Name: Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als In Vivo Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Lernen Sie eine effiziente in vivo Methode zur Charakterisierung von Signalwegen und genregulatorischen Netzwerken in einfachen Organismen. Diese Technik liefert wertvolle Erkenntnisse für die Entwicklungsbiologie.

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Wir danken Dr. Robert Angerer für seine sorgfältige Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts. Das NIH R15HD088272-01 sowie das Office of Research and Development und das Department of Biological Sciences der Mississippi State University unterstützten RCR bei diesem Projekt.

1. Hoher Durchsatz Morpholino Design Strategy <ol><li> Identifizieren eines Gens (e) von Interesse (zB Kandidatengen - Ansatz, cis-regulatorische Analyse, RNA-Seq und / oder Proteom - Differential - Bildschirme). </li><li> Verwenden Sie genomischen, Transkriptom und Genexpressionsdaten auf häufig aktualisierte Webseiten (zB SpBase http://www.echinobase.org 20 und S. purpuratus Genom suchen http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html), um festzustellen, dass der Raum-Zeit-Expressionsprofil überlappt sich mit dem Entwicklungsmechanismus in Frage. Wenn kein Ausdruckdaten verfügbar ist, dann erzeugen qPCR Primer und / oder ein Antisense - in - situ - Sonde , die die Genexpressionsmuster zu beurteilen. </li><li> Nach der räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster zu bestimmen, erhalten von den genomischen Websites die DNA-Sequenz. <ol><li> Zur Erzeugung von Morpholino-Oligonukleotide Translation-blocking, erhalten Sequenz of die 5 &#39;un-translatierte Region (5&#39; - UTR) direkt stromaufwärts vom Initiationscodon von exprimierten Sequenz - Tag (EST) der verfügbaren Datenbanken auf SpBase oder S. purpuratus Genom Search Websites. Wenn diese Informationen für das Gen von Interesse nicht verfügbar ist, führen Sie dann 5 &#39;RACE. </li><li> So entwerfen Sie einen Spleiß-Blocking - Morpholino, suchen Sie nach der genomischen Sequenz einschließlich der Exons und Introns mit dem Gerüst blastn- Werkzeug in SpBase oder S. purpuratus Genom Search Tool. </li></ol></li><li> Verwenden Sie das Oligonukleotid-Design Website http://oligodesign.gene-tools.com, um die gewünschte 25-Basenpaar-Morpholino-Sequenz zu entwerfen. <ol><li> Für eine translatorische blockierungs Morpholino, verwenden, um die mRNA-Sequenz von 5 &#39;zu 3&#39; als Quelle der Translationszielsequenz. Fügen Sie die UTR-Sequenz 5 &#39;(ca. 70 Nukleotide stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle) plus 25 Basen der kodierenden Region (hinter der Startstelle) mit dem Start-Codon markierten with Klammer (ATG). </li><li> Für eine Spleiß-blocking Morpholino, wählen Intron-Exon oder Exon-Intron-Grenze-Sequenz und umfassen 50 Basen (25 Basen von Exon-Sequenz und 25 Basen von Intron-Sequenz) um die Grenzbereiche. Scannen des Genoms mit dem Morpholino-Sequenz zu überprüfen, ob die Sequenz einzigartig ist. </li></ol></li></ol> 2. Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden <ol><li> Bereiten Sie 3 mM Stammlösungen der Morpholino-Oligonukleotide durch Zugabe von 100 ul Nuklease-freies Wasser in die 300 nmol Morpholino Fläschchen. HINWEIS: Verwenden Sie nicht DEPC behandeltem Wasser für die Wieder Suspension verwenden, da Diethylpyrocarbonat die Morpholino beschädigen können. </li><li> Zum ersten Rekonstitution Spin-Down das Fläschchen mit dem Lager-Oligonukleotid-Lösung für 30 s bei voller Geschwindigkeit, die (14.000 - 16.000 · g), kurz Wirbel, Wärme bei 65 ° C für 5 bis 10 min, kurz Wirbel, und halten Sie die Morpholino Lager bei Raum Temperatur für mindestens 1 h. Morpholino-Stammlösung<html> s werden von -20 ° C bis + 4 ° C gelagert. </li><li> Bereiten Injektionslösung morpholino Oligonukleotiden in der gewünschten Konzentration enthält. Diese Lösung enthält in der Regel 20% Glycerin oder 125 mM KCl als Trägerstoff und 15% FITC-Dextran (Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran 10.000 MW 2,5 mg / &amp; mgr; l Vorratslösung). FITC-Dextran