Name: Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung anpassbarer Hydrogel aus pulmonaler extrazellulärer Matrix für 3D-Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-ECM-Interaktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen.

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Wir möchten, dass Smithfield Farmen zu danken für die intakte Schweinelungengewebe zu spenden. Wir möchten auch Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang und die VCU Abteilung für Plastische Chirurgie für die Erlaubnis, zu nutzen, um ihre Ausrüstung zu danken. Hydrogele und Gewebeproben wurden für SEM bei der VCU Abteilung für Anatomie vorbereitet und Neurobiologie Mikroskopie Einrichtung unterstützt, teilweise durch die Finanzierung von NIH-NINDS-Center Core-Grants 5 P30 NS047463 und zum Teil durch Finanzierungsform NIH-NCI Cancer Center Support Grants P30 CA016059. REM-Aufnahmen von Proben, die bei der VCU Nanotechnologie Kern Charakterisierung Facility (NCC). Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation, CMMI 1351162 finanziert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lösung </td><td> Sterile Filter </td><td> Richtungen </td></tr><tr><td> DiH 2 O </td><td> ja </td><td> DiH 2 O; steril filtriert </td></tr><tr><td> 0,1% Triton X-100-Lösung </td><td> ja </td><td> Unter Abzugshaube mit 100 &amp; mgr; l Triton-X 100 - Lösung auf 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter. </td></tr><tr><td> 2% Desoxycholat-Lösung </td><td> ja </td><td> Unter Laborabzug 2 g Natriumdesoxycholat-Lösung pro 100 ml DiH 2 O und rühren , bis sie gelöst; Sterilfilter </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> ja </td><td> Hinzufügen , 58,44 g NaCl zu 1 L DiH 2 O; agitieren, bis sie gelöst; Sterilfilter </td></tr><tr><td> DNase-Lösung </td><td> ja </td><td> In 12.000Einheiten DNase auf 1 L DiH 2 O; In 0.156 g MgSO 4 (Wasserfrei) und 0,222 g CaCl 2; agitieren, bis sie gelöst; Sterilfilter </td></tr><tr><td> PBS </td><td> ja </td><td> Kombinieren 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibasisches Heptahydrat), 80 g NaCl, 2 g KCl und mit 10 L DiH 2 O; agitieren, bis sie gelöst; pH-Wert auf 7,4; Sterilfilter </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Lösungen für Tissue Dezellularisierung Erforderlich. Nehmen Sie die oben genannten Lösungen für die Dezellularisierung Prozess. Lagerung bei 4 ° C. Etwa 2,5 L für eine Schweine Lunge benötigt werden. 1. Hydrogelierung <ol><li> Porcine Lung Dezellularisierung (angepasst von Referenzen 9,10) <ol><li> Erhalten, ein en bloc normalen Schweine Lunge, aus einem Schlachthof, mit Herz und vasculature intakt. </li><li> Verwenden Gewebe Schere oder einem Skalpell, das Herz zu sezieren entfernt Vaskulatur so nahe wie möglich an das Herz schneiden, werden verbleibende Vaskulatur in späteren Schritten für die Perfusion verwendet werden. </li><li> sezieren vorsichtig das Bindegewebe rund um die Luftröhre, Bronchien und Gefäßen mit einem Skalpell oder einer Schere entfernt. HINWEIS: Ermitteln Sie die beste Lunge für den Rest des Verfahrens zu verwenden, indem eine Lunge ohne große Schnitte oder Einstiche durch die Pleura und große Mengen an Atelektase oder Gefäßverschluss wählen, die die Wirksamkeit des Dezellularisierung Prozess behindern können. </li><li> Schneiden Sie das suboptimal Lunge verlässt, so viel Bronchus zur Trachea wie möglich angebracht entfernt (Herz, Bindegewebe und den Lappen der Lunge entfernt entsorgt werden kann). Es sollte eine Lunge zur Trachea und Vaskulatur befestigt bleibt sein. HINWEIS: Bewahren Sie Abschnitte für die Histologie, falls gewünscht. 