Name: Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Erfahren Sie die intrakarotide Injektion von Krebszellen zur Erzeugung reproduzierbarer Hirnmetastasemodelle bei Mäusen. Diese mikrochirurgische Technik ermöglicht zuverlässige Studien zur Entwicklung neuer Therapien.

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Die Autoren haben keine Danksagungen.

Ethik Aussage: Alle Tierstudien von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt. 1. Bereiten Sie Krebszellen für die Injektion <ol><li> Samen, die Krebszellen ein oder zwei Tage vor der Injektion. Verwenden Sie DMEM / F12-Medium mit 10% FBS ergänzt, es sei denn, eine Spezialität Medium in der Literatur für eine bestimmte Zelllinie angedeutet ist. </li><li> Am Tag des chirurgischen Eingriffs, Ernte Zellen, wenn sie erreicht 70 bis 80% Konfluenz, indem zuerst Waschen mit serumfreiem Medium einmal vor Trypsinisierung (0,25%) für 1 bis 2 min bei 37 ° C. Hinzufügen, in Zellen 10% FBS enthaltendes DMEM / F12-Medium, das 0,25% Trypsin zu quenchen. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 80 × g für 3 min. 5 × 10 6 Zellen / ml, abhängig von der Zelllinie - in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) bei 1 waschen Zellen in serumfreien Medien zweimal restliche Serum zu entfernen, die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und zu resuspendieren. Halten Sie sich auf Eisbis zum Zeitpunkt der Injektion. HINWEIS: MDA-MB-231 Brustkrebszellen und K1735 Melanomzellen wurden in dieser Studie, und beide Zellinien wurden bei 2 × 10 6 Zellen / ml Konzentration verwendet. Halten Sie die Trypsinierung Dauer so kurz wie möglich als Übertherapie können die Ergebnisse der Metastasierung Assays beeinflussen. </li></ol> 2. Bereiten Sie Mäuse für Tumorzellinjektion <ol><li> Anästhesieren Mäuse durch intraperitoneale (ip) Injektion von Ketamin / Xylazin-Cocktail (Ketamin 100 mg / kg, Xylazin 10 mg / kg). </li><li> Bestätigen Sie eine komplette Anästhesie durch Kneifen der Tierfüße und beobachten fehlende Reaktion. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer Glasplatte (verwendet für das Gießen von Protein-Gele), und befestigen Sie sie mit Gummibändern. </li><li> Falls erforderlich, entfernen Sie die Haare des Halses durch Rasieren oder eine kleine Menge Haarentfernung Produkt Auftragen und Abwischen der Haare mit einem Papiertuch ab. HINWEIS: Wenn Nacktmäuse mit, diesen Schritt überspringen, da sie keine Körperhaare haben. </li><li> Reinigen Sie die Haut am Hals durch die AnwendungPVP-Jod und 70% Alkohol. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der Bühne des Binokular </li><li> Einen Einschnitt in die Haut ~ 1 cm lang mit einem chirurgischen Skalpell. </li><li> Unverblümt sezieren den Muskel mit Zahnzange unterhalb der Arteria carotis zu belichten. </li><li> Trennen Sie die Arteria carotis vom benachbarten Vagusnerv mit chirurgischen Pinzette. </li><li> Mit chirurgische Pinzette, trennen einige Baumwolle aus einem Wattebausch, befeuchten und Mode in eine kleinere Wattebausch. Dieses