und anderen fluoreszierenden Dextran-Konjugate werden routinemäßig zur Identifizierung injizierten Embryonen durch Epifluoreszenzmikroskopie verwendet. Store Injektionslösungen bei -20 ° C. </li><li> Erhitzen Sie das Morpholino-Lösung bei 65 ° C in einem Heizblock oder Wasserbad für mindestens 2 - 5 min. </li><li> Kurz Spin für 30 s bei voller Geschwindigkeit die Morpholino-Lösung (14.000 - 16.000 xg), Wirbel für 1 min und Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (14.000 - 16.000 · g) für mindestens 10 min. </li><li> Laden Sie die Injektionsnadeln mit der Morpholino-Lösung. Für eine detaillierte Mikroinjektionsprotokoll finden Sie unter Stepicheva und Song, 2014 21 und Prost und Ettensohn 2004&quot;&gt; 22. </li></ol> 3. Fixierung und In - Situ - Protokoll bei 24 h nach der Befruchtung (HPF) in S. purpuratus Embry Hinweis: Dieses Protokoll von Arenas-Mena et al modifiziert wird. 2000 23 und Sethi et al. 2014 24. <ol><li> Fixierung <ol><li> Fügen Sie einige Tropfen Fixierungsmittel (siehe unten) zu Vertiefungen, die Embryonen vorsichtig mischen durch Pipettieren, und es ihnen ermöglichen, zu begleichen. Entfernen Sie die Fixierungslösung, und dann Embryonen mischen mit zwei zusätzlichen 180 ul Waschungen von Fixiermittel. Hinweis: Während der Wäschen durch sanftes Auf- und Abpipettieren mehrmals Es ist wichtig, gründlich die Embryonen mischen. Geschieht dies nicht , kann das Signal - Rausch - Verhältnis zu senken. </li><li> Lassen Sie die Embryonen in der zweiten Fixierungsmittel waschen zu fixieren für 50 min bis 1 h bei Raumtemperatur (RT) in 4% Elektronenmikroskopie Klasse Paraformaldehyd, bestehend aus 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20 und künstliche seawater (ASW). Machen Sie diese Lösung jedes Mal für die besten Ergebnisse frisch. Zusätzlich zur einfachen und Praktikabilität Embryonen werden in Platten mit 96 Vertiefungen fixiert. <ol><li> Für 20 ml Fixiermittel Verwendung 5 ml 16% Paraformaldehyd, 15 ml ASW, 200 &amp; mgr; l 1 M MOPS pH 7,0, und 20 &amp; mgr; l Tween-20. </li></ol></li><li> Waschen 5mal bei RT mit 180 &amp; mgr; l MOPS-Waschpuffer von 0,1 M MOPS pH 7,0, bestehend, 0,5 M NaCl und 0,1% Tween-20 für mindestens 5 min oder bis Embryonen bis zum Boden des Bohrlochs fallen. Auch hier ist es wichtig, dass die Embryonen in die Waschpuffer durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mehrmals gründlich zu mischen. MOPS Waschpuffer kann für 2 Tage verwendet werden, wenn bei 4 gespeichert ° C. <ol><li> Für 40 ml waschen MOPS - Puffer Gebrauch 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH 2 O und 40 ul Tween-20. </li><li> Fest Embryonen für 2 Tage bei 4ºC gelagert werden. HINWEIS: Wenn fixierte Embryonen länger speichern, dann mit 0,2% Natriumazid in MOPS-Puffer waschen Bakterienwachstum zu verhindern.</li></ol></li></ol></li><li> Vorhybridisierung <ol><li> Absaugen MOPS Waschpuffer und 180 ul einer 2 hinzuzufügen: 1-Verhältnis von MOPS waschen, um Hybridisierungspuffer Puffer, mischen Embryonen in die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals, und Inkubation mindestens 20 min bei RT. Hybridisierungspuffer besteht aus 70% Formamid, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA und 0,1% Tween-20. <ol><li> Für 40 ml Hybridisierungspuffer Verwendung 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH 2 O, 0,04 g BSA und 40 ul Tween-20. Gut mischen durch Vortexen, fügen Sie 28 ml Formamid und Wirbel wieder. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die 2: 1-Verhältnis von MOPS waschen und Hybridisierungspuffer und fügen 180 ul einer 1: 2-Verhältnis von MOPS-Puffer waschen, um Hybridisierungspuffer, mischen Embryonen in die Lösung und Inkubation für mindestens 20 min bei RT. </li><li> Vor sanft Sondenhybridisierung Embryonen mischen in 100-150 ul Hybridisierungspuffer. Inkubieren Embryonen bei 50 ° C für mindestens 1h. HINWEIS: Inkubieren Embryonen über Nacht akzeptabel ist. Vor der Inkubation dichten die Vertiefungen mit einer Klebefolie um ein Verdampfen zu verhindern. </li></ol></li><li> Hybridisation <ol><li> 0,3 ng / &amp; mgr; l-Sonde und 500 ug / ml Hefe-tRNA in Hybridisierungspuffer, dann Wirbel sanft Sonde Lösung zu schaffen - in einem separaten Röhrchen 0,1 hinzuzufügen. Hefe-tRNA wird an die Sondenlösung hinzugefügt des anti-sense Sondenbindungs ​​unspezifische zu verringern. Vorzuwärmen, diese Lösung auf 50 ° C und absaugen Hybridisierungspuffer. </li><li> Mischungs vorhybridisiert Embryonen in 100 &amp; mgr; l der Sondenlösung, Abdichten mit einer Klebefolie und hybridisieren bei 50 ° C für 2 bis 7 Tage , je nach der Sonde (die foxq2 Sonde kann für 2 Tage inkubiert werden). HINWEIS: Die Inkubationszeiten variiert die Sonde basiert. Einige Gene auf einem niedrigen Niveau exprimiert benötigen bis zu einer 7-tägigen Inkubation. 96-Well-Platten können in einer feuchten Box als Versicherung gegen Verdunstung, wenn die Klebs platziert werdenive Blatt nicht richtig abdichten. </li><li> Waschen 5 mal bei 50 ° C mit 180 &amp; mgr; l frisch zubereiteter MOPS-Waschpuffer für insgesamt 3 h. Dann wird 3x waschen (15 min) mit 180 &amp; mgr; l MOPS-Waschpuffer bei RT. Denken Sie daran, Embryonen in die Wäsche zu mischen jedes Mal Puffer durch mehrmals vorsichtig pipettieren. </li></ol></li><li> Antikörperinkubation <ol><li> Absaugen MOPS Waschpuffer und mischen Embryonen in 180 &amp; mgr; l der Blockierung über Nacht Puffer, bestehend aus 10% normalem Schafserum und 5 mg / ml BSA in MOPS Waschpuffer und Inkubation für mindestens 45 min bei RT oder 4 ° C. </li><li> Entfernen Blocking-Puffer und dann Embryonen Mischung in einen Blockierungspuffer, enthaltend 1: 1.500-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase konjugierten anti-Digoxigenin-Antikörper, verdünnt in Blockierungspuffer. Inkubieren über Nacht bei RT in einem verschlossenen Platte Verdunstung zu vermeiden. HINWEIS: Lassen Sie keine Antikörper auf mehr als über Nacht. </li><li> Waschen Embryonen 6-mal (5 min oder bis Embryonen fallen) in MOPS-Waschpuffer bei RT. Embryonenwerden über Nacht bei 4 ° C gelagert. </li></ol></li><li> In - situ - Entwicklung <ol><li> Waschen Embryonen 3 mal (10 min) bei RT mit frisch pH 9,5 - Puffer, bestehend aus 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2, 1 mM Levamisol und 0,1% Tween-20. <ol><li> 20 ml pH 9,5 - Puffer verwendet 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 &amp; mgr; l 5M NaCl, 1 ml 1 M MgCl 2, 20 &amp; mgr; l Tween-20, 16,6 ml dH 2 O und 0,0048 g Levamisol. </li></ol></li><li> Inkubieren Embryonen bei 37 ° C in Färbepuffers vor Licht geschützt. Färbepuffer besteht aus 10% Dimethylformamid, 4,5 &amp; mgr; l / ml 4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 3,5 ul / ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) in frisch pH 9,5-Puffer, . <ol><li> Für 1 ml Färbepuffers verwenden 100 ul Dimethylformamid, 4,5 ul NBT und 3,5 ul BCIP. </li></ol></li><li> Stoppen Sie die alkalische Phosphatase-Reaktion von 3 bis 5 Mal in MOPS Waschen Waschpuffer. Die Reaktion with die foxq2 Sonde dauert in der Regel 30 min bis 1 h. Einige Sonden benötigen Inkubation über Nacht bei entweder RT oder bei 4 ° C. </li><li> Mischen Sie Embryonen in eine Lösung von 70% MOPS waschen und 30% Glycerin. Das Glycerin stellt einen Brechungsindex, die für die Mikroskopie. Embryos können in dieser Lösung für mehrere Wochen gelagert werden. Verschließen Sie die Platten mit Kunststoff-Paraffin Verdunstung zu verhindern. </li></ol></li><li> Slide Vorbereitung und Bilderfassung <ol><li> Vorbereitung einer Folie durch drei kleine Streifen des doppelseitigen Klebebandes in ein Dreieck mit kleinen Lücken zwischen den Streifen auf einem Objektträger angeordnet werden. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen in der 70% MOPS waschen und 30% Glycerin-Lösung in die Mitte des Dreiecks und die Abdeckung mit einem Deckglas. </li><li> Deckglasränder durch eine Schicht von Auftragen von Nagellack um die Ränder des Deckglases. </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern eine Verbindung Lichtmikroskop mit einem 20x-Objektiv mit und einer angeschlossenen Kamera. </li></ol></li></ol>