9 </li><li> Schließen Sie nicht angeschlossen Bronchien mit Klammern oder Naht prevent Überschuss Rückstau. </li></ol><ol start="6"><li> Bereiten Sie die Dezellularisierung Lösungen und im Kühlschrank lagern bei 4 ° C , bis sie benötigt (Tabelle 1). </li><li> Mit Hilfe einer Handpumpe eine Kanüle eingeführt, die Lungenarterie zu passen, perfuse sowohl das Lungengewebe 3-mal mit DI-Wasser durch Lungenarterie und der Trachea. Perfuse Gefäß erste jedes Mal. Beginnen Sie mit ca. 1 L in Gefäßen und 1,5 l in der Trachea für jede Perfusion, aber als Zelltrümmer mehr Flüssigkeit entfernt wird, kann durch das System durchblutet werden. </li><li> Perfundieren sowohl Vaskulatur und der Trachea mit Triton X-100-Lösung. </li><li> Unterzutauchen Lungengewebe in Triton X-100-Lösung für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen. </li><li> Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit Desoxycholat-Lösung. </li><li> Tauchen Sie die Gewebeschnitte in Desoxycholat für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen. </li><li>Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit NaCl-Lösung. </li><li> Unterzutauchen Gewebe in filtriert NaCl-Lösung für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Perfuse Gefäßsystem und der Trachea 3 mal mit VE-Wasser zu spülen. </li><li> Perfuse beide Gefäße und der Trachea mit DNase-Lösung. </li><li> Unterzutauchen Gewebe in filtriert DNase-Lösung für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Perfuse beide Gefäße und der Trachea 5-mal mit PBS. </li><li> Sezieren weg bemerkbar Knorpelgewebe, Luftröhre und alle Tubuli 2 mm oder größer im Durchmesser (in erster Linie um den Hilus und medialen Abschnitte der Lunge) aus Atemwege leitet, so dass nur Atmungszonen (in erster Linie die Randbereiche). </li><li> Präparieren Gewebe in 1-Zoll-Abschnitte oder kleiner. Ausrichtung des Gewebes keine Rolle spielt für diesen Schritt. </li><li> überschüssige Flüssigkeit und Stelle Gewebe in 50 ml konischen Röhrchen abgießen. Frieren Sie das Gewebe bei -80 ° C. HINWEIS: Bewahren Abschnitte für die Histologie Entfernung von Zellen und Zell debri zu gewährleistens, wenn gewünscht. Wir verwenden H &amp; E, α-Galactosidase, PicoGreen, Hydroxyprolin, Ninhydrin, Alcianblau, SDS-PAGE und Massenspektrometrie charakterisiert werden. 9 </li></ol></li><li> Lung Verarbeitung <ol><li> Entfernen Sie Deckel aus gefrorenen Röhrchen dezellularisierter Lungengewebe enthält. </li><li> Legen Sie Filterpapier über die Rohröffnung einsetzen und mit Gummiband. HINWEIS: Rohr und der Inhalt sollte noch sonst in -80 ° C platzieren eingefroren werden, bis gefroren. </li><li> Lyophilisieren das Gewebe, bis das gesamte überschüssige Flüssigkeit weg ist, einen Gefriertrockner mit nach Hersteller Richtungen. Bei -80 ° C bis zum fertig zu fräsen. </li><li> Vor flüssigem Stickstoff zu Gefrierschrank Mühle beginnt hinzufügen Isolierung zu kühlen und interne Komponenten auf die Arbeitsbedingungen. </li><li> Entfernen Sie magnetische Mühle bar aus Mühle Rohr und fügen Gewebe Boden zu bedecken. </li><li> Ersetzen Mühle bar und fügen Sie locker gepackten Gewebe. Die Mühle Bar sollte noch frei bewegen. </li><li> Schließen Sie die Mühle Rohr und place in Gefrierschrank Mühle. </li><li> Füllen von flüssigem Stickstoff bis max Fülllinie. </li><li> Gefrierschrank Mühle alle Gewebe in ein feines Pulver (ca. 5 min, Impaktion Rate von ~ 600 min -1), in einem Polycarbonat - Zylinder mit einem Edelstahl - Impaktor sowie Edelstahl Endstopfen mit der Gefriermühle nach den Herstelleranweisungen. Bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Mikroporöse