbeln Sie die Kultur vorsichtig auf, bis sie homogen ist.Dann wird die Verdünnung seriell verdünnt und von jeder Verdünnung ein Aliquot gemäß dem Textprotokoll plattiert. Nach der Vorbereitung des Agars und dem Zusammenbau der notwendigen Werkzeuge für den Infektionsprozess aliquotieren Sie gemäß dem Textprotokoll neun Milliliter Agar in ein steriles Röhrchen und legen das Röhrchen dann in das Wasserbad, bis sich das Agar auf etwa 42 Grad Celsius ausgleicht. Geben Sie einen Milliliter der zuvor vorbereiteten salzhaltigen Bakteriensuspension in das Agarröhrchen.Drehen Sie dann das Rohr mehrmals um, um es zu mischen und wieder ins Wasser zu geben. Legen Sie eine saubere Einwegmatte auf die Arbeitsfläche in der Nähe des Wasserbads. Um die Arbeitsfläche und das Intubationsgerät vorzubereiten, sterilisieren Sie zunächst die Metallkanüle und den Polyethylenschlauch gemäß dem Textprotokoll und übertragen Sie sie dann in ihrem Glasaufbewahrungsrohr auf die Arbeitsfläche.Entfernen Sie dann die Kappe vom Aufbewahrungsschlauch und schieben Sie das Griffende der Kanüle an das offene Ende des Schlauchs. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette ein Stück Polyethylenschlauch aus dem Becherglas und führen Sie ihn durch das Innere der sterilen Metallkanüle ein, wobei Sie darauf achten, dass er sich frei bewegt. Platzieren Sie eine Leitmarkierung an einer vorgegebenen Stelle mit einem unauslöschlichen Stift.Setzen Sie als Nächstes eine sterile Einwegnadel mit 25 Gauge auf das freie Ende des Polyethylenschlauchs ein, indem Sie die Nadel einige Millimeter in den Schlauch schieben. Verwenden Sie dann eine sterile Kochsalzlösung, um eine frische Einwegspritze von einem Milliliter zu füllen. Befestigen Sie die Spritze an der Nadel, die auf dem Polyethylenschlauch angebracht ist, und spülen Sie das gesamte Volumen der Kochsalzlösung durch den Schlauch.Entsorgen Sie die gebrauchte Spritze im Behälter für scharfe Gegenstände. Füllen Sie dann eine neue sterile Einwegspritze von einem Milliliter mit dem Inokulum auf Agarbasis aus dem Wasserbad. Bringen Sie die 25-Gauge-Nadel und den Schlauch wieder an und spülen Sie das Agar durch den Schlauch, indem Sie den Kolben drücken, bis der Schlauch vollständig mit Agar gefüllt ist.Nachdem Sie die Ratte gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, legen Sie das Tier in Rückenlage auf die Einwegmatte, wobei der Kopf nach rechts und der Schwanz nach links zeigt. Führen Sie anschließend das freie Ende der Metallkanüle in das Maul des Tieres ein. Drehen Sie die Kanüle so, dass das freie Ende nach oben abgewinkelt ist, und schieben Sie sie vorsichtig in die Luftröhre ein, wobei Sie die Kehlkopfstrukturen vorsichtig mit einer leichten Drehbewegung umgehen.Bestätigen Sie das Einführen in die Luftröhre im Gegensatz zur Speiseröhre, indem Sie die Kanüle mehrmals leicht nach vorne und hinten schieben, während Sie mit dem linken Zeigefinger die Trachealringe abtasten. Um eine Intubation in die Luftröhre und nicht in die Speiseröhre zu gewährleisten, bewegen Sie die Kanüle leicht hin und her und tasten Sie nach den Rippen. Wenn die Kanüle sanft den Hals hinuntergleitet und die Rillen nicht zu spüren sind, entfernen Sie das Gerät und versuchen Sie es erneut.Wenn die Kanüle die Bifurkation erreicht, an der sich die Luftröhre in die linke und die rechte Bronchie aufteilt, machen Sie eine leichte Drehbewegung zur linken Seite des Tieres, um sicherzustellen, dass die Kanüle in den linken Bronchus eingeführt wird. Ein häufiger Fehler besteht darin, die Inokula nicht tief genug in die Lunge zu bringen, was die Atemwege blockieren und die Atmung behindern kann. Wenn die Kanüle in den richtigen Winkel gedreht wird, sollte sie leicht in den linken Bronchus gleiten und sanft bis zur entsprechenden Tiefe vorrücken.Schieben Sie die Metallkanüle vor, bis sich das Ende auf halbem Weg bis zu drei Vierteln der linken Lunge befindet, und bestätigen Sie mit der zuvor platzierten Führungsmarkierung, dass die entsprechende Tiefe erreicht ist. Wenn die Metallkanüle an Ort und Stelle ist, schieben Sie den Polyethylenschlauch einige Millimeter