Puffer-befeuchtete Wattebausch unter der A. carotis der beabsichtigten Stelle der Injektion. </li><li> Legen Sie eine Naht distalen und proximalen zu dem Wattebausch und lose Knoten machen. Ziehen Sie den proximalen Knoten den Blutfluss in der Injektionsstelle zu blockieren. </li><li> Gehen Sie zur Krebszellinjektion, wenn die Arteria carotis auf dem Wattebausch mit frischen roten Blut voll unter Druck erscheint. </li></ol> 3. Cancer Cell Injektion in Arteria carotis <ol><li> Vortex und ziehen 100 ul of Krebszellen in die Spritze. </li><li> Unter dem Binokular, legen Sie langsam die 31 G-Nadel (mit Fase nach oben) in das Lumen der Arterie Carotis auf der Oberseite der Baumwollkugel sitzt. </li><li> injizieren langsam die Zellen aus der Spritze in die Carotis-Arterie. Erfolgreiche Injektion kann durch die wechselnden Farben der umliegenden Blutgefäße und Muskulatur, wenn gepufferte Krebszellen in die Blutbahn geschoben werden unter dem Mikroskop beobachtet werden. </li><li> Wenn die Einspritzung des gesamten Volumens abgeschlossen ist, heben Sie vorsichtig die distale Arteria carotis Aufstoßen zu verhindern. </li><li> Schnell den distalen Knoten ziehen Sie die Injektionsvorgang abzuschließen. </li><li> Nach der Injektion abgeschlossen, ziehen Sie die Ligatur und schneiden Sie die überschüssige Seidennaht mit Mikro-Schere unter dem Binokular. Bewegen Sie den abgetrennten Muskel wieder auf die Wunde abzudecken. Schließen Sie die Haut mit zwei Heftklammern. </li></ol> 4. Chirurgische Erholung <ol><li> Bewegen Sie das operierte Tier auf einem Heizkissenzur Erholung. 60 min für die Tiere das Bewusstsein wieder zu erlangen - Es kann 30 nehmen. In der Zwischenzeit, Buprenorphin (0,05 mg / kg) subkutane Injektion als postoperative Analgesie verabreichen. Hinweis: Analgesie zur Verfügung gestellt werden sollten, entsprechend den lokalen IACUC Protokoll genehmigt. </li><li> Sobald die Tiere erwachen und ihr normales Verhalten fortzusetzen, kehren die Mäuse zu ihren Wohnstandort. Geben Sie Mäuse mit Gel Lebensmittel für einige Tage nach der Operation. Achten Sie auf eine chirurgische Aufzeichnung und halten Sie sie in den Raum. </li></ol> 5. Nicht-invasive In - vivo - Bildgebung <ol><li> Für mit Luciferase - Reporterkonstrukte markierten Zellen, Krebszellen Injektionseffizienz unter Verwendung von in - vivo - Bildgebungssystem 14 messen. HINWEIS: Imaging nicht am Tag der Injektion durchgeführt, eine übermäßige Belastung auf Versuchstiere zu vermeiden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die kritischsten Schritte zur erfolgreichen carotis arterielle Injektion von Krebszellen sind: 1) tiefer Anästhesie von Maus in Vorbereitung für die chirurgische Operation; 2) stetig Platzierung der Arteria carotis auf der Oberseite der Baumwolle zu unterstützen; 3) dicht Ligatur der A. carotis nach erfolgreicher Injektion. Tief Anästhesie von ~ 30 min ist in der Regel notwendig für die stationäre chirurgische Leistung unter dem Binokular. Wir verwenden kommerziell ready-to-use Ketamin / Xyl...

