Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur
17. Januar 2017
Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur Herstellung maßgeschneiderter Hydrogele besteht darin, Zellen und Kulturbedingungen zu untersuchen, die die Komplexität der extrazellulären Matrix der Lunge replizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im pulmenären Bereich zu beantworten, z. B. wie Lungenzellen mit EZM unter gesunden und pathologischen Bedingungen interagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Lungen-ECM-Hydrogele auf Ihre Anwendung in 2D- oder 3D-Kultur zugeschnitten werden können.
Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Komplexität der Dezellularisierungstechniken Schwierigkeiten, die manchmal mehrere Personen und Liebe zum Detail erfordern, um die Menge an lebensfähigem Gewebe zu optimieren. Für dieses Protokoll halten Sie eine Schweinelunge für die Dezellularisierung bereit. Einzelheiten zur Erstellung finden Sie im Textprotokoll.
Sobald die Lunge vorbereitet ist, verwenden Sie eine Handpumpe, die kanüliert ist, um in die Lungenarterie zu passen. Zuerst perfundierten Sie etwa einen Liter Wasser in das Gefäßsystem und dann 1,5 Liter in die Luftröhre. Tun Sie dies dreimal, indem Sie das Volumen des durchbluteten Wassers erhöhen, wenn Zelltrümmer entfernt werden.
Anschließend perfundieren Sie das Gewebe mit Triton X-100, ebenfalls mit der Handpumpe. Tauchen Sie dann das Gewebe 24 Stunden lang in ein Bad mit Triton X-100-Lösung bei vier Grad Celsius. Spülen Sie nach 24 Stunden das Gefäßsystem und die Luftröhre dreimal mit destilliertem Wasser aus.
Verwenden Sie nach den Spülungen die Handpumpe, um das Gewebe mit Desoxycholat zu durchbluten. Und dann tauchen Sie das Gewebe 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius in Desoxycholat. Spülen Sie das Gewebe am nächsten Tag wie zuvor dreimal mit destilliertem Wasser aus.
Verwenden Sie nach den Spülungen die Handpumpe, um das Tuch mit gefiltertem Natriumchlorid zu durchbluten. Tauchen Sie das Gewebe dann eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in gefiltertes Natriumchlorid. Nach dem Bad das Gefäßsystem und die Luftröhre dreimal mit destilliertem Wasser durchbluten, um es zu spülen.
Nach den Spülungen durchbluten Sie das Gewebe mit DNase-Lösung und tauchen Sie es dann eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in DNase-Lösung. Nach einer Stunde perfundieren Sie das Gefäßsystem und die Luftröhre fünfmal mit PBS, nicht mit Wasser. Präparieren Sie nun nur noch mit undurchsichtigem weißem Gewebe alle Tubuli, die einen Durchmesser von zwei Millimetern oder mehr haben.
Sie sind hauptsächlich um das Hilum und die medialen Anteile der Lunge herum zu finden. Lassen Sie die Atmungszonen, die sich meist in der Peripherie befinden, intakt. Nachdem Sie die Tubuli entfernt haben, zerlegen Sie das Gewebe in einen Zoll oder kleinere Abschnitte.
Die Ausrichtung dieser Blöcke ist nicht wichtig. Nachdem Sie die Gewebeblöcke entleert haben, geben Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und frieren Sie sie bei 80 Grad Celsius ein. Einige Blöcke können für die Histologie reserviert werden, um die Entfernung der Zellen und Ablagerungen zu bestätigen.
Um das Lungengewebe zu dezellularisiertem Pulver zu verarbeiten, ersetzen Sie die Abdeckung des gefrorenen Geweberöhrchens durch ein Filterpapier und sichern Sie dieses mit einem Gummiband. Lyophilisieren Sie dann das Gewebe, bis die gesamte überschüssige Flüssigkeit mit einem Gefriertrockner gemäß den Anweisungen des Herstellers verschwunden ist. Lagern Sie das Gewebe dann bei 80 Grad Celsius, bis es gefräst werden kann.