vor, indem Sie die zuvor angebrachte Führungsmarkierung auf dem Schlauch verwenden, um sicherzustellen, dass er nur weit genug vorgeschoben ist, um das Ende der Metallkanüle zu verlassen und die Lunge nicht zu punktieren. Wenn beide Kanülen an Ort und Stelle sind, verwenden Sie die beigefügte Spritze, um 100 Mikroliter Agarsuspension tief in den großen Lappen der linken Lunge zu injizieren.Ziehen Sie einige Millimeter aus dem Schlauch heraus und entfernen Sie vorsichtig das intakte Intubationsgerät. Setzen Sie es wieder in das Glasvorratsrohr und setzen Sie das Tier in einen frischen Käfig, damit es sich erholen kann. Bereiten Sie die Arbeitsfläche und die Kanüle wie gerade für Ratten gezeigt vor, indem Sie die für Mäuse entsprechend dimensionierte Ausrüstung verwenden.Verwenden Sie eine sterile 1-Milliliter-Einwegspritze und eine sterile 25-Gauge-Nadel, um die Mikroinjektionsspritze aus Glas mit steriler Kochsalzlösung zu füllen. Spülen Sie dann die Kochsalzlösung durch das wieder zusammengebaute Gerät. Verwenden Sie anschließend eine neue sterile Einwegspritze von einem Milliliter und eine sterile 25-Gauge-Nadel, um die Mikroinjektionsspritze mit dem Agar-Inokulum zu füllen.Bauen Sie dann das Gerät wieder zusammen und spülen Sie das Agar durch den Schlauch, bis der Schlauch vollständig mit Agar gefüllt ist. Nachdem Sie die Maus gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, positionieren Sie das Tier in der gleichen Ausrichtung, wie bei der Ratte gezeigt, und intubieren Sie die Luftröhre mit gleichmäßigem, aber sanftem Druck auf ähnliche Weise wie bei der Ratte. Vermeiden Sie die Anwendung von Gewalt, da die Technik bei Mäusen heikler ist.Stellen Sie sicher, dass die Kanüle in die Luftröhre eingeführt wird, indem Sie nach den Trachealringen tasten. Drehen Sie die Kanüle leicht und schieben Sie sie in den linken Bronchus vor, indem Sie sie mit zuvor platzierten Führungsmarkierungen tief in die Lunge einführen. Wenn die Metallkanüle an Ort und Stelle ist, schieben Sie den Polyethylenschlauch einige Millimeter vor und träufeln Sie 20 Mikroliter Agar-Suspension.Hier ist ein repräsentatives Beispiel von Kolonien zu sehen, die auf einer Agarplatte wachsen, nachdem eine Lungenhomogenatprobe seriell verdünnt und dreifach plattiert wurde. Wie in dieser Grafik mit S. pneumoniae gezeigt, wird in der infizierten Lunge bei den meisten Bakterienisolaten typischerweise ein Anstieg der bakteriellen Belastung um mehrere KBE zur logarithmischen Basis zehn über den Ausgangswerten beobachtet, selbst 96 Stunden nach der Infektion, und die Variabilität zwischen den Tieren ist gering. In diesem Experiment wurden zwei Verbindungen gegen Chinolon-anfällige oder Chinolon-resistente Isolate von S. pneumoniae untersucht, um zu veranschaulichen, dass dieses Lungeninfektionsmodell bei der Optimierung einer Leitchemie zur Unterstützung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen verwendet werden kann.Jedes Symbol steht für KBE, die aus der Lunge einer Ratte bestimmt wurde. Hier sind E-Max-Modelle gezeigt, die unter Verwendung von Dosisfindungs-Wirksamkeitsdaten in immunkompetenten Mäusen erstellt wurden, die in der Lunge mit Isolaten von S. pneumoniae oder H. influenzae infiziert wurden, um pharmakokinetische, pharmakodynamische Ziele für einen neuartigen Polypeptid-Deformylase-Inhibitor zu bestimmen. Die Kreise stellen die mittlere bakterielle Belastung von vier bis fünf Mäusen pro Gruppe dar, die mit unterschiedlichen Dosen der Substanz behandelt wurden.Die offenen Kreise stellen die freie Fläche unter der Kurve dar, und die gefüllten Kreise stellen die Fläche unter der Konzentrationszeitkurve über der minimalen Hemmkonzentration dar. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 30 Sekunden pro Tier durchgeführt werden, wobei bis zu fünf oder sechs Tiere pro Spritze Agar-Inokulum geimpft werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese nicht-chirurgische intrabronchiale Infektionsmethode durchführen und in der Lage sind, sie zur Etablierung von Lungeninfektionen mit vielen verschiedenen Bakterienisolaten zu verwenden.Energetisches Instrumetnal

