Name: Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie die standardisierte Isolierung von Outer Membrane Vesikeln aus Legionella pneumophila und deren pro-inflammatorische Wirkung auf Makrophagen. Diese Methode verbessert das Verständnis bakterieller Pathogenität.

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Wir danken Prof. Dr. Markus Schnare für uns mit TLR2 Bereitstellung - / - und TLR2 / 4 - / - Mäuse und Prof. Dr. Carsten Kirschning für TRIF / MyD88 - / - Mäusen. (: - FKZ 0316175B, e bio miRSys: e Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/) Teile dieser Arbeit von Bundesministerium für Bildung und Forschung gefördert wurde, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) und Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), alle BS.

1. Bereiten Sie Medium und Agar-Platten <ol><li> Bereiten Sie 1 l Brühe-Medium (YEB). Man löst 10 g ACES und 10 g Hefeextrakt in 900 ml destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9 mit KOH (5 N). 10 ml L-Cystein (0,4 g in 10 ml destilliertem Wasser) und 10 ml Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g in 10 ml destilliertem Wasser). Füllen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser und filtern Sie die Lösung (Porengröße: 0,22 &amp; mgr; m) zu sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie gepufferte Kohle Hefeextrakt (BCYE) Agarplatten. Man löst 10 g ACES und 10 g Hefeextrakt in 900 ml destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,9 mit KOH (5 N). Werden 15 g Agar und 2,5 g Aktivkohle. Füllen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser und Autoklaven. <ol><li> 10 ml L-Cystein (0,4 g in 10 ml destilliertem Wasser) und 10 ml Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0,25 g in 10 ml destilliertem Wasser, sterilisiert sowohl durch Filtration durch 0,22 um -Poren) zu kühl BCYE (ca. 50 ° C). Gießen Platten und lagern bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Pflegen L. pneumophila <ol><li> Verbreiten Sie L. pneumophila - Stamm Corby (Wildtyp, WT) auf BCYE Agar - Platten und inkubieren bei 37 ° C für 3 Tage. Beimpfen von 10 ml YEB bei einer OD 600 von 0,3 mit L. pneumophila aus der Vorkultur Platte; brüten die Bakterien bei 37 ° C auf einem rotierenden Schüttler (150 rpm) für 6 h. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit der Flüssigkeit Kultur durch auf einer Blut-Agar-Platte 100 &amp; mgr; l der Suspension zu verbreiten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Das restliche flüssige Kultur zu 90 ml frischem YEB - Medium und Inkubation auf einem rotierenden Schüttler (37 &amp; deg ; C und 150 rpm) , um eine OD 600 von 3,0-3,5 zu erreichen , die etwa 16-20 h erfolgt. </li></ol> 3. Bereiten Sie und Quantifizieren L. pneumophila OMVs HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Zentrifugationsschritts unter sterilen Bedingungen und bei 4 ° C. <ol><li> Zentrifugieren Sie die Flüssigkultur bei 4000 × g für 20 min um die Bakterien zu pelletieren. Den Überstand an die frische Zentrifugenröhrchen, entsorgen Sie das Bakterienpellet, und wiederholen Sie die Zentrifugation (4000 × g für 20 min). Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. </li><li> Sterile-Filter der verbleibende Überstand zweimal (Porengröße: 0,22 &amp; mgr; m). Übertragen Sie die bakterienfreien Überstand zu Ultrazentrifuge Rohre und Ultrazentrifuge bei 100.000 × g für 3 h. </li><li> Den Überstand abgießen und entsorgen. Resuspendieren OMV Pellet in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Ultrazentrifuge (100.000 × g für 3 h) und kontaminierende Proteine ​​LPS zu entfernen. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren OMV Pellet in 500 ul sterilem PBS. Streak 20 &amp; mgr; l auf einer Blut-Agar-Platte und auf einer BCYE Agarplatte bakterielle Kontamination der hergestellten Vesikel auszuschließen. Inkubieren Sie die Blut-Agar-Platte über Nacht und die BCYE Agar-Platte für 3 Tage (beide bei 376; C). </li><li> Quantifizierung der Proteinmenge aus der OMV Präparat erhalten eine Bicinchoninsäure Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die Konzentration von 100 ml L. pneumophila Kultur liegt normalerweise bei 1 ug / ul. Speichern Sie die vorbereitet und quantifizierten OMVs bei -20 ° C. </li></ol> 4. vorzubehandeln Makrophagen <ol><li> Bereiten THP-1-Zellen. HINWEIS: THP-1 ist eine monozytische Zelllinie von einem Leukämiepatienten abgeleitet. <ol><li> Hinzufügen 2x10 5 THP-1 Zellen pro 24 Vertiefungen und zu differenzieren , sie durch Zugabe von 20 nM Phorbol - 12-Myristat - 13-acetat (PMA) in Makrophagen-ähnliche Zellen. Inkubieren für 24 h bei 37 ° C. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit 500 &amp; mgr; l frisches Medium und Inkubation für weitere 24 h; das optimale Medium für die THP-1-Zellen besteht aus hoch RPMI 1640 Glucose mit 10% fötalem Kälberserum besteht. </li></ol></li><li> Isolierung der Maus-Knochenmark stammenden Makrophagen (mBMDM), wie beschrieben in SieheENCE 20. </li><li> Behandeln Sie THP-1-abgeleiteten Makrophagen oder mBMDM mit OMVs. <ol><li> Auftauen die OMVs hergestellt in Schritt 3 und fügen sie entsprechend ihrer Proteinmenge (0,1, 1 und 10 ug / ml) auf die menschliche oder murine Makrophagen. Inkubieren der Makrophagen mit OMVs bei 37 ° C für mindestens 20 h. Verwenden Sie den Überstand für ELISA oder bewegen Sie sich mit Schritt 5. </li></ol></li></ol> 5. Infect die Makrophagen und Beurteilen Bakterienreplikation mit einer Kolonie bildende Einheit (CFU) Assay <ol><li> Verwenden L. pneumophila aus Schritt 2.1 vorbehandelten THP-1 - Zellen oder mBMDM aus Schritt 4.3 und nicht Makrophagen als Kontrollen vorbehandelt (2x10 5/24 wells). Sie nicht das Medium austauschen. </li><li> Infect THP-1 - Zellen mit L. pneumophila Corby WT und mBMDM mit einem Flagellin-fehlt - Mutante von L. pneumophila Corby (beide mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,5; 1x10 5 L. pneumophila / 24 wells) und Inkubation für 24 und 48 h, respectively. bereiten Sie both L. pneumophila Corby (WT oder Flagellin-fehlt - Mutante) , wie in Schritt 2.1 beschrieben. </li><li> Lysieren die Zellen in ihrem Medium durch Zugabe von Saponin (Endkonzentration: 0,1%) und für 5 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Resuspendieren der Bakterien durch Pipettieren und übertragen die Suspension in ein Reaktionsgefäß. Bereiten serielle Verdünnungen der L. pneumophila -haltigen Medien in sterile PBS. </li><li> Streak 50 &amp; mgr; l der erforderlichen Verdünnungen auf Agarplatten BCYE und für 3 Tage bei 37 ° C inkubieren. </li><li> zählen visuell die gebildeten Kolonien. Berechnen Sie die CFU <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" /> Normalisieren der CFU Zählergebnis nicht vorbehandelt, aber infizierten Makrophagen, die auf 100% eingestellt werden. </li></ol>