Die Metastasierung von Krebs auf das zentrale Nervensystem (ZNS) ist eine verheerende Krankheit, und kann entweder das Hirnparenchym oder die Leptomeningen ( &quot;Hirnmetastasen&quot; bezieht sich sowohl auf die in diesem Artikel) einzubeziehen. Es ist die vorherrschende intracranial Malignität, outnumbering primären Gliomen von&gt; 10: 1 1, 2. Lungenkrebs, Brustkrebs und Melanomen sind die drei wichtigsten Tumorerkrankungen, die eine hohe Inzidenz von Hirnmetastasen produzieren 3, 4. In den letzten Jahren haben beeindruckende Fortschritte in der neuen Krebstherapien, dramatisch verlängert das Überleben und die Verbesserung der Lebensqualität für viele Krebspatienten. Doch bei Wiederholung wird das Auftreten von Hirnmetastasen steigt rapide an. Beispielsweise wurde die Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab (Herceptin) signifikante klinische Wirksamkeit bei Patienten mit HER2 + Brustkrebs nachgewiesen; noch eine beunruhigende Tendenz hat sich herausbei diesen Patienten: bis zu 1/3 von denen , deren extracranial systemische Erkrankung zunächst von Trastuzumab Behandlung profitierten später Hirnmetastase 5, 6, 7 zu entwickeln. Leider Patienten mit Hirnmetastasen sind resistent gegen fast alle gängigen Behandlungen, in der Regel eine traumatische Verschlechterung der Lebensqualität erleben, und ihre Ein-Jahres - Überleben nach der Diagnose ist nur ~ 20% 8. Aktuelle Therapien für Hirnmetastasen (einschließlich Steroide, Schädel Strahlentherapie und chirurgische Resektion bei ausgewählten Patienten) sind nur palliativ, nicht kurativ 9. Daher zeichnet sich Hirnmetastasen als die nächste imposante Herausforderung in dieser Ära neuer Krebstherapien. Zur Bewältigung jeden Tag in der Klinik die ungedeckten Herausforderung Patienten konfrontiert, brauchen wir dringend um besser auf die zugrunde liegenden Mechanismus der Hirnmetastasen zu verstehen und dieses Wissen nutzen, um neue Therapien zu entwickeln. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Successful Kolonisierung des Gehirns durch metastatische Krebszellen erfordert die Leistung einer Reihe von durch die komplizierte Wechselwirkung mehrerer biologischer Spieler vermittelte Funktionen, wie den Bypass der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und die Flucht aus dem Gehirn des intrinsischen Immunabwehrmechanismen 10, von denen keine in einer ex vivo oder in vitro System rekapituliert wird. Daher sind geeignete und treu in - vivo - Modellen von entscheidender Bedeutung für Studien von Hirnmetastasen. Eine herkömmliche in vivo Metastasen Assay führt Krebszellen via Schwanzveneninjektion, was die Mehrzahl der Zellen in der Lunge untergebracht zu werden. Gehirn Metastasen nur selten in diesen Modellen produziert , bevor sie von Tumorbelastung in der Lunge 11 verursacht Tier Tod. Direkte intrazerebrale Injektion von Krebszellen produziert konsistente Tumorauswuchs im ZNS und weit in den Studien von primären Gliomen verwendet wird. Jedoch such Injektion beeinträchtigt die BBB und verursacht eine traumatische Verletzung an der Injektionsstelle, die beide wichtige Punkte der Besorgnis über die physiologische Relevanz dieses Modells. Ein anderes häufig verwendetes Krebszelle Einführung Weg, Intrakardial, ist einfach zu verwalten und experimentelle Metastasierung des ZNS erzeugt. Allerdings sind gleichzeitig Metastasen zu Organ anderen Stellen als das ZNS immer produziert und können Tiersterblichkeit 11 verursachen; Daher macht es die hohe Variabilität dieses Modells ungeeignet für quantitative Bewertung der biologischen Mechanismen oder therapeutische Mittel mit einer begrenzten Anzahl von Tieren. Hier haben wir die Verfahren beschreiben experimentelle Hirnmetastasen über die Injektion von Krebszellen in die Arteria carotis communis erzeugen. Wir haben diesen Ansatz Beiträge zur metastatischen Kaskade von Hirnmetastasen &quot;einzelner Gene zu sezieren und Wirksamkeit der therapeutischen Intervention zu bewertens 12, 13. Die Hauptvorteile dieses Ansatzes sind der hohe Grad an Reproduzierbarkeit und geringer Grad an Variabilität; Der größte Nachteil ist die Raffinesse und Geschicklichkeit erforderlich, um die Mikrochirurgie durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>Ketaminhydrochlorid/Xylazinhydrochlorid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr><tr><td>Routine-Stereomikroskop Leica M50</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Das Mikroskop ist modular und hochgradig konfigurierbar, um besonderen Platzanforderungen gerecht zu werden.</td></tr><tr><td>Chirurgische Einweg-Scapel</td><td>Integra Miltex</td><td>4-410</td><td>zum Vornehmen von Hautschnitten</td></tr><tr><td>Gewebezange - 1 x 2 Zähne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td>zum stumpfen Präparieren von Muskeln</td></tr><tr><td>Dumont #5 - Mirror Finish Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td>zum Trennen und Vorbereiten der Halsschlagader für die</td></tr><tr><td>Injektion Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td>zum Schneiden von Nähten</td></tr><tr><td>EZ Clip Kit</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>für die Wundklour</td></tr><tr><td>BD Insulinspritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>328438</td><td>für die Zellinjektion</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Bildgebungssystem</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr></tbody></table>