Gelbildung (8 mg / ml) ( in Anlehnung an Referenzen 9,11) <ol><li> 1% (w / v) des dezellularisierten Pulver und 0,1% (w / v) des Pepsins auf 0,01 M HCl, unter konstantem Rühren (sollte in der Lage sein Strömung auf der obersten Ebene der Flüssigkeit zu sehen), bei Raumtemperatur, 48 Std. HINWEIS: Das Pulver statisch aufgeladen ist, so das HCl-Zugabe, nachdem das Pulver die Möglichkeit bietet den Überschuss aus den Rohrwänden zu waschen. </li><li> Nach der Verdauung 48 h, legen Sie die Lösung und Reagenzien auf Eis für 5 min. </li><li> Verwendung gekühlter 10% (v / v) 0,1 M NaOH, eind 11.11% (v / v) 10 x PBS (die gesamte Lösung zu bringen Konzentration 1x), bringen die verdauten Proteinlösung auf physiologischen pH von 7,4. HINWEIS: Die Lösung kann jetzt bis zu einer Woche bei 4 ° C gelagert werden. Führen Sie Gelieren Kinetik mit rheometry 9 , falls gewünscht. </li></ol></li></ol> 2. Vernetzungs Hydrogele mechanische Festigkeit zu verbessern <ol><li> Lösungen von 1%, 0,1% und 0,01% w / v Genipin Vernetzungslösung wurden durch Lösen der erforderlichen Menge Genipin Pulver in 10% DMSO hergestellt. </li><li> Vortex, um die Lösung alle 15 min für 1 Stunde. </li><li> In Genipin Lösung ECM Hydrogele zu decken (100 &amp; mgr; l für jede Vertiefung einer 96-Well-Platte), die zuvor in Teil 1.3.4 zusammengestellt. </li><li> Verlassen jedes ECM Hydrogel für 24 h bei 37 ° C zu vernetzen. </li><li> Spülen Sie das ECM-Hydrogel 3-mal mit PBS, bis die Waschlösung nicht mehr blau. Die vernetzten Hydrogele werden dann bereit sein, für die weitere Charakterisierung und cell Kulturstudien. </li></ol> 3. Zellkultur mit mikroporöser Gel <ol><li> Zweidimensionale Beschichtungs <ol><li> Verwendung der Lösung aus 1.3.3 werden 20 ul Pregel-Lösung in jede Vertiefung einer 96-well nicht behandelten Gewebekulturplatte. </li><li> Kühlen Sie über Nacht bei 4 ° C Proteinadsorption an der Platte zu ermöglichen. </li><li> Absaugen Vorgelats Lösung und Spülen mit PBS. </li><li> Passage Zellen 9. </li><li> In 10.000 Zellen / cm 2 in die Vertiefungen. </li><li> Erhöhen Medien zu 100 ul pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Dreidimensionale Zellkultur 9 <ol><li> Verwendung Lösung aus 1.3.3 resuspendieren pelletierten Zellen auf eine Konzentration von 1 Million Zellen / ml Vorgellösung. </li><li> Schnell 16 ul Pregel-Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte verzichtet werden kann, ein ~ 500 &amp; mgr; m dicke Hydrogel für 3D-Zellkultur zu bilden. </li><li> bei 37 ° C inkubieren 30min für Gel zu bilden. </li><li> 100 l Medien an die Spitze der gebildeten Hydrogele und bei 37 ° C inkubiert. </li></ol></li><li> Dreidimensionale Zellkultur auf variabler Steifigkeit Gele <ol><li> Mit Lösung von 1.3.3, Pipette 100 ul Pregel-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> bei 37 ° C 30 Minuten inkubieren für Gel zu bilden. Hinweis: Die Vernetzung Schritte von Teil 2 kann hier verwendet werden. </li><li> Passage Zellen 9. </li><li> In 10.000 Zellen / cm 2 in die Vertiefungen. </li><li> Erhöhen Medien zu 100 ul pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Einer der integralen Aspekte der Biologie ist die Selbstorganisation der Moleküle in hierarchischer Strukturen, die eine bestimmte Aufgabe auszuführen. 13 Im Labor Selbstorganisation hängt von zahlreichen Faktoren wie Salzkonzentration, pH, und die Verdauung Dauer. Wie gezeigt ist, selbstorganisierend Hydrogel bildet sich, wenn solubilisiert Proteine ​​Rückkehr zu einer physiologischen Temperatur. Das Hydrogel gebildet ist in der Lage zur Förderung der Zellanhaftung und Proliferation in vitro. <p...