<ol><li>Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+delivery+of+effector+proteins+into+eukaryotic+cells+by+bacterial+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems.</a> Traffic. 7 (8), 929-939 (2006).</li>
<li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (1), 81-94 (2010).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J Bacteriol. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes Dev. 19 (22), 2645-2655 (2005).</li>
<li>Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dentilisin+in+Treponema+denticola+epithelial+cell+layer+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration.</a> Res Microbiol. 154 (9), 637-643 (2003).</li>
<li>Kolling, G. L., Matthews, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+virulence+genes+and+Shiga+toxin+by+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7.</a> Appl Environ Microbiol. 65 (5), 1843-1848 (1999).</li>
<li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> J Biol Chem. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li>
<li>Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+capture+and+detection+of+Borrelia+burgdorferi+antigens+in+urine%2C+blood%2C+or+tissues+from+infected+ticks%2C+mice%2C+dogs%2C+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans.</a> J Clin Microbiol. 29 (6), 1162-1170 (1991).</li>
<li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li>
<li>Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+vesicles+target+toxin+delivery+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells.</a> EMBO J. 23 (23), 4538-4549 (2004).</li>
<li>Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+protozoa+by+Legionella+pneumophila+and+its+role+in+bacterial+ecology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).</li>
<li>Winn, W. C., Myerowitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+the+Legionella+pneumonias.+A+review+of+74+cases+and+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature.</a> Hum Pathol. 12 (5), 401-422 (1981).</li>
<li>Ge, J., Shao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+vesicular+trafficking+and+innate+immune+defence+by+Legionella+Dot%2FIcm+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors.</a> Cell Microbiol. 13 (12), 1870-1880 (2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+shed+by+Legionella+pneumophila+inhibit+fusion+of+phagosomes+with+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes.</a> Infect Immun. 74 (6), 3285-3295 (2006).</li>
<li>Galka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+the+whole+secretome+of+Legionella+pneumophila+and+functional+analysis+of+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles.</a> Infect Immun. 76 (5), 1825-1836 (2008).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+tissue+explants+reveal+novel+interactions+during+Legionella+pneumophila+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections.</a> Infect Immun. 82 (1), 275-285 (2014).</li>
<li>Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+produced+outer+membrane+vesicles+from+Pseudomonas+aeruginosa+elicit+a+potent+innate+immune+response+via+combined+sensing+of+both+lipopolysaccharide+and+protein+components%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components.</a> Infect Immun. 78 (9), 3822-3831 (2010).</li>
<li>Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+Legionella+pneumophila+outer+membrane+vesicles+with+eukaryotic+membrane+systems+is+a+mechanism+to+deliver+pathogen+factors+to+host+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes.</a> Cell Microbiol. , (2014).</li>
<li>Jung, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila-Derived+Outer+Membrane+Vesicles+Promote+Bacterial+Replication+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (4), (2016).</li>
<li>Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+of+Clostridium+perfringens+type+A+strains+induce+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity.</a> Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 431-443 (2014).</li>
<li>Whitmire, W. M., Garon, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+nonspecific+responses+of+murine+B+cells+to+membrane+blebs+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 61 (4), 1460-1467 (1993).</li>
<li>Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicles+modulate+proliferation+and+interleukin-8+production+by+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells.</a> Infect Immun. 71 (10), 5670-5675 (2003).</li>
<li>Jager, J., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+outer+membrane+vesicles+shed+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila.</a> Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).</li>
<li>Park, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Casson, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspase-4+mediates+noncanonical+inflammasome+activation+against+gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6688-6693 (2015).</li>
<li>Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+of+the+Legionella+pneumophila+flagellar+regulon+contribute+to+multiple+virulence+traits%2C+including+lysosome+avoidance+and+macrophage+death%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death.</a> Infect Immun. 73 (9), 5720-5734 (2005).</li>
<li>Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MavN+is+a+Legionella+pneumophila+vacuole-associated+protein+required+for+efficient+iron+acquisition+during+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (37), 5208-5217 (2015).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+cytosolic+RpsL+by+macrophages+induces+lysosomal+cell+death+and+termination+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection.</a> PLoS Pathog. 11 (3), 1004704(2015).</li>
<li>Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+preparations+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles.</a> Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).</li>
<li>Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+outer+membrane+vesicle+production+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 195 (13), 2971-2981 (2013).</li>
<li>Klimentova, J., Stulik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).</li>
<li>Novartis.com. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause">https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause</a> (2016).</li>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die OMVs von bakteriellen Krankheitserregern und die Auswirkungen dieser Membranbläschen auf ihre Zielzellen derzeit intensiv untersucht. Zum Beispiel perfringens Clostridium abgeleitetes OMVs Zytokinsekretion in Makrophagen induzieren, können B - Lymphozyten durch OMVs von Borrelia burgdorferi aktiviert werden, und Helicobacter pylori -released Membranvesikel auf Magenepithelzellen 21 wirken kann, 22, 23. L. pneumophila, ein intrazellulärer Erreger , die eine schwere Form der atypischen Lungenentzündung auslösen kann, gibt auch OMVs die in der Lage sind zu Lungenepithelzellen und Makrophagen 16, 19 aktivieren. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Klein Isolierung von L. pneumophila OMVs aus Flüssigkultur , die potentielle Rolle von OMVs bei Pneumonie zu studieren. Es ist wichtig, unter sterilen condit arbeitenIonen und Verunreinigungen von anderen Bakterien , um auszuschließen , ein reines L. pneumophila - abgeleitetes OMV - Zubereitung zu erhalten. Die Isolierung von OMVs umfaßt einen Filtrationsschritt durch 0,22 &amp; mgr; m-Poren, um die Verunreinigung des erhaltenen OMV Pellet mit L. pneumophila zu verhindern, obwohl dies die OMV Ausbeute reduziert, da die größten OMVs von diesem Filtrationsschritt verloren gehen. Weiterhin testeten wir die Reaktion von humanen und murinen Makrophagen zu diesen isoliert Vesikeln und infizierten Zellen mit L. pneumophila zu enger die Situation in Legionellen Pneumonie approximieren, wobei OMVs durch extrazelluläre Bakterien innerhalb des LCV 15 freigesetzt werden. Die verwendeten OMV Dosen wurden in einer in vitro - Infektion von humanen Makrophagen nach 24 h Inkubation (beschrieben in Referenz 20) nach dem freien OMV Menge geschätzt. Zur Stimulation der anderen Empfängerzellen oder in vivo Experimenten,andere OMV Dosen erforderlich sein und müssen festgelegt werden. Die Analyse der Wirkung von L. pneumophila OMVs stellt eine Weiterentwicklung des Protokolls durch Jager und Steinert 24 beschrieben. Hier PMA-differenzierten THP-1-Zellen als Modell für die Alveolarmakrophagen aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von primären humanen Material dienen. Die Zugabe von PMA unterscheidet die monozytische THP-1 - Zellen in Makrophagen-ähnliche Zellen 25. Darüber hinaus sind sie ein bekanntes Modell - Zelllinie für L. pneumophila 26 Studien. Neben dieser humanen monozytären Zelllinie werden mBMDM Zellen verwendet. mBMDM sind weit verbreitet für die Untersuchung der Wirkungen von L. pneumophila 27, 28, 29 angenommen. Die Möglichkeit der Verwendung von genetischen Vorprägungen für verschiedene TLRs oder andere Proteine ​​machen sie ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der OMV-Effekte. in order die Menge von Mäusen pro Experiment zu senken, mBMDM anstelle von Alveolarmakrophagen aufgrund der Einschränkungen der Makrophagen verwendet. Schlüsselexperimente könnten Alveolarmakrophagen zur Validierung erfordern. Neben dem hier beschriebenen Protokoll Ultrazentrifugation OMVs zu reinigen, ist es möglich , eine Dichtegradientenzentrifugation durchzuführen, die in dem Protokoll , das von Chutkan et al enthalten ist. 30. Dies könnte auch die Reinheit des erhaltenen OMV Herstellung zu verbessern und die Menge an co-gereinigten Proteinaggregate, Flagellin und LPS reduzieren. Die Reinheit des erhaltenen OMV Zubereitung kann durch Transmissionselektronenmikroskopie oder durch Nanopartikel Verfolgungsanalyse als Ergänzungsschritt in der Qualitätskontrolle ausgewertet werden. Dies kann ein zusätzliches Mittel zur Quantifizierung liefern, über die Proteinmessverfahren vorgestellt. Gegebenenfalls können die LPS-Konzentration von einem Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test analysiert. Wenn die OMV Ausbeute gering ist, einzusätzliche Konzentrationsschritt über zentrifugale Filter könnten durchgeführt werden, die hier nicht geschehen ist. Wenn die Ausbeute war niedriger als erwartet, wurden die OMVs verworfen. Im Rahmen der laufenden Bemühungen um die biologischen Mechanismen und Funktionen hinter OMVs, der Einfluss verschiedener Stressbedingungen auf OMV Produktion getestet werden konnte aufzuklären. Nährstoffmangel, Veränderungen der Inkubationstemperatur oder Exposition gegenüber schädlichen Substanzen könnten einen Einfluss auf OMV Sekretion 31 haben. Mögliche Stressbedingungen sind im Protokoll von Klimentova und Stulik 32 diskutiert. Außerdem könnte Hyper- oder hypovesiculating L. pneumophila - Mutanten erzeugt werden. Die verschiedenen Präparationen OMV könnte dann mit Makrophagen, humanen Lungengewebe - Explantaten (beschrieben in Referenz 17) oder auch in in vivo - Modellen in Infektionsexperimenten untersucht werden. Neben der Rolle von OMVs in angeborenen Immun-Signalisierung, ihren Einfluss in der bakteriellen Kommunikationkann experimentell adressiert werden. Weiterhin ist die Wirkung der verschiedenen angeborenen Immunsignalkaskaden könnte durch die Verwendung von Maus-Knockout-Zellen oder die Erzeugung von CRISPR / Cas9 Vorprägungen in menschlichen Zelllinien analysiert werden. Diese Grundlagenforschung in OMVs wird in die Entwicklung neuer Impfstrategien zu unterstützen, die 33 von Neisseria meningitidis übertragen für Meningitis B bereits vorhanden sind . Ausgehend von dem Protokoll über die OMV Isolierung und Charakterisierung kann man dies auf andere gramnegative Bakterien anzuwenden und zu anderen Wirtszellen; es braucht nur auf das Wachstum der Bakterien in Flüssigkultur angepasst werden. Das Protokoll von Chutkan et al. detaillierte Informationen auf der Erzeugung von OMVs aus Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa 30. Die Kultur sollte nicht die späten stationären Phase erreichen, um Erhöhungen der lysierten Bakterien und verunreinigende Proteine ​​und mem zu vermeidenbranes. Darüber hinaus muss die OMV Dosis zur Stimulation der Wirtszellen nach der Menge der OMVs vorhanden während der in vivo - Infektionen bestimmt werden, während immer noch eine niedrige Cytotoxizität zu gewährleisten. Auf diese Weise wird die pathologische Rolle von OMVs, deren Auswirkungen auf die Interspezies-Kommunikation und Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht werden konnte. Um die Rolle von L. pneumophila OMVs bei Pneumonie, standardisierte OMV Präparate mit ausreichenden Ausbeuten und vergleichbare Infektionsversuchen untersuchen benötigt. Dieses Protokoll hilft Isolierungsverfahren zu standardisieren und OMV Studien auf andere Gram-negative Bakterien und anderen Wirtszellen zu verlängern. Darüber hinaus wird die Forschung in vitro Wissen aus der detaillierten profitieren, die verwendet werden können Experimente in vivo - Einstellungen zu verlängern. In Zukunft könnte dieses Protokoll zur Isolierung von OMVs aus primären biologischen Material, wie etwa Serum oder bronchoalveoläre lav verlängert werdenAlter Flüssigkeit, Einblick in die Zusammensetzung von OMVs unter physiologischen Bedingungen freigesetzt zu gewinnen. Dies wird helfen , Schlüsselparameter der OMV - Zusammensetzung zu bestimmen , und die Eigenschaften des in vitro -generated OMVs zu verstehen.