intracarotid cancer cell injection zu produzieren mausmodelle von hirnmetastase

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metastasierung, die Ausbreitung und das Wachstum von bösartigen Zellen an sekundären Standorten innerhalb des Körpers eines Patienten, Konten für&gt; 90% der durch Krebs verursachten Todesfälle. Vor kurzem haben beeindruckende Fortschritte in der neuartigen Therapien dramatisch das Überleben und die Verbesserung der Lebensqualität verlängert für viele Krebspatienten. Leider ist schnell metastasierendem Rezidive Inzidenz von Gehirn steigt, und alle aktuellen Therapien sind nur palliative. Daher sind gute experimentelle Tiermodelle dringend notwendig in eingehende Studien der Biologie von Krankheiten zu erleichtern und neuartige Therapieschemata für die präklinische Evaluierung zu beurteilen. Jedoch erzeugt die Standard - in - vivo - Metastase Assay über Schwanzveneninjektion von Krebszellen überwiegend Lunge Metastasen; Tiere in die Lunge Tumorbelastung vor eine sinnvolle Auswuchs von Hirnmetastasen erliegen gewöhnlich. Intrakardial von Tumorzellen produziert metastatischen Läsionen zu multiplen Organ Websites einschließlich des Gehirns; jedoch die variabikeit des Tumorwachstums mit diesem Modell hergestellt ist groß, bei der Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit seiner Nützlichkeit dämpfend. So generieren zuverlässige und konsistente Tiermodelle für Hirnmetastasen Studie beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von experimentellen Hirnmetastasen in der Hausmaus (Mus musculus) über intracarotid Injektion von Tumorzellen. Dieser Ansatz ermöglicht eine große Anzahl von Hirnmetastasen tragenden Mäuse mit ähnlichen Wachstum und Mortalität Eigenschaften zu erzeugen, so dass die Forschungsanstrengungen zu erleichtern grundlegende biologische Mechanismen zu untersuchen und neuartige therapeutische Mittel zu beurteilen.

Es gibt zwei Punkte, an denen die Qualität der Injektion ausgewertet werden kann. Die erste Chance wird durch die Beobachtung des Bedieners während der Injektion von Blutgefäßen Farben ändern. Leckage aus armen Injektionen können leicht unter dem Binokular beobachtet werden. Die stetige und sichere Platzierung des Mauskörpers (1A) und seine Arteria carotis (Abbildung 1B) auf der Stützwattebausch sind kritische Faktoren für glatte und erfolgreiche Injekti...

Hirnmetastasen hat ein dringender medizinischer Bedarf werden wie ihre Häufigkeit zugenommen hat, während therapeutische Optionen palliative geblieben sind. Erstellen von experimentellen Tiermodellen von Hirnmetastasen über intracarotid arterielle Injektion von Krebszellen erleichtert mechanistische Untersuchungen der Krankheitsbiologie und Evaluierung neuartiger Interventions Regimen.

Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Das übergeordnete Ziel dieser mikrochirurgischen Injektion von Krebszellen über die Arteria carotis besteht darin, konsistente in-vivo-Modelle experimenteller Hirnmetastasen bei Mäusen zu erzeugen. Diese Methode kann daher helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hirnmetastasierung zu beantworten, beispielsweise, ob eine neue Therapie wirksam gegen Hirnmetastasen sein könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Erzeugung in-vivo-experimenteller Hirnmetastasen mit hoher Reproduzierbarkeit und geringer Variabilität ermöglicht.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, anfängliche Schwierigkeiten, da eine gewisse Übung erforderlich ist, um eine ruhige Hand zu bewahren und Krebszellen unter dem Mikroskop in die Arteria carotis dieser Mäuse zu injizieren. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Krebszellen mit DMEM F12-Medium, das mit 10% FPS ergänzt ist, ansäen und sie einen bis zwei Tage vor der Injektion kultivieren. Entfernen Sie am Tag des chirurgischen Eingriffs die Zellen aus dem Inkubator und gewinnen Sie sie, sobald sie eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben, durch Waschen mit serumfreiem Medium.Als Nächstes inkubieren Sie d

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