Die Übersetzung von In-vitro-Ergebnissen in die Klinik ist eine der größten Herausforderungen, mit denen biomedizinische Forscher konfrontiert sind. Die In-vitro-Forschung an Gewebekulturkunststoffen ist einfacher, bequemer und behält eine hohe Zellviabilität bei. 1 Dieser Ansatz ist ein vernünftiger Ausgangspunkt, aber die Ergebnisse haben eine begrenzte klinische Translation. Laboratorien setzen zunehmend dreidimensionale Konstrukte ein, um die traditionellen zweidimensionalen Methoden zu ersetzen. Bewertungen sind für viele dreidimensionale Umgebungen verfügbar, von biologischen Gerüsten bis hin zu Polymergerüsten. 2,3 kg
Biologische Gerüste können Eigenschaften von in vivo-Umgebungen nachahmen, da sie viele der Protein- und Glykosaminoglykankomponenten der nativen Matrix enthalten und vertraute Bindungsstellen bieten, an die sich Zellen anheften und die sie erkennen können. Aus der extrazellulären Matrix (ECM) gewonnene Materialien haben sich als leistungsfähige Gerüste für die Zellanhaftung und -proliferation erwiesen. 4 Eine Herausforderung, die den Einsatz von ECM-Hydrogel-Plattformen einschränkt, ergibt sich aus ihren inhärent schwachen mechanischen Eigenschaften nach der Gelierung. Natives Gewebe hat oft mechanische Eigenschaften, die um Größenordnungen höher sind als bei Hydrogelen. Ungiftige Vernetzungsmittel können die mechanischen Eigenschaften von Hydrogelen verbessern, um die native Gewebeumgebung besser nachzuahmen. Genipin ist ein ungiftiger, natürlicher Vernetzer, der aus Gardenienpflanzen gewonnen wird und die Fähigkeit hat, die mechanischen Eigenschaften von ECM genau an Änderungen der Genipinkonzentration anzupassen5,6. 
Fast alle Zellen im Körper existieren in und organisieren sich auf der EZM, die sie entweder produzieren oder aufrechterhalten. Der neue Fokus auf die universelle Bedeutung von ECM für die Organisation, den Zustand und die Funktion in jedem Organ oder System hat die Produktion von matrixbasierten Plattformen für die In-vitro-Untersuchung ausgelöst. Die Submukosa des Schweinedünndarms ist das am umfangreichsten untersuchte Gerüst natürlichen Ursprungs und wird zur Regeneration von Sehnen, Bändern, Skelettmuskulatur4 und sogar Knochen7 verwendet. Matrizen aus anderen Organen und Spenderarten haben ebenfalls ein gutes Geweberegenerationspotenzial gezeigt. Die Verwendung von fremden EZM-Komponenten verursacht minimale Probleme bei der Immunmodulation. Nach Eliminierung der zellulären Substanz des Wirts wird die verbleibende EZM in Aminosäuregehalt und Organisation ähnlich wie bei allen anderen Säugetierartensein 8. Es gibt eine wachsende Denkweise, dass der beste Weg, Zell-EZM-Interaktionen in vitro zu untersuchen, die Verwendung von organspezifischen EZM-Gerüsten ist. Jedes Organ bietet eine einzigartige Zusammensetzung von Proteinen und Proteoglykanen, um zelluläre Nischen zu schaffen. Nischen bieten strukturellen, funktionellen und sogar enzymatischen Abbau der extrazellulären Matrix, die zur biophysikalischen Signalübertragung beiträgt. Um eine in vitro Mikroumgebung zu erreichen, die der in vivo Mikroumgebung am ähnlichsten ist, würde die Verwendung von gewebespezifischer EZM die zellulären Nischen für die Forschung optimieren. 
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Etablierung eines Hydrogel-Gerüsts bereitzustellen, das für die Lungen-ECM einzigartig ist. Diese Methode bietet eine Plattform für die in vitro-Forschung zu Lungenzell-EZM-Interaktionen.