<html> Bakterien können sich 1 Virulenzfaktoren über verschiedene Mechanismen absondern. Neben den bekannten sekretorischen Systemen, Gram-negative Bakterien können Informationen austauschen und Virulenzfaktoren über äußere Membranvesikel (OMVs) liefern, die klein sind, Sphäroid Vesikel 10-300 nm im Durchmesser und mit einer doppelschichtigen Membranstruktur. Sie sind in einer Vielzahl von Wachstumsumgebungen (Flüssigkultur, Festkultur und Biofilme) und in allen Wachstumsphasen 2, 3 sezerniert. OMVs ein wichtiges Beförderungsmittel (beispielsweise für Proteine, Adhäsine, Toxine und Enzyme sowie für LPS, die auf der Oberfläche gefunden wird OMV) 4. Der intraluminale Ladung wird vor proteolytischem Abbau geschützt ist , so ist es möglich , über große Entfernungen zu wirken, und die Vesikel können 5, 6 in Körperflüssigkeiten und entfernten Organen gefunden werden,&quot;xref&quot;&gt; 7, 8. Sie können nicht nur von eukaryotischen Zellen 9, 10 erkannt und aufgenommen werden, sondern darüber hinaus, sie sind in der Lage , die Bindung von Bakterien und deren Invasion in Wirtszellen 4 zu erleichtern. Legionella pneumophila (L. pneumophila) ist ein Gram-negatives Bakterium , das OMVs freigeben kann. In der menschlichen Lunge, die er infiziert , in erster Linie Alveolarmakrophagen, obwohl seine natürliche Wirt sind Süßwasser Amöben 11. Eine Infektion L. pneumophila kann Legionärskrankheit, eine schwere Form der Lungenentzündung 12 verursachen. Es blockiert phagosome-Lysosomen-Fusion in der Wirtszelle. Sie akquiriert auch Host - Organellen, wodurch eine Replikation Nische, die Legionellen -haltigen Vakuole (LCV), 13, 14 gebildet. Lysosomalen Abbau gehemmt wird nicht nur durch die Effektor-Protein translocation über das Sekretionssystem vom Typ IV, aber auch durch die Freisetzung von OMVs 15. Die Reinigung von OMVs aus Bakterienkulturen erforderlich ist ihre Wirkung auf Empfängerzellen zu analysieren. Frühere Studien über den Proteingehalt von OMVs L. pneumophila fokussiert und auf den Einfluss der Vesikel auf Alveolarepithelzellen 16, aber spätere Studien mit menschlichen Lungengewebetransplantate zeigten , daß L. pneumophila OMVs durch Alveolarmakrophagen 17 aufgenommen. Als OMVs vorhanden pathogen-associated molecular Muster (PAMPs) und andere bakterielle Antigene, sie könnten einen Einfluss auf die Infektion eukaryontischer Zellen sind und die Immunantwort des Wirts 18 modulieren. L. pneumophila OMVs verschmelzen schnell mit Wirtszellmembranen und sie darüber hinaus aktivieren die membranöse TLR2 19. Wie es , dass L. pneumoph bekanntila OMVs 16 Makrophagen und Epithelzellen in einer pro-inflammatorischen Weise stimulieren, 17, analysierten wir die Auswirkungen von OMVs auf den Infektionsprozess in humanen und murinen Makrophagen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Kultivierung von L. pneumophila in flüssiger Kultur das sekretierte OMVs durch differentielle Ultrazentrifugation zu isolieren und um die Auswirkungen der Vesikel auf eukaryotischen Wirtszellen zu bewerten, die entweder direkt oder einer Infektion nach.