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<li>Rottinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signals+guide+migration+of+mesenchymal+cells%2C+control+skeletal+morphogenesis+%5Bcorrected%5D+and+regulate+gastrulation+during+sea+urchin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development.</a> Development. 135, 353-365 (2008).</li>
<li>Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+requires+motile+cilia+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin.</a> Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).</li>
<li>Technau, U., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cnidaria.+Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology.</a> Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).</li>
<li>Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Wnt-Nodal+Signals+Regulate+the+Patterning+of+Anterior+Neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm.</a> PLoS Genet. 12, e1006001(2016).</li>
<li>Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+BMP2%2F4+signaling+organizes+the+oral-aboral+axis+of+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo.</a> Dev Cell. 6, 397-410 (2004).</li>
<li>Bradham, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+neural+but+not+axial+development+in+sea+urchin+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos.</a> Dev Biol. 328, 221-233 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Methodik präsentiert hier ist ein Beispiel, das die Macht der Verwendung von Embryonen mit weniger genomischen und morphologische Komplexität als Wirbeltiere zeigt die Signalübertragungswege und KNS Regierungs grundlegenden Entwicklungsmechanismen .. Viele Labors verwenden ähnliche Tests während der frühen Seeigel Entwicklung zu verstehen, die zu sezieren Signalisierung in anderen Zellschicksal Spezifikation Ereignisse beteiligt Wege (zB Notch, Igel, TGF - β und FGF - Signalisierung) ...

