Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, Outer Membrane Vesicles oder OMVs aus Legionella pneumophila auf standardisierte Weise zu reinigen und ihren Einfluss auf die bakterielle Replikation in humanen und murinen Makrophagen zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Forschung an äußeren Membranvesikeln zu beantworten. So kann beispielsweise das standardisierte Verfahren zur OMV-Präparation helfen, deren Einfluss auf die Wirt-Erreger-Interaktion zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein standardisiertes Protokoll zur Untersuchung der Auswirkungen von Legionella pneumophila OMVs auf menschliche oder murine Makrophagen liefern wird, was unser Verständnis der Pathogenität von Legionella pneumophila verbessern wird. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir über das mögliche entzündungsfördernde Potenzial von OMVs nachdachten und darüber, wie dies den Infektionsverlauf beeinflussen könnte, da OMVs sowohl innerhalb der Wirtszelle als auch extrazellulär von Legionellen freigesetzt werden. Das Verfahren wird von Kerstin Hoffmann, einer Technikerin aus meinem Labor, und Analina Young, einer Postdoktorandin, demonstriert.

Zu Beginn wird der L.pneumophila-Stamm Core B unter sterilen Bedingungen auf BCYE-Agarplatten verteilt und drei Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Verwenden Sie die L.pneumophila aus einer Vorkulturplatte, um 10 Milliliter YEB-Medien bei einem OD600 von 0,3 zu beimpfen und die Bakterien sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf einem rotierenden Schüttler zu inkubieren. Überprüfen Sie die Reinheit der Flüssigkultur, indem Sie 100 Mikroliter der Suspension auf eine Blutagarplatte verteilen.

Inkubieren Sie die Blut-Agar-Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Die restliche Flüssigkultur wird in 90 Milliliter frisches YEB-Medium gegeben und die Kultur auf einem rotierenden Schüttler inkubiert, bis sie einen OD600 von 3,0 bis 3,5 erreicht. Zentrifugieren Sie die Flüssigkultur bei 4.000 g für 20 Minuten, um die Bakterien zu pelletieren.

Übertragen Sie dann den Überstand in frische Zentrifugenröhrchen. Entsorgen Sie die Bakterienpellets und zentrifugieren Sie die Proben erneut, bevor Sie den Zentrifugationsschritt erneut wiederholen. Anschließend den restlichen Überstand zweimal mit dem Filter sterilisieren.

Anschließend wird der bakterienfreie Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen umgefüllt und die Proben bei 100.000 g bei vier Grad Celsius drei Stunden lang geschleudert. Dekantieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Verwenden Sie dann steriles PBS, um die OMV Pellets zu resuspendieren und zu poolen.

Wiederholen Sie den Ultrazentrifugationsschritt, um kontaminierende Proteine und freies LPS zu entfernen. Entsorgen Sie nun den Überstand und trocknen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit einem sterilen Wattestäbchen. Resuspendieren Sie das OMV Pellet mit 500 Mikrolitern sterilem PBS.

Streichen Sie dann jeweils 20 Mikroliter auf Blutagar- und BCYE-Agarplatten, um eine bakterielle Kontamination des vorbereiteten Vesikels auszuschließen. Inkubieren Sie die Blut-Agar-Platte über Nacht und die BCYE-Agar-Platte drei Tage lang. Verwenden Sie den BCYE-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Proteinmenge für das erhaltene OMV-Präparat zu quantifizieren.

Nach der Differenzierung der THP-1-Zellen in Makrophagen gemäß dem Textprotokoll wird das Differenzierungsmedium mit 500 Mikrolitern frischem Medium ausgetauscht und die Zellen weitere 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert. Um THP-1- oder murine BMDM-Zellen mit OMVs zu behandeln, tauen Sie zuvor vorbereitete OMVs auf und geben Sie die entsprechende Menge in die Zellen. Inkubieren Sie die Makrophagen mit OMVs bei 37 Grad Celsius für mindestens 20 Stunden, um vorbehandelte oder unbehandelte THP-1-Zellen mit Wildtyp-L.pneumophila-Stamm Core B oder murine BMDM-Zellen mit einer flagellenlosen Mutante dieses Stammes zu infizieren, ohne das Medium aus den Zellen zu verändern.