<table><tbody><tr><td>10 cm</td><td>Petrischale Sarstedt AG & Co KG (Nümbrecht, Deutschland)</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter Incorporation (Kalifornien, USA)</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>9138.2</td><td></td></tr><tr><td>Aktivkohle</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>X865.2</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>5210.2</td><td></td></tr><tr><td>Columbia-Agar mit 5 % Schafsblut</td><td>Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Deutschland</td><td>)254005</td><td></td></tr><tr><td>Küvetten</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nümbrecht, Deutschland)</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (Mensch)</td><td>BD OptEIA&Handel;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Deutschland)</td><td>IL-8: 555244 IL-6: 550799</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (murin)</td><td>DuoSet, R& D (Minneapolis, USA)</td><td>CXCL1: DY453-05</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3x9H2O</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Deutschland)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)</td><td>40830469</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Impfschlaufe&nbsp;</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nümbrecht, Deutschland)</td><td>86.1567.010</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>6751.1</td><td></td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby</td><td>---</td><td>---</td><td>freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Antje Flieger (RKI, Berlin, Deutschland)</td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby & Delta; flaA</td><td>---</td><td>---</td><td>mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlin, Deutschland)</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mBMDM</td><td></td>---<td>---</td><td>freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland) und Prof. Dr. Carsten Kirschning (Universität Duisburg Essen, Essen, Deutschland)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom GmbH (Berlin, Deutschland)</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland)</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr><tr><td>rotierender Schüttler (MaxQ 6000)</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 high glucose</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Deutschland)</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>9622.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10</td><td>Biochrom Ltd (Cambridge, England)</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>Sterilfilter (Porengröße: 0,22 &micro; m)</td><td>Corning Incorporated (New York, USA)</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland)</td><td>88081201-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Discovery 100 SE</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific Deutschland BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