Gene regulatorische Netzwerke (KNS) und Signaltransduktionswege schaffen die räumliche und zeitliche Expression von Genen während der embryonalen Entwicklung, die verwendet werden, um die erwachsenen tierischen Körper Plan zu bauen. Zell-Zell-Signalwege sind wesentliche Bestandteile dieser regulatorischen Netzwerke, die Bereitstellung der Mittel, durch die Zellen in Verbindung stehen. Diese zellulären Interaktionen etablieren und die Expression von regulatorischen und Differenzierung Gene in und zwischen den verschiedenen Gebieten während der Embryonalentwicklung 1, 2 zu verfeinern. Wechselwirkungen zwischen sezerniert extrazellulären Modulatoren (Liganden, Antagonisten), Rezeptoren und Co-Rezeptoren steuern die Aktivitäten von Signaltransduktionswegen. Eine Auswahl von intrazellulären Molekülen wandelt diese Eingänge in veränderter Genexpression, Abteilung führt, und / oder die Form einer Zelle. Während viele der Schlüsselmoleküle bei den extrazellulären und intrazellulären Spiegel in den Hauptwegen verwendet werden,bekannt ist, ist es eine unvollständige Kenntnis der Komplexität der einzelnen Signalwege zu einem großen Teil. Zusätzlich interagieren verschiedene Signalwege oft miteinander entweder positiv oder negativ auf den extrazellulären, intrazellulären und Transkriptionsebenen 3, 4, 5, 6. Wichtig ist , dass die Kernkomponenten von Signaltransduktionswegen hoch in allen metazoan Spezies konserviert, und bemerkenswert, führen die meisten der wichtigsten Signalwege oft ähnliche Entwicklungsfunktionen in vielen Arten , wenn Organismen von eng verwandten Stämmen insbesondere 7, 8, 9 zu vergleichen, 10, 11. Die Studie der während der Entwicklung Signalgebung ist eine schwierige Aufgabe in jedem Organismus, undmehrere bedeutende Herausforderungen zu studieren Signalwege in den meisten Deuterostomia Modelle (Vertebraten, Invertebraten Chordaten , Kiemenlochtiere und Echinoderme): 1) In Vertebraten gibt es eine große Anzahl von möglichen Liganden und Rezeptor / Co-Modulator - Wechselwirkungen, die intrazelluläre Transduktion Moleküle sowie mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Signalwegen aufgrund der Komplexität des Genoms 12, 13, 14; 2) Die komplexe Morphologie und morphogenetische Bewegungen bei Wirbeltieren oft erschweren funktionelle Interaktionen in und unter Signaltransduktionswege zu interpretieren; 3) Die Analysen in den meisten Nicht-echinoderm invertebrate Deuterostomia Modellarten werden durch kurze Fenster von gravidity mit Ausnahme einiger tunicate Arten 15, 16 begrenzt. DasSeeigel embryo hat einige der oben erwähnten Beschränkungen und bietet viele einzigartige Eigenschaften für eine detaillierte Analyse von Signaltransduktionswegen in vivo durchgeführt wird . Dazu gehören die folgenden: 1) Die relative Einfachheit des Genoms Seeigel reduziert signifikant die Anzahl der möglichen Ligand, Rezeptor / Co-Rezeptor und intrazellulären Transduktion Molekül - Wechselwirkungen 17; 2) Die KNS die Spezifikation und die Strukturierung der Keimblätter und die wichtigsten embryonalen Achsen steuern gut in Seeigel - Embryonen etabliert, in dem Verständnis der regulatorischen Kontext der Zelle / Gebiet Beihilfe Empfangen der Signale 18, 19; 3) Viele Signaltransduktionswege können zwischen frühen Spaltung und Gastrula Stadien untersucht werden , wenn Embryonen von einem einschichtigen Epithel , deren Morphologie bestehen ist einfacher zu analysieren; 4) Die Moleküle beinhaltend in Bahnen in den Seeigeln Signalisierung leicht manipuliert werden; 5) Viele Seeigel sind für 10 bis 11 Monate im Jahr (zB Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus trächtig). Hier präsentieren wir eine Methode, um systematisch und effizient Komponenten der Signalwege zu charakterisieren, die angeben, und das Muster Gebiete in Seeigel-Embryonen, die Vorteile zu verdeutlichen, dass mehrere wirbellosen Modellsysteme in der Studie von komplexen molekularen Mechanismen bieten.