Um die Mühle vorzubereiten, beladen Sie sie zuerst mit flüssigem Stickstoff und lassen Sie Platz für das Mühlenrohr. Entfernen Sie anschließend die magnetische Mahlstange aus dem Mahlrohr und bedecken Sie den Boden des Röhrchens mit Gewebe. Setzen Sie dann die Mahlstange wieder ein und packen Sie locker mehr Tuch hinein, um die Tube zu füllen.
Schließen Sie dann das Mühlenrohr, legen Sie es in den Gefrierschrank/die Mühle und füllen Sie die Mühle bis zur maximalen Kapazität mit flüssigem Stickstoff. Lassen Sie die Mühle nun etwa fünf Minuten lang mit einer Impaktionsrate von etwa 600 pro Minute laufen. Lagern Sie dann das dezellularisierte Pulver bei 80 Grad Celsius, bis es benötigt wird.
Um das Pre-Gel-Material herzustellen, geben Sie dezellularisiertes Gewebepulver und Pepsin in ein konisches Röhrchen. Geben Sie dann 0,01 molare Salzsäure in das Röhrchen, um eine Endkonzentration von 1 % dezellularisiertem Gewebepulver und 0,01 % Pepsin zu erreichen. Halten Sie diese Lösung 48 Stunden lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren, um das Gewebe zu verdauen.
Legen Sie die Lösung nach 48 Stunden fünf Minuten lang auf Eis. Stellen Sie nun den pH-Wert der Lösung mit kaltem 0,1 molaren Natriumhydroxid auf 7,4 ein und bringen Sie dann die PBS-Konzentration der Lösung auf 1X, indem Sie das 10-fache PBS hinzufügen. Wir haben einige Erfahrung mit der Änderung der Zeiten und des pH-Werts des Pre-Gels.
Es gibt eine gewisse Flexibilität in der Reichweite, die verwendet werden kann, aber die Eigenschaften können sich dramatisch ändern, wenn das Verfahren geringfügig geändert wird. Die Lösung gilt nicht als Vorgel und kann verwendet werden, um unbehandelte Platten zu beschichten, um Hydrogele zu bilden, auf denen Zellen gebildet werden, um Hydrogele zu bilden, in denen Zellen gebildet werden, oder sie kann vor der Bildung von Hydrogelen weiter modifiziert werden, um die Steifigkeit der Hydrogele zu erhöhen. Um Zellen auf einer zweidimensionalen mikroporösen Gelbeschichtung zu kultivieren, geben Sie 20 Mikroliter Pre-Gel-Lösung in die Vertiefungen einer unbehandelten 96-Well-Gewebekulturplatte.
Kühle die Platte dann über Nacht bei vier Grad Celsius, damit die Proteine auf der Platte aufgenommen werden. Am nächsten Tag aspirieren Sie die Pre-Gel-Lösung und spülen die Vertiefungen mit PBS. Geben Sie dann 3.200 Zellen in jede Vertiefung und füllen Sie das Medienvolumen in jeder Vertiefung auf 100 Mikroliter auf.
Die Platten können dann inkubiert werden. Für eine dreidimensionale Zellkultur mit Zellen im Inneren des mikroporösen Gels resuspendieren Sie die interessierenden Zellen bei einer Million pro Milliliter in einer Pre-Gel-Lösung. Geben Sie dann schnell 16 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, um eine 3D-Zellkultur zu bilden, die etwa 500 Mikrometer dick ist.