legionella pneumophila der äußeren membran - vesikeln: isolierung und analyse ihrer pro-inflammatorische potential auf makrophagen

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bakterien sind in der Lage, eine Vielzahl von Molekülen über verschiedene sekretorische Systeme abzusondern. Neben der Sekretion von Molekülen in den extrazellulären Raum oder direkt in eine andere Zelle können gramnegative Bakterien auch Vesikel der äußeren Membran (OMVs) bilden. Diese Membranvesikel können ihre Fracht über weite Strecken transportieren, und die Fracht wird durch Proteasen und Nukleasen vor dem Abbau geschützt. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) ist ein intrazellulärer, gramnegativer Erreger, der eine schwere Form der Lungenentzündung verursacht. Beim Menschen infiziert es Alveolarmakrophagen, wo es den lysosomalen Abbau blockiert und eine spezialisierte Replikationsvakuole bildet. Darüber hinaus produziert L. pneumophila OMVs unter verschiedenen Wachstumsbedingungen. Um die Rolle von OMVs im Infektionsprozess menschlicher Makrophagen zu verstehen, haben wir ein Protokoll zur Reinigung von bakteriellen Membranvesikeln aus Flüssigkulturen erstellt. Das Verfahren basiert auf der differentiellen Ultrazentrifugation. Die angereicherten OMVs wurden anschließend hinsichtlich ihrer Protein- und Lipopolysaccharid-Menge (LPS) analysiert und dann für die Behandlung einer humanen monozytären Zelllinie oder von maurischen Makrophagen aus dem Knochenmark verwendet. Die proinflammatorischen Reaktionen dieser Zellen wurden mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay analysiert. Des Weiteren wurden Veränderungen in einer nachfolgenden Infektion analysiert. Zu diesem Zweck wurde die bakterielle Replikation von L. pneumophila in Makrophagen mittels koloniebildender Unit-Assays untersucht. 
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Aufreinigung von L. pneumophila OMVs aus Flüssigkulturen durch Ultrazentrifugation und für die nachgelagerte Analyse ihres proinflammatorischen Potenzials an Makrophagen.