<table><tbody><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Verwendung im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen.</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100g</td><td>Verwendung in der Haube mit Augenschutz und Handschuhen.</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500g</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-500g</td><td>Keine</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td>Keine</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>Mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>Im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td>Mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>Im Abzug mit Augenschutz und Handschuhen verwenden.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Qualität Biologisch</td><td>119-069-151</td><td>Keine</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Handpumpe</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-239-1</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Graduiertenbecher</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cryomill</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>Kryohandschuhe und Öse verwenden Schutz.</td></tr><tr><td>Lyophilisator</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>Handschuhe verwenden.</td></tr><tr><td>Rheometer</td><td>Discovery</td><td>HR-2</td><td>Verwenden Sie Handschuhe und Augenschutz.</td></tr></tbody></table>

tunable hydrogele aus pulmonary extrazellulärmatrix für 3d-zellkultur

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Hier stellen wir ein Verfahren zur Mehrkomponenten - Zellkultur - Hydrogele für in - vitro - Lungen - Zellkultur zu etablieren. Beginnend mit gesunden en bloc Lungengewebe von Schweinen, Ratte oder Maus wird das Gewebe durchblutet und unter Wasser in nachfolgenden chemischen Reinigungsmittel , die Zelltrümmer zu entfernen. Histologische Vergleich des Gewebes vor und nach der Verarbeitung bestätigt Entfernung von mehr als 95% der Doppelstrang-DNA und alpha-Galactosidase-Färbung schlägt die Mehrheit der Zelltrümmer entfernt wird. Nach Dezellularisierung wird das Gewebe lyophilisiert und dann in ein Pulver cryomilled. Das Matrixpulver wird 48 h in einer sauren Pepsinverdau Lösung verdaut und dann die Pregel-Lösung neutralisiert zu bilden. Gelieren der Pregel Lösung kann durch Inkubation bei 37 ° C induziert werden und kann unmittelbar nach der Neutralisation oder bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Beschichtungen können unter Verwendung der Vorgellösung auf einer nicht behandelten Platte für c gebildet werdenell Befestigung. Zellen können in dem Vorgel vor Selbstmontage ausgesetzt werden, um eine 3D-Kultur zu erreichen, die auf der Oberfläche eines geformten Gels plattiert, aus dem die Zellen durch das Stützgerüst migrieren können oder auf den Beschichtungen überzogen. Änderungen der Strategie vorgestellt kann Gelierungstemperatur, Stärke oder Protein Fragmentgrößen auswirken. Jenseits Hydrogelbildung kann das Hydrogel Steifigkeit erhöht werden Genipin verwenden.

Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir Hydrogele aus normalen Schwein, Ratte produziert und Mauslungen (Abbildung 1). Verarbeitet Lungen liefern schätzungsweise 5 mg, 40 mg und 10 g ECM-Pulver sind. Ein Überblick über das Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt. Key-Visualisierungen während des Prozesses sind: weißes Aussehen der Lunge nach deoxycholate Spülen; nach der Bildung Pregel sollte die Lösung opak sein, und die Lösung sollte für Monate h...

Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur Herstellung maßgeschneiderter Hydrogele besteht darin, Zellen und Kulturbedingungen zu untersuchen, die die Komplexität der extrazellulären Matrix der Lunge nachbilden. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im pulmonalen Bereich zu beantworten, beispielsweise wie Lungenzellen unter gesunden und pathologischen Bedingungen mit der ECM interagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Hydrogele auf der Basis der Lungen-ECM an die jeweilige Anwendung in der 2D- oder 3D-Kultur angepasst werden können.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Komplexität der Entzellularisierungstechniken Schwierigkeiten, die manchmal mehrere Personen und eine sorgfältige Beachtung der Details erfordern, um die Menge an lebensfähigem Gewebe zu optimieren. Für dieses Protokoll sollte eine Schweinelunge zur Entzellularisierung bereitstehen. Einzelheiten zu ihrer Vorbereitung finden sich im Textprotokoll.Nachdem die Lunge vorbereitet wurde, verwenden Sie eine Handpumpe, die so kaniert ist, dass sie in die Pulmonalarterie passt. Perfundieren Sie zunächst etwa einen Liter Wasser in das Gefäßsystem und anschließend 1,5 Liter in die Trachea. Wiederholen Sie dies dreimal und erhöhen Sie dabei das Volumen des perfundierten Wassers, während zellulärer Abfall entfernt wird.Als Nächstes perfundieren Sie das Gewebe mit Triton X-100 unter Verwendung der Handspritze. Anschließend tauchen Sie das Gewebe 24 Stunden lang in ein Bad mit Triton X-100-Lösung bei vier Grad Celsius ein. Nach 24 Stunden spülen Sie das Gefäßsystem und die Luftröhre dreimal mit destilliertem Wasser aus.Nach den Spülgängen verwenden Sie die Handspritze, um das Gewebe mit Deoxycholat zu perfundieren. Anschließend tauchen Sie das Gewebe 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius in Deoxycholat ein. Am nächsten Tag spülen Sie das Gewebe dreimal wie zuvor mit destilliertem Wasser ab.Nach den Spülgängen verwenden Sie die Handspritze, um das Gewebe mit filtrierter Natriumchloridlösung zu perfundieren. Anschließend tauchen Sie das Gewebe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in filtriertes Natriumchlorid ein. Nach dem Bad perfundieren Sie die Gefäße und die Luftröhre dreimal mit destilliertem Wasser zur Spülung.Nach den Spülgängen das Gewebe mit DNase-Lösung perfundieren und anschließend eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in DNase-Lösung eintauchen. Nach einer Stunde die Gefäße und die Luftröhre fünfmal mit PBS, nicht mit Wasser, perfundieren. Anschließend unter Verwendung ausschließlich opaken, weißen Gewebes alle Tubuli, die einen Durchmesser von zwei Millimetern oder mehr aufweisen, herausschneiden.Sie finden sich hauptsächlich um das Hilum und die mediale Region der Lungen. Belassen Sie die Atemzonen unversehrt, die sich größtenteils in der Peripherie befinden. Nach dem Entfernen der Tubuli wird das Gewebe in Abschnitte von einer inch Länge oder kleiner zerschnitten.Die Ausrichtung dieser Blöcke ist nicht wichtig. Nach dem Abtrennen der Gewebeproben überführen Sie diese in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen und frieren sie bei 80 Grad Celsius ein. Einige Proben können für die Histologie beiseitegestellt werden, um die Entfernung der Zellen und Ablagerungen zu bestätigen.Um das Lungengewebe in ein entzelligtes Pulver umzuwandeln, ersetzen Sie die Abdeckung des mit gefrorenem Gewebe versehenen Röhrchens durch ein Filterpapier und befestigen Sie dieses mit einem Gummiband. Anschließend trocknen Sie das Gewebe mittels Gefriertrocknung, bis sämtliche überschüssige Flüssigkeit entfernt ist, wobei Sie einen Gefriertrockner gemäß den Herstelleranweisungen verwenden. Danach lagern Sie das Gewebe bei 80 Grad Celsius, bis es gemahlen werden kann.Um die Mühle vorzubereiten, füllen Sie sie zunächst mit flüssigem Stickstoff und lassen Sie Platz für das Mühlenrohr. Entfernen Sie danach den magnetischen Mühlenstab aus dem Mühlenrohr und bedecken Sie das untere Ende des Rohrs mit Gewebe. Setzen Sie anschließend den Mühlenstab wieder ein und füllen Sie das Rohr locker mit weiterem Gewebe auf. Danach schließen Sie das Mühlenröhrchen, stellen es in die Gefriermühle und füllen die Mühle mit flüssigem Stickstoff bis zur maximalen Kapazität. Führen Sie nun die Mahlung etwa fünf Minuten lang mit einer Stoßfrequenz von etwa 600 pro Minute durch. Anschließend bewahren Sie das entzelligte Pulver bei -80 Grad Celsius auf, bis es benötigt wird.Um das Prägel-Material herzustellen, fügen Sie entzellularisiertes Gewebepulver und Pepsin einem kegelförmigen Reaktionsgefäß hinzu. Geben Sie anschließend 0,01 molare Salzsäure in das Gefäß, sodass eine Endkonzentration von 1 % entzellularisiertem Gewebepulver und 0,01 % Pepsin erreicht wird. Lagern Sie diese Lösung 48 Stunden lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren, um das Gewebe abzubauen. Nach 48 Stunden die Lösung fünf