Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für
2. März 2017
Diese Studie stellt eine standardisierte und validierte Methode zur Isolierung und Kultur der primären Maus endometrial Stroma und Epithelzellen, die in einer Co - Kultur - System verwendet werden kann , in vitro decidualization zu studieren.
Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens bestehen darin, primäre murine endometriale, stromale und epitheliale Zellen zu isolieren und kultivieren, um sie anschließend im Rahmen einer Ko-Kultur zur Untersuchung der in-vitro-Dekidualisierung zu verwenden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der reproduktiven Medizin zu beantworten, beispielsweise welche parakrinen Signalwege zwischen epithelialen und stromalen Zellen während wichtiger Prozesse wie der Dekidualisierung und der Trophoblasteninvasion stattfinden und wie diese Signalwege reguliert werden. Mithilfe dieser Techniken kann der Prozess der Dekidualisierung in einem epithelial-stromalen Ko-Kultursystem untersucht werden.
Mithilfe dieses Systems können Sie beurteilen, ob von einer der beiden Zellen sezernierte Signalmoleküle diesen Prozess beeinflussen können. Führen Sie vor der Entnahme des Uterus eine Vaginalabstrichuntersuchung durch, um die Zyklusphasen der Tiere zu überprüfen. Wählen Sie nur Mäuse in der Östrusphase aus.
Charakterisiert durch das Vorhandensein von Hornhaut-Epithelzellen in der Vaginalabspülung. Öffnen Sie anschließend mit Pinzette und Schere den Bauch der ersten im Östrogenstadium befindlichen Versuchstier und schieben Sie die Därme zur Seite, um beide Uterushörner sichtbar zu machen. Greifen Sie eines der Hörner am distalsten Ende unterhalb der Eileiter, und dissezieren Sie das Uterusgewebe mit der anatomischen Pinzette vom Eileiter ab, wobei Sie mit einer Dumont-Pinzette Nummer fünf das Fett- und Bindegewebe entfernen.
Entfernen Sie dann das Horn am distalen Ende oberhalb des Uteruskörpers. Nach dem Entfernen der Uterushörner legen Sie diese in eine 35 Millimeter große Petrischale mit drei Milliliter HBSS. Sobald alle Uterushörner gesammelt wurden, bringen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop und entfernen Sie mit einer Pinzette das restliche Fett- und Bindegewebe.
Öffnen Sie dann mit Dumont-Zange Nummer fünf, Dissektionspinzette und kleinen Scheren die Uterushörner längs, um deren Lumina freizulegen, und spülen Sie das Gewebe in einer neuen Petrischale mit frischem HBSS ab. Überführen Sie anschließend alle Hörner in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das Pancreatin und Trypsin enthält. Inkubieren Sie das Gewebe anschließend 60 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 50 U/min horizontal auf einem Rotationsrührer.
Am Ende der Stunde das Reagenzröhrchen auf den Laborplatz überführen und 45 Minuten lang horizontal ohne Schütteln inkubieren, gefolgt von einer 15-minütigen horizontalen Inkubation ohne Schütteln in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation im Wasserbad vorsichtig den Überstand dekanteren und die Uteri in eine Petrischale mit kaltem Medium für epitheliale Mauszellen des Endometriums überführen, um die Trypsinaktivität für fünf Minuten zu inaktivieren. Danach die Gewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Milliliter kaltem HBSS überführen und die Gewebe 10 Sekunden lang verwirbeln, um die epithelialen Schichten freizusetzen.
Anschließend spülen Sie die Uteri in einer neuen Petrischale mit drei Milliliter frischem HBSS aus und sammeln zwei weitere epitheliale Zellsuspensionen in zwei neuen 15-Milliliter-Röhrchen, wie zuvor gezeigt. Nach dem dritten Vortex des Gewebes überführen Sie die Uteri in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das die Digestionslösung für murine endometriale Stroma-Zellen enthält, und inkubieren für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute. Sammeln Sie die epithelialen Zellblätter, indem Sie die drei Zellsuspensionen vorsichtig durch ein 100-Mikron-Nylon-Sieb pipettieren, um Gewebeabfälle zu entfernen, und zentrifugieren anschließend die resultierende Zellsuspension.