Der Versuchsaufbau L. pneumophila OMVs vorzubereiten und deren Einfluss auf die pro-entzündliche Reaktion der Makrophagen zu analysieren Infektion nach ist in Abbildung 1 dargestellt. Die pro-inflammatorischen Potentials der hergestellten OMVs auf PMA-differenzierten THP-1 - Zellen analysiert werden, die in Abbildung 2 dargestellt ist. THP-1-Zellen reagieren mit einer zeit- und dosisabhängigen Anstieg von IL-8 und IL-6-Sekretion. Zusätzlich kann der Einfluss verschiedener TLR auf L. pneumophila OMV Erkennung durch Verwendung mBMDM aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen untersucht werden, wie 3 durch die CXCL1 ELISA in Abbildung dargestellt. mBMDM von WT - Mäusen sezerniert CXCL1 nach OMV Stimulation, während mBMDM TLR2 / 4 - / - abgesondert deutlich weniger. Um die Auswirkungen von L. pneumophila OMVs auf die bakterielle Replikation in THP-1 Makrophagen zu untersuchen, wurden Zellen mit OMVs vorinkubiert und dann zusätzlich infiziertmit L. pneumophila (Figur 4 A). Die Vorstimulation von THP-1-abgeleiteten Makrophagen verringert zuerst den bakteriellen Replikations nach 24 h Infektion, aber es führt zu einer Verdoppelung in CFU zu dem späteren Zeitpunkt zählen (48 h pi). Die Auswirkungen der Toll-like Rezeptor (TLR) Signalisierung auf OMV Anerkennung nach der Infektion der Makrophagen durch mBMDM beurteilt werden, wie in Abbildung 4 B dargestellt. Bakterielle Replikation erhöht sich um das Zehnfache in mBMDM von WT - Tieren nach OMV Vorinkubation, während TLR2 - / - und TRIF / MyD88 - / - Zellen nicht über diese Erhöhung der L. pneumophila - Replikation zeigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> Abbildung 1: Versuchsdurchführung. (A) L. pneumophila Corby WT von 10 cm BCYE Agarplatten verwendet , um eine kleine Flüssigkeitskultur (10 ml) zu beimpfen, die in 90 ml frischem YEB übertragen wirdMedium nach 6 h. Ein kleines Volumen wird auch auf einem Blut-Agarplatte für Reinheit zu prüfen. Bakterien werden bei 37 ° C bis zur frühen stationären Phase (OD 600 = 3,0-3,5) inkubiert. (B) Die Flüssigkultur wird zentrifugiert und steril filtriert , um die Bakterien zu entfernen. Die Legionellen -freie Überstand wird dann ultrazentrifugiert eine OMV - Pellet zu erhalten, die in PBS resuspendiert und wieder ultrazentrifugiert. Die isolierten Vesikel werden resuspendiert, auf Reinheit überprüft und für die Proteinmenge quantifiziert. Der Maßstab entspricht 2,5 cm. (C) humane oder murine Makrophagen werden mit den quantifizierten OMVs stimuliert. Der Zellkulturüberstand für ELISA verwendet werden, oder Makrophagen mit L. pneumophila infizierten werden bakterielle Replikation durch CFU - Assay auf 10-cm BCYE Agarplatten zu bestimmen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </a&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> Abbildung 2: Pro-inflammatorischen Aktivierung von THP-1 - Zellen von L. pneumophila OMVs. (A) Hierbei ist der monozytären THP-1 - Zelllinie wird als Modell für Alveolarmakrophagen verwendet. PMA-differenzierten THP-1 - Zellen wurden mit steigenden Dosen von L. pneumophila OMVs (0,01-25 ug / ml) für 24 und 48 h behandelt, respectively. Der zellfreie Überstand wurde auf IL-8 ELISA verwendet. Die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten ± SEM gezeigt. THP-1 - Zellen reagierten auf so wenig wie 0,01 ug / ml L. pneumophila OMVs mit signifikanten IL-8 - Sekretion, die zeit- und dosisabhängig war. (B) L. pneumophila OMVs (0,1-10 ug / ml) wurden verwendet , PMA-differenzierten THP-1 - Zellen zu stimulieren. Der Überstand wurde nach 24 und 48 Stunden Inkubation gesammelt, und das freigesetzte IL-6 wurde im Überstand mittels ELISA gemessen. Die Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten ± SEM gezeigt. THP-1-Zellen sezerniert signifikante Mengen an IL-6, auch bei der niedrigsten Dosis von OMVs (0,1 ug / ml). Die Sekretion von IL-6 erhöhte sich mit zunehmender OMV Dosen und mit längerer Inkubationszeiten. Statistik: Mann-Whitney-Test; * P &lt;0,05 und ** p &lt;0,01 im Vergleich zu der entsprechenden 0 &amp; mgr; g / mL OMV. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> Abbildung 3: Das proinflammatorische Aktivierung von Makrophagen hängt von TLR2 / 4. mBMDM von WT und TLR2 / 4 - / - Mäuse wurden mit L. pneumophila OMVs inkubiert (0,1 oder 1 &amp; mgr; g / ml). CXCL1 Sekretion wurde nach 24 und 48 h durch ELISA analysiert, respectively. DasMittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt. mBMDM von WT - Mäusen reagierten mit einer dosisabhängigen CXCL1 Sekretion nach L. pneumophila OMV Inkubation. TLR2 / 4 - / - mBMDM deutlich weniger CXCL1 abgesondert im Vergleich zu WT mBMDM, und das Sekret nicht erhöhen dosisabhängig. Statistik: Mann-Whitney-Test; * P &lt;0,05 im Vergleich zu der entsprechenden 0 &amp; mgr; g / mL OMV; #P &lt;0,05 im Vergleich zu einer gleich WT Probe behandelt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> Abbildung 4: L. pneumophila OMV Vorinkubation erhöht bakterielle Replikation in Makrophagen. (A) Differentiated THP-1 - Zellen wurden mit OMVs vorinkubiert (0,1, 1 oder 10 μ; G / ml) oder LPS / IFN-γ (200 ng / ml für die Kontrolle each) oder wurden unbehandelt gelassen. Nach der Vorinkubation (20 h) wurden THP-1 - Zellen mit L. pneumophila Corby wt (MOI 0,5) für 2, 24 und 48 h infiziert sind. THP-1-Zellen wurden durch die Zugabe von Saponin lysiert und die Bakterien wurden auf BCYE Agarplatten plattiert. KBE wurden nach jedem Zeitpunkt, bezogen auf 0 ug / ml OMV berechnet. Die Balken stellen die Mittelwerte ± SEM von drei unabhängigen Experimenten, die jeweils in technischen Duplikaten durchgeführt. Es gab keine Unterschiede in Bakterienaufnahme (2 h nach der Infektion (pi)) im Vergleich zu nicht vorbehandelten Zellen. Veränderungen in bakteriellen Replikations wurden nach 24 und 48 h bestimmt, respectively. LPS / IFN-γ vorbehandelten THP-1 - Zellen zeigten eine Reduktion in pi bakterielle Belastung 24 h auch dosisabhängig von L. pneumophila OMV vorbehandelten Zellen beobachtet Dies wurde. Zu dem späteren Zeitpunkt (48 h pi), OMV vorbehandelten THP-1 - Zellen zeigte eine Verdoppelung in L. pneumophila redung, während LPS / IFN-γ vorbehandelten Makrophagen zeigte eine weitere Verringerung der Bakterienlast. Statistik: Mann-Whitney-Test; * P &lt;0,05 und ** p &lt;0,01 im Vergleich zu der entsprechenden 0 &amp; mgr; g / mL OMV. (B) mBMDM von Mäusen mit verschiedenen genetischen Hintergründen (WT, TLR2 - / - und das TRIF / MyD88 - / -) wurden mit 0,1 &amp; mgr; g / mL L. pneumophila OMVs für 20 h vorinkubiert und wurden dann mit einem flagellin- infiziert defiziente Mutante von L. pneumophila Corby (MOI 0,5) für 48 h. mBMDM wurden durch die Zugabe von Saponin lysiert und die Legionellen wurden auf BCYE Agarplatten plattiert. Die CFU wurden relativ berechnet auf 0 &amp; mgr; g / mL OMV, durch die durchgezogene Linie angedeutet. Die Balken stellen die Mittelwerte ±± SEM von drei unabhängigen Experimenten, die jeweils in Duplikaten durchgeführt. mBMDM von WT - Mäusen zeigten einen Anstieg der L. pneumophila Replikation nach OMV Vorbehandlung. TLR2 - / - Makrophagen zeigten signifikant reduziert <em&gt; Legionellen - Replikation, die TRIF / MyD88 vergleichbar war - / - mBMDM. Statistik: Mann-Whitney-Test; p &lt;0,05 im Vergleich zur wt-Probe. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier beschreiben wir die Reinigung von Legionella pneumophila (L. pneumophila) , äußere Membranvesikel (OMVs) aus Flüssigkulturen. Diese gereinigten Vesikel werden dann für die Behandlung von Makrophagen verwendet, ihre pro-inflammatorischen Potentials zu analysieren.