Minuten lang auf Eis stellen. Puffern Sie nun den pH-Wert der Lösung mit kalter 0,1-molarer Natriumhydroxid auf 7,4 ein und stellen Sie anschließend die PBS-Konzentration der Lösung durch Zugabe von 10X PBS auf 1X ein. Wir haben bereits Erfahrungen mit der Variation der Zeiten und des pH-Werts des Prägels gesammelt.Es gibt gewisse Flexibilitätsmöglichkeiten im verwendbaren Bereich, jedoch können sich die Eigenschaften drastisch ändern, wenn das Verfahren in geringfügigen Aspekten abgeändert wird. Die Lösung gilt nicht als Prä-Gel und kann verwendet werden, um nicht behandelte Platten zu beschichten, um Hydrogele zur Zellkultivierung auf der Oberfläche zu bilden, um Hydrogele zur Zellkultivierung innerhalb des Gels zu bilden, oder sie kann vor der Hydrogelbildung weiter modifiziert werden, um die Steifigkeit der Hydrogele zu erhöhen. Um Zellen auf einer zweidimensionalen mikroporösen Gelbeschichtung zu kultivieren, geben Sie 20 Mikroliter der Prä-Gel-Lösung in die Vertiefungen einer 96-Loch-Nicht-Behandlungs-Zellkulturplatte.Anschließend die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius kühlen, damit die Proteine an die Platte gebunden werden. Am nächsten Tag die Vor-Gel-Lösung absaugen und die Vertiefungen mit PBS spülen. Danach 3.200 Zellen in jede Vertiefung geben und das Mediumvolumen in jeder Vertiefung auf 100 Mikroliter auffüllen.Die Platten können anschließend inkubiert werden. Für eine dreidimensionale Zellkultur mit Zellen innerhalb des mikroporösen Gels suspendieren Sie die gewünschten Zellen mit einer Dichte von einer Million pro Milliliter in der Prä-Gel-Lösung. Geben Sie dann umgehend 16 Mikroliter der Zellsuspension in jedes Loch einer 96-Loch-Platte, um eine 3D-Zellkultur mit einer Dicke von etwa 500 Mikrometern zu bilden.Das Gel bildet sich innerhalb von 30 Minuten, sobald es bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Nachdem sich die Gele gebildet haben, fügen Sie das Medium bis zur 100-Mikroliter-Marke in die Vertiefungen hinzu. Für eine dreidimensionale Zellkultur mit Zellen auf der Oberseite des mikroporösen Gels geben Sie 100 Mikroliter der Prä-Gel-Lösung in die Vertiefungen einer unbehandelten 96-Loch-Platte. Anschließend die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius zur Geleierung inkubieren. Sobald die Gele gebildet sind, 3.200 Zellen in 100 Mikroliter Medium auf die Hydrogele geben und die Platte weiter inkubieren. Hydrogele wurden aus normalen Lungen von Schwein, Ratte und Maus mit der beschriebenen Methode hergestellt.Die rheologische Prüfung bestätigte, dass über 90 % der Gelbildung innerhalb der ersten Minuten nach Erreichen von 37 Grad Celsius erfolgt. Die gebildeten Hydrogelen waren über lange Zeiträume in PBS stabil, jedoch können sich Zelladhäsion und -proliferation mit der Zeit verändern. Die Prägel-Lösung wurde als Beschichtung zur Verbesserung der Zelladhäsion getestet.Die Anheftung und Proliferation humaner Endothelzellen der Nabelvene wurde mittels MTTSA gemessen. Durch Beschichtung der Mulden mit ECM wurden Verbesserungen beobachtet. Bei der Herstellung von 3D-Gelen führte die Zugabe von Genipin zu einer erhöhten Vernetzung des Hydrogels.Mithilfe von Frequenzscans an einem Rheometer wurde die Steifheit des Hydrogels direkt mit der Genipin-Konzentration korreliert, wobei die mittlere und aussagekräftigste Konzentration 0,01 % betrug. Bei der Untersuchung der steiferen Gele wurde die Zellproliferation mittels MTTSA auf den Gele mit erhöhter Vernetzung als höher gemessen. Einmal beherrscht, kann die Entzellularisierung innerhalb von acht Stunden über vier Tage durchgeführt werden. Die Vorstufe der Gel-Lösung kann innerhalb von einer Stunde über zwei Tage hergestellt werden, und die Gelbildung kann innerhalb von zwei Stunden über zwei Tage abgeschlossen werden.Mit dieser Methode können weitere Verfahren wie AFM, Western Blots, Färbungen und Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich des elastischen Moduls, der Proteinzusammensetzung und der zellulären Reaktion auf das Material.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Einfache Techniken für die schnelle Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Kultur-Systeme mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel für die dynamische Maske Projektion Lithographie auf regelmäßige Zellkultursubstraten beschrieben. Diese Kultur-Systeme können mehr Vertreter des natürlichen biologischen Architektur, und die beschriebenen Techniken könnten für zahlreiche Anwendungen angepasst werden.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Wir beschreiben die Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogelplatten mit einem einfachen Prozess, der in einer freistehenden Form zusammengesetzt und manipuliert werden kann. Unter Verwendung dieser modularen Hydrogel-Platten kann ein einfaches makroskaliertes 3D-Zellkultursystem mit einer kontrollierten zellulären Mikroumgebung erzeugt werden.