<table><tbody><tr><td>Translationsblockierendes Morpholino und/oder Spleißblocker Morpholino</td><td>Gene Tools LLC</td><td>Customized</td><td>Weitere Informationen unter www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (Dextran Fluorescein isothiocyanat)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Herstellung von 25 mg/ml Stammlösung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% Lösung EM</td><td>Grade Electron Mikroskopie Wissenschaften</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Hefe tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Digoxigenin-Antikörper</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisolhydrochlorid (Levamisol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall Corp</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat</td><td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT)</td><td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

die kraft der einfachheit: seeigel embry als<em&gt; in vivo</em&gt; entwicklungsmodelle für komplexe zell-zu-zell-signalnetzwerk wechselwirkungen studieren

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Bemerkenswert wenige Zell-zu-Zell-Signaltransduktionswege sind während der Embryonalentwicklung notwendig, um die große Vielfalt an Zelltypen und Geweben in der adulten Körperform zu erzeugen. Dennoch werden jedes Jahr mehr Komponenten einzelner Signalwege entdeckt, und Studien deuten darauf hin, dass es je nach Kontext eine signifikante Wechselwirkung zwischen den meisten dieser Signalwege gibt. Diese Komplexität macht die Untersuchung der Zell-zu-Zell-Signalübertragung in jedem in vivo Entwicklungsmodellsystem zu einer schwierigen Aufgabe. Darüber hinaus sind effiziente Funktionsanalysen erforderlich, um Moleküle zu charakterisieren, die mit Signalwegen assoziiert sind, die aus den großen Datensätzen identifiziert wurden, die von Differential-Screens der nächsten Generation generiert wurden. Hier veranschaulichen wir eine einfache Methode zur effizienten Identifizierung von Komponenten von Signaltransduktionswegen, die das Zellschicksal und die Achsenspezifikation in Seeigelembryonen steuern. Die genomische und morphologische Einfachheit von Embryonen, die denen des Seeigels ähneln, machen sie zu leistungsfähigen In-vivo-Entwicklungsmodellen für das Verständnis komplexer Signalinteraktionen. Die hier beschriebene Methodik kann als Vorlage für die Identifizierung neuartiger Signaltransduktionsmoleküle in einzelnen Signalwegen sowie der Wechselwirkungen zwischen den Molekülen in den verschiedenen Signalwegen in vielen anderen Organismen verwendet werden.

Im Seeigel Embryo wir haben gezeigt , dass drei verschiedene Wnt - Signalzweige (Wnt / β-Catenin, Wnt / JNK und Wnt / PKC) 4, 25 interact ein Wnt - Signalnetzwerk zu bilden , die von vorne nach hinten (AP) Strukturierung regelt. Eine der wichtigsten Folgen dieser Signalisierungsereignisse besteht darin , dass die anfängliche breit ausgedrückt anterioren Neuroektoderm (ANE) GRN auf ein kleines Gebiet um den vorderen Pol durch den ...

Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache In - vivo - Methodik , die verwendet werden können , um systematisch und effizient Komponenten komplexer Signalwege und regulatorische Netzwerke in vielen wirbellosen Embryonen zu charakterisieren.

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em&gt; In Vivo</em&gt; Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Experimente besteht darin, die Vorteile zu veranschaulichen, die einfache Organismen bei der Untersuchung komplexer Wechselwirkungen zwischen genregulatorischen Netzwerken bieten, die Entwicklungsprozesse steuern. Diese Methodik kann helfen, zentrale Fragen der Evolutions- und Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie Signalwege die Zellschicksalsbestimmung entlang der Hauptachsen des Embryos bei Metazoen steuern. Einer der Hauptvorteile dieser Methodik ist, dass sie zur effizienten Charakterisierung der Signalwege und der genregulatorischen Netzwerke eingesetzt werden kann, die sie in einem in-vivo-Entwicklungskontext aktivieren. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Marina Martinez-Bartolomé übernehmen.