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie besteht darin, äußere Membranvesikel (OMVs) von Legionella pneumophila auf standardisierte Weise zu reinigen und ihren Einfluss auf die bakterielle Vermehrung in humanen und murinen Makrophagen zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Forschung zu äußeren Membranvesikeln zu beantworten. Beispielsweise könnte das standardisierte Verfahren zur OMV-Präparation dazu beitragen, deren Wirkung auf die Wirt-Pathogen-Interaktion zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein standardisiertes Protokoll zur Untersuchung der Auswirkungen von OMVs von Legionella pneumophila auf humane oder murine Makrophagen bereitstellt, wodurch unser Verständnis der Pathogenität von Legionella pneumophila verbessert wird. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir über das mögliche proinflammatorische Potenzial von OMVs nachdachten und wie dies den Infektionsverlauf beeinflussen könnte, da OMVs von Legionella sowohl intrazellulär als auch extrazellulär freigesetzt werden. Die Durchführung des Verfahrens wird von Kerstin Hoffmann, einer technischen Assistentin aus meinem Labor, und Analina Young, einer Postdoktorandin, demonstriert.Um zu beginnen, L.pneumophila-Stamm core B unter sterilen Bedingungen auf BCYE-Agarplatten ausstreichen und drei Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie L.pneumophila von einer Vorzuchtplatte, um 10 Milliliter YEB-Medium mit einem OD600 von 0,3 zu beimpfen, und inkubieren Sie die Bakterien sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem rotierenden Schüttelinkubator. Überprüfen Sie die Reinheit der Flüssigkultur, indem Sie 100 Mikroliter der Suspension auf einer Blutagarplatte ausstreichen.Die Blutagarplatte über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die verbleibende Flüssigkultur zu 90 Milliliter frischem YEB-Medium hinzufügen und die Kultur auf einem rotierenden Schüttler inkubieren, bis eine OD600 von 3,0 bis 3,5 erreicht ist. Die Flüssigkultur bei 4.000 g 20 Minuten lang zentrifugieren, um die Bakterien zu pelletieren.Anschließend den Überstand in frische Zentrifugenröhrchen überführen. Die bakteriellen Pellets verwerfen und die Proben erneut zentrifugieren, bevor der Zentrifugationsschritt noch einmal wiederholt wird. Danach den verbleibenden Überstand zweimal filtrieren, um ihn steril zu machen.Anschließend das bakterienfreie Überstand auf ultrazentrifugierfähige Röhrchen überführen und die Proben bei 100.000 g für drei Stunden bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand abgießen und verwerfen. Danach die OMV-Pellets mit steriler PBS resuspendieren und vereinigen.Wiederholen Sie den Ultrazentrifugationsschritt, um verunreinigende Proteine und freie LPS zu entfernen. Entsorgen Sie nun den Überstand und trocknen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen mit einem sterilen Wattestäbchen ab. Resuspendieren Sie das OMV-Pellet mit 500 µL steriler PBS.Anschießend jeweils 20 Mikroliter auf Blutagar- und BCYE-Agar-Platten ausstreichen, um eine bakterielle Kontamination der hergestellten Vesikel auszuschließen. Die Blutagar-Platte über Nacht und die BCYE-Agar-Platte drei Tage lang inkubieren. Den BCYE-Assay gemäß den Herstelleranweisungen verwenden, um die Menge an Protein in der erhaltenen OMV-Präparation zu quantifizieren.Nach der Differenzierung von THP-1-Zellen in Makrophagen gemäß dem Textprotokoll 500 Mikroliter frisches Medium verwenden, um das Differenzierungsmedium zu ersetzen, und die Zellen weitere 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um THP-1- oder murine BMDM-Zellen mit OMVs zu behandeln, zuvor hergestellte OMVs auftauen und die entsprechende Menge zu den Zellen hinzufügen. Die Makrophagen mit OMVs bei 37 Grad Celsius mindestens 20 Stunden lang inkubieren, um vorbehandelte oder unbehandelte THP-1-Zellen mit dem Wildtyp-Stamm core B von L.pneumophila oder murine BMDM-Zellen mit einem flagellenlosen Mutanten dieses Stammes zu infizieren, ohne das Medium der Zellen zu wechseln.Geben Sie Bakterien mit einem MOI von 0,5 hinzu, was 1 × 10⁵ L. pneumophila pro Bohrung entspricht. Inkubieren Sie die Kulturen jeweils 24 und 48 Stunden. Zum Lyse der Zellen Saponin auf eine Endkonzentration von 0,1 % hinzufügen und die Zellen fünf Minuten inkubieren.Resuspendieren Sie dann die lysierten Makrophagen durch Pipettieren und überführen Sie die Suspension in ein Reaktionsgefäß. Bereiten Sie serielle Verdünnungen der L.pneumophila-Suspension mit steriler PBS vor. Streichen Sie anschließend 50 Mikroliter der erforderlichen Verdünnungen auf BCYE-Agarplatten und inkubieren Sie die Platten drei Tage lang.Zählen Sie die entstandenen Kolonien visuell und führen Sie die Berechnungen gemäß dem Textprotokoll durch. In diesem Experiment, bei dem das proinflammatorische Potenzial von L.pneumophila OMVs untersucht wurde, reagierten PMA-differenzierte THP-1-Zellen mit einer zeit- und dosisabhängigen Steigerung der IL-8- und IL-6-Sekretion. Hier wurde der Einfluss verschiedener Toll-ähnlicher Rezeptoren auf die Erkennung von L.pneumophila OMVs in murinen BMDMs mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund mittels eines CXCL-1-ELISA-Assays analysiert.Murine BMDMs von Wildtyp-Mäusen sekretierten CXCL-1 nach OMV-Stimulation, während murine BMDMs von TLR2/4-Doppel-Knockout-Mäusen signifikant weniger sekretierten. Um den Einfluss von L.pneumophila OMVs auf die bakterielle Vermehrung in THP-1-Makrophagen zu untersuchen, wurden die Zellen 20 Stunden lang mit OMVs vorkultiviert und anschließend zusätzlich mit L.pneumophila infiziert. Die Vorstimulation von aus THP-1-Zellen stammenden Makrophagen reduziert die bakterielle Vermehrung dosisabhängig nach 24 Stunden Infektion, führt jedoch zu einem Anstieg der CFU-Zahl auf das Doppelte zu einem späteren Zeitpunkt.Wie in diesem Experiment gezeigt, führt die Vorstimulation muriner BMDMs mit OMVs zu einer zehnfachen Erhöhung der KBE-Zahl in murinen BMDMs aus Wildtyp-Tieren, während TLR2-Knockout- und TRIF/MyD88-Makrophagen diesen Anstieg der L.pneumophila-Replikation nach OMV-Vorinkubation nicht zeigen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sterile Bedingungen einzuhalten und die gereinigten OMVs auf bakterielle Kontaminationen zu überprüfen. Andernfalls liefern die nachgeschalteten Analysen keine aussagekräftigen Ergebnisse.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Nanopartikel-Verfolgungsanalyse angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise, welcher Legionella-Mutant mehr oder weniger OMVs produziert, oder um den Einfluss unterschiedlicher Stressbedingungen auf die Sekretion von OMVs zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der OMV-Forschung den Weg, um die Auswirkungen von OMVs auf die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Erreger zunächst in vitro und anschließend in vivo zu erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie OMVs gereinigt und wie die Analyse ihrer Wirkung auf die nachfolgende Infektion von Makrophagen begonnen werden kann.Dieses Protokoll kann anschließend nach Anpassung der Inkubations- und Wachstumszeiten auf verschiedene gramnegative Bakterien und ihre jeweiligen Wirtszellen angewendet werden. Beachten Sie, dass die Arbeit mit Legionella pneumophila für den Menschen äußerst infektiös sein kann; daher sollte immer unter einer sterilen Arbeitsbank gearbeitet werden, wenn mit Legionella umgegangen wird und dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von...