Fügen Sie Bakterien mit einem MOI von 0,5 hinzu, was eins mal 10 bis zur fünften L.pneumophila pro Vertiefung entspricht. Inkubieren Sie die Kulturen für 24 bzw. 48 Stunden. Um die Zellen zu lysieren, fügen Sie Saponin in einer Endkonzentration von 0,1 % hinzu und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang.

Anschließend werden die lysierten Makrophagen durch Pipettieren resuspendiert und die Suspension in ein Reaktionsgefäß überführt. Verwenden Sie steriles PBS, um serielle Verdünnungen der L.pneumophila-Suspension herzustellen. Streichen Sie dann 50 Mikroliter der erforderlichen Verdünnungen auf BCYE-Agarplatten und inkubieren Sie die Platten drei Tage lang.

Zählen Sie die gebildeten Kolonien visuell mit dem Auge und führen Sie Berechnungen gemäß dem Textprotokoll durch. In diesem Experiment, in dem das proinflammatorische Potenzial von L.pneumophila OMVs untersucht wurde, reagierten PMA-differenzierte THP-1-Zellen mit einem zeit- und dosisabhängigen Anstieg der IL-8- und IL-6-Sekretion. In dieser Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Toll-like-Rezeptoren auf die OMV-Erkennung von L.pneumophila in murinen BMDMs mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund mit Hilfe eines CXCL-1 ELISA-Assays analysiert.

Maus-BMDMs aus Wildtyp-Mäusen sezernierten CXCL-1 nach OMV-Stimulation, während murine BMDMs aus TLR2/4-Doppel-Knockout-Mäusen signifikant weniger sezernierten. Um den Einfluss von L.pneumophila OMVs auf die bakterielle Replikation in THP-1-Makrophagen zu untersuchen, wurden die Zellen 20 Stunden lang mit OMVs vorinkubiert und dann zusätzlich mit L.pneumophila infiziert. Die Vorstimulation von THP-1-abgeleiteten Makrophagen reduziert zunächst nach 24 Stunden nach der Infektion die bakterielle Replikationsdosis in Abhängigkeit von der Bakterienreplikation, während sie zu einem späteren Zeitpunkt zu einer Verdopplung der KBE-Zahl führt.

Wie in diesem Experiment gezeigt, führt die Prästimulation von murinen BMDMs mit OMVs zu einer zehnfachen Erhöhung der KBE in murinen BMDM von Wildtyp-Tieren, während TLR2-Knockout- und TRIF/MyD88-Makrophagen diese Zunahme der L.pneumophila-Replikation nach OMV-Vorinkubation nicht zeigen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten und die gereinigten OMVs auf bakterielle Kontamination zu überprüfen. Andernfalls liefert die nachgelagerte Analyse keine schlüssigen Ergebnisse.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Nanopartikel-Tracking-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. welche Legionellen-Mutante mehr oder weniger OMVs produziert oder um den Einfluss verschiedener Stressbedingungen auf die Sekretion von OMVs zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der OMV Forschung, um den Einfluss von OMVs auf Wirt-Pathogen-Interaktionen in vitro und dann in vivo zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man OMVs reinigt und wie man mit der Analyse ihrer Wirkung auf die nachfolgende Infektion von Makrophagen beginnt.

Dieses Protokoll kann dann auf verschiedene gramnegative Bakterien und ihre jeweilige Wirtszelle angewendet werden, nachdem die Inkubations- und Wachstumszeiten angepasst wurden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Legionella pneumophila für den Menschen extrem ansteckend sein kann, daher sollte die Arbeit immer unter einer sterilen Bank durchgeführt werden, während Sie mit Legionellen umgehen und dieses Verfahren durchführen.