Suspendieren Sie das Pellet in 12 Milliliter Maus-Endometrialepithelzellmedium unter gründlichem Mischen und lassen Sie die Lösung anschließend fünf Minuten lang zur Trennung der verbleibenden Maus-Endometriumstromazellen durch Schwerkraft sedimentieren. Entfernen Sie am Ende der Sedimentation vorsichtig die oberen zwei Milliliter des Überstandes mit einer 5-Milliliter-Pipette und zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen. Suspendieren Sie das Pellet der Maus-Epithelzellen anschließend unter sanftem Pipettieren in Epithelmedium.
Und impfen Sie die Zellen mit der geeigneten Dichte für die geplante nachgeschaltete Analyse auf mit Kollagen beschichtete Deckgläser. Nach der epitelialen Zellisolierung fahren Sie mit den stromalen Zellen fort und nehmen Sie das Verdauungsrohr mit den stromalen Mauszellen und den Uteri aus dem Inkubator. Nach einer 30-minütigen Inkubation, wie gerade demonstriert, schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig per Hand 10 Sekunden lang und überführen die Uteri in eine Petrischale, die drei Milliliter vier Grad Celsius kaltes HBSS enthält.
Spülen Sie die Gewebe gründlich aus, geben Sie dann drei Milliliter Stromazellmedium in das Verdauungsgefäß, um die Trypsinaktivität zu stoppen, und überführen Sie die Uteri in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das drei Milliliter frisches murines endometriales Stromazellmedium enthält. Schütteln Sie das Gefäß mit dem Gewebe vorsichtig für 10 Sekunden. Überführen Sie danach die Uteri in eine Schale mit kaltem HBSS und anschließend in ein neues 15-Milliliter-Gefäß mit Stromazellmedium.
Nach einer dritten Gewebespülung und Übertragung inkubieren Sie das Uterusgewebe in frischer Verdauungslösung für murine endometriale Stromazellen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Verdauung leiten Sie die Zellsuspensionen aus den Röhrchen eins bis drei sowie aus dem Trypsin-Röhrchen durch ein 40-Mikron-Nylon-Filternetz und spülen das Netz mit weiteren fünf Millilitern Medium für murine endometriale Stromazellen. Anschließend sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Und resuspendieren Sie das Pellet in frischem Medium für primäre murine Endometriumstromazellen und geben Sie es auf mit Polylysin beschichteten Deckgläsern in der für die geplante nachgeschaltete Analyse geeigneten Dichte auf. Die Reinheit der primären Zellkulturen kann anhand der Unterschiede in der Expression von Vimentin und Zytokeratin beurteilt werden, da Vimentin in murinen Endometriumstromazellen stark exprimiert wird, in murinen Endometrialepithelzellen hingegen schwach. Zytokeratin hingegen wird in murinen Endometrialepithelzellen stark, in murinen Endometriumstromazellen dagegen schwach exprimiert.
Die Doppelfärbung für Mentin und Zytokeratin verdeutlicht weiterhin die Expression von Mentin durch die Stromazellen sowie die ausschließliche Expression von Zytokeratin durch die epithelialen Zellen. Die Induktion der Dezidualisation in den Stromazellkulturen durch die Applikation von zyklischem Adenosinmonophosphat und MPA zeigt, dass die Prolaktin-mRNA-Spiegel nach fünf Tagen Behandlung im Vergleich zu unbehandelten Kontroll-Stromazellkulturen stark ansteigen. Da die epithelialen Zellen in Seitenkammern von Zellkultur-Inserts schwer sichtbar sind, könnte unmittelbar nach einer fünftägigen Simulation der Dezidualisation ein Vitalitätsnachweis durchgeführt werden, wobei eine Farbänderung von blau nach hellrosa auf das Vorhandensein vitaler epitelialer Zellen hinweist.