Das Gel bildet sich in 30 Minuten, sobald es bei 37 Grad Celsius inkubiert ist. Nachdem sich die Gele gebildet haben, geben Sie Medien bis zu den 100-Mikroliter-Markierungen in die Vertiefungen. Für eine dreidimensionale Zellkultur mit Zellen auf dem mikroporösen Gel geben Sie die 100 Mikroliter der Pre-Gel-Lösung in die Vertiefungen einer unbehandelten 96-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius zur Gelierung. Sobald sich die Gele gebildet haben, fügen Sie 3.200 Zellen in 100-Mikroliter-Medien auf die Hydrogele hinzu und fahren Sie mit der Inkubation der Platte fort. Hydrogele wurden aus normalen Schweine-, Ratten- und Mauslungen unter Verwendung der beschriebenen Methode hergestellt.
Rheologische Tests bestätigten, dass über 90 % der Gelierung in den ersten Minuten nach Erreichen von 37 Grad Celsius erfolgt. Die gebildeten Hydrogele waren bei PBS über lange Zeiträume stabil, aber die Zelladhäsion und -proliferation kann sich mit der Zeit ändern. Die Pre-Gel-Lösung wurde als Kodierung zur Verbesserung der Zelladhäsion getestet.
DieAdhäsion und Proliferation der Endothelzellen der menschlichen Nabelvene wurde mit Hilfe einer MTTSA gemessen. Verbesserungen wurden durch die Beschichtung der Bohrlöcher mit ECM beobachtet. Bei der Herstellung von 3D-Gelen erhöhte die Zugabe von Genipin die Vernetzung des Hydrogels.
Unter Verwendung von Frequenz-Sweeps auf einem Rheometer wurde die Hydrogelsteifigkeit direkt mit der Genipin-Konzentration korreliert, wobei die mittlere und relevanteste Konzentration 0,01 % betrug. Beim Testen der starreren Gele wurde gemessen, dass die Zellproliferation durch ein MTTSA auf den Gelen mit erhöhter Vernetzung höher war. Einmal gemeistert, kann die Dezellularisierung in acht Stunden über vier Tage durchgeführt werden. Die Pre-Gel-Lösung kann über zwei Tage in einer Stunde hergestellt werden, und die Gelbildung kann in zwei Stunden über zwei Tage durchgeführt werden.
Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie AFM, Western Blots, Färbung und Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Elastizitätsmodul, Proteinzusammensetzung und zelluläre Reaktion auf das Material zu beantworten.
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Übersicht
Diese Methode beschreibt die Herstellung eines dreidimensionalen Zellkulturgerüsts unter Verwendung der pulmonalen extrazellulären Matrix. Das Verfahren umfasst die Entzellerung intakten Lungengewebes zur Herstellung von Hydrogelen, die das Zellwachstum in drei Dimensionen ermöglichen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellkultur
- Forschung zur extrazellulären Matrix
- Pulmonalbiologie
Hintergrund
- Diese Methode zielt darauf ab, die Komplexität der extrazellulären Matrix der Lunge nachzubilden.
- Sie beschreibt, wie Lungenzellen unter verschiedenen Bedingungen mit der ECM interagieren.
- Die Technik ermöglicht die Anpassung von Hydrogelen für spezifische Anwendungen.
- Die Entzellularisierung erfordert eine sorgfältige Arbeitsweise und gegebenenfalls mehrere Personen.
Zweck der Studie
- Entwicklung von Hydrogelen, die die Lungen-ECM für Forschungszwecke nachahmen.
- Untersuchung des Zellverhaltens unter gesunden und pathologischen Lungenbedingungen.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Lungenzellen.
Verwendete Methoden
- Entzellularisierung von Schweinelungengewebe.
- Herstellung von Hydrogelen aus der extrazellulären Matrix.
- Zellkultur in 2D- und 3D-Umgebungen.
- Optimierung der Gewebeviabilität während des Verfahrens.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung anpassbarer Lungen-ECM-Hydrogele.
- Verbessertes Verständnis der Wechselwirkungen von Lungenzellen mit der ECM.
- Nachgewiesenes Anwendungspotenzial in verschiedenen Forschungskontexten.
- Identifizierung von Herausforderungen im Decellularisierungsprozess.
Schlussfolgerungen
- Die Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für die pulmonale Forschung dar.
