Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie ein konfokales Mikroskop, das mit einem Femtosekundenpulslaser ausgestattet ist, verwendet werden kann, um dreidimensionale vaskuläre abgeleitete biomimetische mikrofluidische Netzwerke zu erzeugen, die in Polyethylenglykoldiacrylat-Hydrogele eingebettet sind, und zwar unter Verwendung einer bildgesteuerten laserbasierten Degradation. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, dreidimensionale biomimetische mikrofluidische Netzwerke zu erzeugen, die die Dichte, Tortuosität, den Größenbereich und die Gesamtarchitektur von in vivo Gefäßen in synthetischen Konstrukten genau rekapitulieren. Dieser mikrofluidische Herstellungsansatz wird unsere Fähigkeit verbessern, mehr in vivo wie Tissue-Engineering-Konstrukte, biomimetische Krankheitsmodelle und On-a-Chip-Bauelemente mit ultrahoher Dichte zu erzeugen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die richtige Einrichtung und Implementierung der Mikroskopsoftware nicht intuitiv ist, aber entscheidend für die Bildung der gewünschten mikrofluidischen Netzwerke. Viele der vorbereitenden Schritte sind im Textprotokoll enthalten, darunter das Generieren der virtuellen Masken, das Konfigurieren des Mikroskops und das Hochladen der virtuellen Masken in die Mikroskopsoftware. Um das PEGDA-Hydrogel zu photopolymerisieren, befestigen Sie zunächst einen Ring aus doppelseitigem Klebstoff an einer 60-Millimeter-Petrischale, in deren Boden ein 20-Millimeter-Loch ausgeschnitten ist.

Geben Sie anschließend in einem Abzug einen Milliliter HBS mit TEOA zu einem mit Folie bedeckten braunen Zentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern. Geben Sie dann 10 Mikroliter eines millimolaren Eosin Y-Dinatriumsalzes in das Röhrchen. Pipettieren Sie nun mit einer Glaspipette eine kleine Menge NVP in ein Glasbecherglas.

Nehmen Sie von diesem Volumen 3,5 Mikroliter NVP und geben Sie es in die Mischung. Geben Sie als Nächstes 10 Milligramm 3,4 Kilodalton PEGDA in ein zweites mit Folie bedecktes Röhrchen. Fügen Sie dann 0,2 Milliliter der Mischung hinzu, um eine PEGDA-Prepolymerlösung mit 5 Vol.-% herzustellen.

Wirbeln Sie nun die Prepolymerlösung vortexen, bis sich das PEGDA vollständig aufgelöst hat. Pipettieren Sie dann 60 Mikroliter in eine PDMS-Form, ohne Blasen hinzuzufügen. Zentrieren Sie nun ein acryliertes Deckglas mit der Nummer 1,5 über die Lösung auf den PDMS-Abstandhaltern.

Stellen Sie die Baugruppe dann unter eine Weißlichtquelle, die auf 95 Milliwatt kalibriert ist. Härten Sie das Polymer drei Minuten lang aus. Lassen Sie anschließend destilliertes Wasser zwischen der Form und dem Deckglas fließen, um das Hydrogel vom PDMS zu trennen und das Hydrogel abzuspülen.

Tupfen Sie dann die Ränder des Deckglases vorsichtig trocken, ohne Wasser aus dem Hydrogel zu entfernen. Kleben Sie nun das Deckglas auf die vorbereitete Petrischale. Ein bisschen Druck hilft.

Tauchen Sie dann das Hydrogel in destilliertes Wasser. Richten Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop wie im Textprotokoll beschrieben ein und starten Sie in der Konfiguration der Hydrogel-Visualisierung. Setzen Sie dann das Hydrogel und die Petrischale auf den Bühneneinsatz und platzieren Sie es auf der Bühne.

Füllen Sie anschließend die Petrischale mit mindestens fünf Millilitern destilliertem Wasser und senken Sie das Wasserimmersionsziel auf knapp über das Hydrogel, ohne es zu berühren. Klicken Sie nun auf Live, um die Argon-Laserlinie einzuschalten. Konzentrieren Sie sich dann auf das Hydrogel, bis das Eosin-Y-Signal auf der Oberseite des Hydrogels zu sehen ist.

Um das Hydrogel leichter zu finden, versuchen Sie, die prozentuale Leistung oder die Lochblendengröße vorübergehend zu erhöhen. Markieren Sie die Positionen der Ober- und Unterseite des Hydrogels sowie der Unterseite der Vertiefung. Bewege dich dann mit dem Joystick quer und finde die Kanten des Brunnens.

Senken Sie im Fokusfenster die Fokusebene innerhalb des Hydrogels um 150 Mikrometer nach unten, indem Sie den Abwärtspfeil neben dem Z-Positionsfeld verwenden. Der nächste Schritt ist entscheidend. Setzen Sie die X- und Y-Position im Bühnenfenster auf Null, löschen Sie dann alle anderen markierten Positionen und markieren Sie nur die auf Null gesetzte Position.

Um nun mit der Bildung eines Einlasskanals zu beginnen, fangen Sie zuerst ein Bild und umreißen Sie dann mit der Rechteckschaltfläche im Fenster "Regionen" den Bereich, der der Einlass zum Gefäßnetzwerk sein wird. Wechseln Sie dann zur Konfiguration der Kanalbildung. Einzelheiten finden Sie im Textprotokoll.