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

Quelle: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolierung und Analyse ihres entzündungsfördernden Potenzials auf Makrophagen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Vorbehandlung von Makrophagen mit Legionella pneumophila Vesikeln der äußeren Membran (OMVs), um deren Wirkung auf die bakterielle Replikation zu untersuchen. Durch die Veränderung der Immunsignalisierung des Wirts machen OMVs Makrophagen durchlässiger für Infektionen. Höhere Koloniezahlen in...

Assay der Legionella pneumophila-Replikation in Makrophagen, die mit äußeren Membranvesikeln vorbehandelt wurden

Quelle: Jung, A. L. et al. Legionella pneumophila äußere Membranvesikel: Isolierung und Analyse ihres proinflammatorisken Potenzials bei Makrophagen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Isolierung von äußeren Membranvesikeln (OMVs) aus Legionella pneumophila mittels sequentieller Zentrifugation, steriler Filtration und Ultrazentrifugation. Die gereinigten OMVs, angereichert mit Membranproteinen und Lipopolysacchariden, eignen sich für Studien zur Wirts-Pathogen-Interaktion.

Ultrazentrifugationsbasierte Isolierung von Legionella-pneumophila-Außenmembranvesikeln

In diesem Video quantifizieren wir intrazelluläre und extrazelluläre Listeria monocytogenes, ein intrazelluläres pathogenes Bakterium, nach ihrer Infektion von kultivierten Makrophagen in vitro mittels Durchflusszytometrie.

Durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären und emergenten extrazellulären Listeria monocytogenes in vitro

Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Die Larve der Wachsmotte Galleria mellon wurde vor kurzem als ein in vivo Modell, um Legionella pneumophila-Infektion zu studieren etabliert. Hier zeigen wir grundlegende Techniken, die Pathogenese von Legionellen in den Larven charakterisieren, einschließlich Impfung, Messung der bakteriellen Virulenz und Replikation sowie die Extraktion und Analyse von infizierten Blutzellen.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Makrophagen sind seit langem als eine kritische Komponente der angeborenen und erworbenen Immunantworten erkannt. Die jüngste Explosion des Wissens im Zusammenhang mit evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Interaktion zwischen Makrophagen und Mikroben hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit auf Makrophagen erneuert. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Makrophagen aus Knochenmark der Maus zu unterscheiden.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Wir beschreiben beide in vitro und in vivo Infektion-Assays, die verwendet werden können, um die Aktivitäten des Host-Codierung Faktoren zu analysieren.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

Das vorgeschlagene Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann.

Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

Erfahren Sie die standardisierte Isolierung von Outer Membrane Vesikeln aus Legionella pneumophila und deren pro-inflammatorische Wirkung auf Makrophagen. Diese Methode verbessert das Verständnis bakterieller Pathogenität.

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen (Video) | JoVE Journal

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

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