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Echtzeit Zellbiologie Studien. Hier wird ein Verfahren für FRET Abbildungszellen in physiologischen dreidimensionalen (3D) Hydrogel-Mikroumgebungen herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskopie verwendet wird präsentiert. Eine Analyse für ratiometrisches FRET-Sonden, die lineare Verhältnisse über den Aktivierungsbereich ergibt beschrieben.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Verschiedene Methoden zu manipulieren, dreidimensionalen Architektur in Protein-basierte Hydrogele werden hier in Bezug auf die Materialeigenschaften ausgewertet. Die makroporöse Netze sind mit einer Zelle-Klebstoff-Peptid funktionalisiert und deren Umsetzbarkeit in der Zellkultur wird ausgewertet, mit zwei verschiedenen Modell-Zelllinien.

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von elastischen 3D makroporöse Microcryogels durch die Integration von Microfabrication mit Cryogelation Technologie. Beim Laden mit Zellen, entstehen 3D Microtissues, die kann leicht injizierte in Vivo , regenerative Therapie zu erleichtern oder zu Arrays für in-vitro- Hochdurchsatz-Drogen-Screening montiert.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

Aktuelle Bilayer Kultur Modelle erlauben nicht funktioneller in-vitro- Studien, die in Vivo Mikroumgebungen zu imitieren. Mit Polyethylenglykol und Zinkoxid Template Methode, beschreibt dieses Protokoll die Entwicklung der eine ultradünne biomimetische Basalmembran mit einstellbaren Steifigkeit, Porosität und biochemische Zusammensetzung, die eng in Vivo imitiert extrazellulären Matrizen.

Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur

Rekombinantes Protein-Engineering Hydrogele sind für 3D Zellkultur von Vorteil, da sie für komplette Einstellbarkeit der Polymer-Rückgrat und sich somit die Zelle Mikroumgebung ermöglichen. Hier beschreiben wir den Prozess der rekombinante Elastin-wie Proteinreinigung und ihre Anwendung in 3D Hydrogel Zelle Kapselung.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Wir entwickelten eine heterogene Brust-Krebs-Modell, bestehend aus verewigt Tumor und Fibroblasten-Zellen eingebettet in ein Bioprintable Alginat/Gelatine Bioink. Das Modell der in Vivo Tumor Mikroumgebung rekapituliert und erleichtert die Bildung von mehrzelligen Tumor Sphäroide, Einblick in die Mechanismen fahren Tumorgenese nachgeben.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

In diesem Artikel wird beschrieben, wie phototunbare Hydrogele in 3D biogedruckt werden, um die Versteifung der extrazellulären Matrix und die Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen.

3D-Bioprinting von phototunbaren Hydrogelen zur Untersuchung der Fibroblastenaktivierung

Erfahren Sie die Herstellung anpassbarer Hydrogel aus pulmonaler extrazellulärer Matrix für 3D-Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-ECM-Interaktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

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