Klicken Sie dort in einem Z-Stapelfenster auf die mittleren Schaltflächen oben und über dem Versatz, um den Z-Stapel an der aktuellen Position zu zentrieren. Je nachdem, wie groß der Einlass sein muss, stellen Sie dann die Anzahl der Schichten im Abstand von eins ein. Überprüfen Sie nun, ob die Geschwindigkeit auf drei und die prozentuale Leistung auf 100 eingestellt ist.

Fahren Sie dann mit dem Speichern der Konfiguration fort und klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten. Um das Hydrogel während der Degradation des Kanals zu visualisieren, erhöhen Sie entweder den Gain-Master im Kanalfenster, wenn der Bereich im Sichtfeld schwarz ist, oder verringern Sie den Gain-Master, wenn der Bereich weiß ist. Stellen Sie nach der Degradation sicher, dass der Einlass gebildet wurde, indem Sie zur Hydrogel-Visualisierungskonfiguration zurückkehren und auf Live klicken.

Laden Sie zunächst im Fenster "Regionen" eine beliebige OVL-Datei aus dem Z-Stapel der virtuellen Masken und klicken Sie auf die Pfeilschaltfläche, um die ROIs im Sichtfeld anzuzeigen. Klicken Sie dann auf Live, um die Visualisierungskonfiguration des Hydrogels zu scannen, und verwenden Sie den Joystick oder das Tischfenster, um das Hydrogel so zu positionieren, dass der Einlass mit der richtigen Stelle innerhalb des Gefäßnetzwerks verbunden ist. Legen Sie als Nächstes die Fokusebene auf die erste Position im Mikroskopmakro ab, die 50 Mikrometer von der vorherigen zentrierten Z-Position entfernt ist, indem Sie die Schrittweite im Fokusfenster verwenden und auf den Pfeil nach unten klicken.

Auch hier ist es wichtig, die X- und Y-Positionen jetzt erneut auf Null zu setzen, alle anderen markierten Positionen zu löschen und nur diese Position als neuen Nullpunkt zu markieren. Stellen Sie sicher, dass Sie diese neue Konfiguration speichern. Wählen Sie nun unter der Konfiguration der Kanalbildung nur die Zeitreihen- und Bleichfenster aus.

Öffnen Sie anschließend das Makro und wählen Sie die Registerkarte Speichern. Wählen Sie das zuvor erstellte Rezept aus und klicken Sie auf Anwenden. Achten Sie darauf, dass Sie nicht auf "Speichern" klicken, da sonst das Rezept überschrieben wird.

Nachdem Sie die Einstellungen überprüft haben, speichern Sie die Konfiguration der Kanalbildung erneut und klicken Sie dann im Mikroskopmakro auf Aktualisieren. Klicken Sie auf Nein, um die aktuelle Speicherortliste zu überschreiben, und klicken Sie dann im Mikroskopmakro auf Start, um das Rezept zu starten. Nachdem der Abbauprozess abgeschlossen ist, verwenden Sie die Hydrogel-Visualisierungskonfiguration bei geringerer Laserleistung, um die Betrachtung von FITC-markiertem Dextran zu ermöglichen, das ein helleres Signal als das native Eosin-Y-Signal des Hydrogels aufweist.

Bevor Sie das fluoreszenzmarkierte Dextran einführen, saugen Sie etwas Wasser aus der Vertiefung in das Hydrogel. Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter gefiltertes, FITC-markiertes Dextran hinein. Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um eine große Menge an mikrovaskulären Bildern in eine Reihe von virtuellen Masken für die bildgesteuerte mikrofluidische Netzwerkbildung umzuwandeln.

Das resultierende mikrofluidische Netzwerk wurde mit dem in vivo Gefäßsystem verglichen, aus dem es abgeleitet wurde. Die bildgesteuerte laserbasierte Hydrogeldegradation ermöglichte die Herstellung biomimetischer mikrofluidischer 3D-Netzwerke, die die Größe, Tortuosität und komplexe Architektur von in vivo Gefäßen rekapitulieren. Sowohl Druckköpfe als auch Spritzenpumpen wurden verwendet, um den Flüssigkeitsfluss in diesen eingebetteten mikrofluidischen Netzwerken zu initiieren.

Es wurde beobachtet, dass sich fluoreszenzmarkierte 70-Kilodalton-Dextran- und 10-Mikron-Polystyrolkügelchen durch eine durch den Druckkopf induzierte Strömung von links nach rechts bewegten. Alternativ wurde die spritzenpumpengetriebene Strömung durch Photopolymerisation eines Hydrogels innerhalb einer sekundären mikrofluidischen Vorrichtung initiiert. Unter Verwendung des gleichen hier beschriebenen Protokolls wurde dann die laserbasierte Degradation implementiert, um ein 2D-vaskuläres abgeleitetes Netzwerk in einem untergebrachten Hydrogel für den spritzenpumpengetriebenen Fluss und die Profusion von 65 Kilodalton Dextran herzustellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop verwenden, das mit einem Femtosekundenpulslaser ausgestattet ist, um biomimetische mikrofluidische Netzwerke mit bildgeführter laserbasierter Hydrogeldegradation zu erzeugen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Laserparameter, einschließlich Leistung, Wellenlänge und Scangeschwindigkeit, angepasst und optimiert werden müssen, je nachdem, wie die Hydrogelformulierung abgebaut wird.

Vielen Dank und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.