- Hydrogele können an spezifische experimentelle Anforderungen angepasst werden.
- Weitere Studien können die Auswirkungen der ECM auf die Lungenfunktion untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die Herstellung einstellbarer pulmonaler Hydrogele aus extrazellulärer Matrix, die die Komplexität des Lungengewebes für In-vitro-Studien nachbilden. Sie unterstützt die mechanistische Risikominderung bei der Target-Validierung, indem sie ein krankheitsrelevantes System bereitstellt, um Zell-ECM-Interaktionen unter gesunden und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Die einstellbare Steifigkeit und das anpassbare Format erhöhen das Vorhersagevertrauen bei der Auswahl präklinischer Modelle und der Entwicklung von Assays.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Modellierung der Wechselwirkungen von Lungenzellen mit der nativen ECM.
- Operationaler Wert: Bietet ein reproduzierbares biologisches System zur Aufklärung von Signalwegen und Validierung funktioneller Zielstrukturen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch krankheitsrelevante 3D-Kulturen, die die Übereinstimmung translationaler Biomarker verbessern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte Hydrogele mit quantifizierbaren Ergebnissen für eine zuverlässige Wirkstoffprüfung.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung und Skalierbarkeit von Assays durch einstellbare Gelier-Temperatur und -Steifigkeit.
- Wiederverwendungspotenzial: Bildet Beschichtungen oder 3D-Gerüste, die mit Hochdurchsatz-Plattierungen und nachgeschalteten Analysen kompatibel sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Gewährleistet eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung unter Verwendung eines physiologisch relevanten Lungen-ECM.
- Risikominderung: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die Steifigkeit des Hydrogels (über Genipin-Vernetzung) mit den Ergebnissen zur zellulären Proliferation korreliert wird.
- Entscheidungsunterstützung: Unterstützt risikoadjustierte Fortschrittsentscheidungen durch messbare Veränderungen in Zelladhäsion und -migration.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Biologie bis zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, indem sie eine anpassbare 3D-Kulturplattform bereitstellt, die die lungen-spezifische Mikroumgebung modelliert.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem Zellkulturen unter kontrollierten Bedingungen in Lunge-abgeleiteter ECM ermöglicht werden.
- Screening: Bietet assaysbereite Hydrogele mit reproduzierbarer Gelierung und quantifizierbarer Dicke für eine konsistente Evaluierung von Substanzen.
- Analytik: Erzeugt messbare Ergebnisse wie Gelformationskinetik, Steifigkeit und Zellproliferation zur Analyse vergleichender Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Forschungsergebnisse mit präklinischer Arbeit durch modellbasierte Abbildung krankheitsrelevanter Systeme und auswertbare, biomarker-kompatible Endpunkte.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Hydrogel-Plattform, die über Nagetier- und Schweinemodelle hinweg anpassbar ist, um eine Standardisierung über Projekte hinweg zu gewährleisten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten in Studien zu Lungenzellen und extrazellulärer Matrix reduziert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Schritte der Entzellularisierung, Verdauung und Gelierung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine frühe Beurteilung der Wirkstoffeffekte in einer physiologisch relevanten Matrix ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung durch anpassbare Hydrogele, die die steifigkeitsveränderte ECM bei Krankheiten modellieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Entzellularisierung von Geweben und der Herstellung von Hydrogelen, um Vitalität und Konsistenz sicherzustellen.
- Ist abhängig von spezialisierten Geräten wie Gefriertrockner, Kryomühle und Rheometer zur Prozesssteuerung und Charakterisierung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Hydrogel-Zusammensetzung und Lagerungsprotokolle für reproduzierbare Ergebnisse.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung der Methode an Lungen unterschiedlicher Spezies oder Krankheitsmodelle.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie mehrtägige Verarbeitungszeiten und Empfindlichkeit gegenüber prozeduralen Änderungen, die die Gel-Festigkeit beeinflussen.