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Lenhard, A. et al. Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Erreger bei viraler Koinfektion wiederholt altersbedingte Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video demonstriert ein Modell der Maus-Koinfektion, bei dem das Influenzavirus den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zu einem Krankheitserreger auslöst. Es beschreibt die Schritte, die bei bakterieller Besiedlung, Virusinfektion und Krankheitsprogression beteiligt sind.

Ein Mausmodell zur Untersuchung des pathogenen Übergangs von Streptococcus pneumoniae nach viraler Koinfektion

Dieses Video zeigt die Etablierung einer Lungeninfektion in einem immunkompetenten Nagetiermodell durch Intubation und Installation von bakteriellen Suspensionen in Lungenlappen. Dieses Modell ermöglicht antibakterielle Wirksamkeitsstudien an immunkompetenten Tieren.

Intrabronchiale Instillation von Streptococcus pneumoniae in immunkompetenten Nagetiermodellen

Streptococcus pneumoniae ist der führende Erreger schwerer ambulant erworbener Pneumonie und für mehr als 2 Millionen Todesfälle weltweit verantwortlich. Die Auswirkungen der bakteriellen Faktoren in Fitness-oder Virulenz beteiligt können in Echtzeit in einer akuten Lungenentzündung oder Bakteriämie Maus-Modell mit Biolumineszenz-Bakterien beobachtet werden.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Wir haben ein Modell für Lungenverletzungen von Mäusen durch intratracheale Injektion des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa entwickelt. Dieses Modell ahmt Lungenschäden bei Lungenentzündungen nach und ist klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

Verschiedene Verfahren wurden für die Modellierung von bakterieller Pneumonie bei Mäusen in der Literatur beschrieben. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive, kostengünstige, schnelle Methode zur Lungenentzündung durch Aspiration induzierenden (dh Inhalation) eines bakteriellen Inokulums in den Oropharynx pipettiert. Downstream Methoden zur Beurteilung der Lungen angeborenen Immunantwort sind auch detailliert.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Infektiöse Lungenentzündung gehört zu den häufigsten Infektionen beim Menschen. Eine geeignete in-Vivo -Modell ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und Prüfung der Wirksamkeit neuer Therapeutika. Mit diesem Modell murine oropharyngealen Aspiration Pneumonie kann man die Pathogenese und neue Therapien gegen diese tödliche Infektionen untersuchen.

Murine oropharyngealen Aspiration Modell der Ventilator-assoziierten und nosokomiale Bakterielle Pneumonie

Hier stellen wir Methoden zur Verbesserung der sekundären bakteriellen Lungenentzündungsstudien vor, indem wir einen nicht-invasiven Weg der Instillation in die unteren Atemwege bereitstellen, gefolgt von der Genesung von Krankheitserregern und der Transkriptanalyse. Diese Verfahren sind reproduzierbar und können ohne spezielle Ausrüstung wie Kanülen, Führungsdrähte oder Glasfaserkabel durchgeführt werden.

Ein präzises Pathogen-Liefer- und Wiederherstellungssystem für murine Modelle der sekundären bakteriellen Pneumonie

Dieses Manuskript beschreibt die Etablierung eines infektiösen Modells der Lungenentzündung bei Mäusen und die entsprechende Charakterisierung der Verletzungsauflösung sowie Methoden zur Züchtung von Bakterien und zur intratrachealen Instillation. Ein neuartiger Ansatz mit Hilfe der hochdimensionalen Durchflusszytometrie zur Bewertung der Immunlandschaft wird ebenfalls beschrieben.

Experimentelles Modell zur Evaluierung des Abklingens von Lungenentzündungen

Diese Arbeit beschreibt ein neuartiges Mausmodell für den Übergang von Pneumokokken von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem krankheitsverursachenden Erreger während einer Virusinfektion. Dieses Modell kann leicht angepasst werden, um polymikrobielle und Wirt-Pathogen-Interaktionen während der verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs und über verschiedene Wirte hinweg zu untersuchen.

Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Krankheitserreger nach viraler Koinfektion rekapituliert altersbedingte Erkrankung

Mäuse sind im Allgemeinen resistent gegen Infektionen mit Mycobacterium abscessus, was die Entdeckung und Entwicklung dringend benötigter Antibiotika gegen Lungeninfektionen erschwert. Hier beschreiben wir eine Methode der Inokulumvorbereitung und intratrachealen Infektion, die bei immunkompetenten Mäusen nachweislich eine anhaltende Infektion auslöst.

Vorbereitung von in Agarperlen eingebettetem Mycobacterium abscessus zur intratrachealen Inokulation immunkompetenter Mäuse

Erfahren Sie eine nicht-chirurgische intrabronchiale Infektionsmethode zur Erzeugung robuster bakterieller Pneumonien bei immunkompetenten Nagetieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Bewertung antibakterieller Therapien.

A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa oder A. baumannii (Video) | JoVE Journal

A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen

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