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Dieser Artikel beschreibt ein Gewebetransplantation Technik, die entwickelt, um die Signal-und Strukturierungs-Eigenschaften der Oberfläche cephalica Ektoderm während kraniofazialen Entwicklung Test war.

Die Beurteilung Signaling Eigenschaften von ektodermale Epithel Während Craniofacial Entwicklung

Wir beschreiben hier eine überarbeitete Protokoll für die groß angelegte Kultur von embryonalen C. elegans-Zellen. Embryonale C. elegans in vitro kultivierte Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens scheinen in einer zellspezifischen Weise zu differenzieren und zu rekapitulieren, die Expression von Genen. Techniken, die direkten Zugriff auf die Zellen oder Isolierung von spezifischen Zelltypen aus den anderen Geweben erfordern kann auf C angewendet werden elegans kultivierten Zellen.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

Mikroinjektion ist eine übliche Technik zur Herstellung von DNA-Konstrukten, mRNAs, Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden oder anderen Behandlungen in Eier, Embryonen und Zellen verschiedener Spezies liefern.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von Patiria Minata Zygotes

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um Aggregate von embryonalen Stammzellen der Maus zu erzeugen, die eine Selbstorganisation, Symmetriebrechung und Verlängerung parallel zur axialen Entwicklung aufweisen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung axialer Entwicklungsprozesse und die Erzeugung von Zelltypen, die sonst in Monolayer-Kulturen nur schwer durchzuführen sind.

Generation von Aggregaten von embryonalen Stammzellen der Maus, die Symmetriebrechung, Polarisation und Emergent Collective Verhalten anzeigen<em&gt; In-vitro-</em

In Xenopus-Embryonen sind Zellen aus dem Dach des Blastocoels pluripotent und können so programmiert werden, dass sie verschiedene Gewebe erzeugen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Verwendung von amphibischen Blastocoel-Dachexplantaten als Assay-System, um in vivo und in vitro wichtige Merkmale der frühen neuronalen Entwicklung zu untersuchen.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen, indem Zebrafischembryonen in einem in vivo-System zusammen mit einem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) basierenden genetisch kodierten Spannungsindikator (GEVI) verwendet werden, der selektiv in dem interessierenden Zelltyp exprimiert wird.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

Gewebekomplexitäten multizellulärer Systeme verwirren die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrazellulären Hinweisen und individuellen zellulären Verhaltensweisen. Hier stellen wir eine Methode vor, um den direkten Zusammenhang zwischen kontaktabhängigen Cues und Divisionsachsen mit C. elegans embryo blastomeres und klebenden Polystyrolperlen zu untersuchen.

In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen

Zebrafisch-Blastoderm-Explantaten werden erzeugt, indem embryonale Zellen aus endogenen Signalzentren innerhalb des frühen Embryos isoliert werden, wodurch relativ naive Zellcluster erzeugt werden, die leicht manipulierbar und ex vivokultiviert werden können. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Herstellung solcher Expflanzen und demonstriert ihren Nutzen, indem er die Rollen für die Knotensignalisierung während der Gastrulation abfragt.

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In dieser Arbeit beschreiben wir eine massenspektrometriebasierte proteomische Charakterisierung von Zelllinien mit bekannten Gewebeschicksalen im Embryo von Xenopus laevis im Wirbeltier.

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Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Lernen Sie eine effiziente in vivo Methode zur Charakterisierung von Signalwegen und genregulatorischen Netzwerken in einfachen Organismen. Diese Technik liefert wertvolle Erkenntnisse für die Entwicklungsbiologie.

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als In Vivo Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren (Video) | JoVE Journal

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als

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