Mithilfe dieser Technik können weitere Methoden wie Adhäsionsassays an Blastozysten durchgeführt werden, um zu bewerten, ob von den Epithelzellen in Gegenwart einer Blastozyste sekretierte Faktoren die Dezidualisierung der stromalen Zellen induzieren können.
Übersicht
Diese Studie stellt eine standardisierte und validierte Methode zur Isolierung und Kultur primärer muriner endometrialer Stromazellen und Epithelzellen vor, die in einem Kokultursystem zur Untersuchung der in-vitro-Dekidualisation verwendet werden können.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Reproduktionsmedizin
- Zellkultivierungstechniken
- Endometriobiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der Decidualisation ist entscheidend für die Fortpflanzungsgesundheit.
- Die parakrine Signalübertragung zwischen epithelialen und stromalen Zellen spielt eine Schlüsselrolle bei diesem Prozess.
- Primäre Zellkulturen können Einblicke in diese Signalwege liefern.
- Standardisierte Methoden sind für die Reproduzierbarkeit in der Forschung erforderlich.
Zweck der Studie
- Gewinnung und Kultivierung primärer muriner Endometriumzellen.
- Einrichtung eines Kokultursystems zur Untersuchung der Dezidualisation.
- Untersuchung der an der Dezidualisation beteiligten Signalmechanismen.
Verwendete Methoden
- Vaginalabstrichuntersuchung zur Auswahl von Mäusen in der Östrusphase.
- Präparation und Sammlung der Uterushörner unter sterilen Bedingungen.
- Inkubation mit Pankreatin und Trypsin zur Zell-Dissociation.
- Zellkultur und Reinigung mittels Nylon-Netz und Zentrifugation.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von epithelialen und stromalen Zellen aus dem Mausendometrium.
- Nachweis der Fähigkeit des Kokultursystems, die Dekidualisierung zu untersuchen.
- Beurteilung der Zellreinheit anhand der Expression von Vimentin und Cytokeratin.
- Beobachtete Induktion der Dekidualisierung unter spezifischen Behandlungen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen endometrialer Zellen.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können das Verständnis reproduktiver Prozesse voranbringen.
- Zukünftige Studien können auf diesem Rahmen aufbauen, um weitere Signalwege zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die mechanistische Entschärfung des stromal-epithelialen Kreuzgesprächs im Endometrium in der reproduktiven Medizin, indem sie ein standardisiertes und reproduzierbares System zur Untersuchung der parakrinen Signalübertragung während der Dezidualisation bereitstellt. Sie unterstützt die Validierung von Zielstrukturen und die Entwicklung von Assays für implantationsrelevante Signalwege und bietet einen prädiktiven Wert in präklinischen Modellen der Fertilität sowie der Kommunikation zwischen Embryo und Endometrium. Der Kokulturansatz verbessert die translationale Kontinuität, indem er zelluläre Interaktionen erfasst, die in Monokultursystemen übersehen werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der epithelial-stromalen parakrinen Signalübertragung bei der Dezidualisation und klärt die molekularen Mechanismen der Embryoimplantation.
- Operativer Wert: Liefert reine, vitale primäre Zellpopulationen, deren Reinheit mittels Vimentin- und Zytokeratin-Markern überprüfbar ist, und verringert so biologisches Rauschen bei der Zielstrukturscreening.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Entwicklung von Kokultur-basierten Assays zur Bewertung sekretierter Faktoren (z. B. aus epithelialen Zellen), die die stromale Dekidualisierung modulieren, und ermöglicht die Entschlüsselung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen.
- Operativer Wert: Ein standardisierter Isolationsprotokoll verbessert die Ausbeute und Vitalität und erhöht dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Assays für die Untersuchung von Wirkstoffen oder siRNA-Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert krankheitsrelevante Stroma-Epithel-Kommunikation in einem hormonell vorbereiteten System und entspricht damit der präklinischen Evaluierung von Ursachen für Implantationsversagen.
- Operativer Wert: Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Validierung, indem funktionelle Endpunkte wie die Induktion von Prolaktin-mRNA und Vitalitätsassays analysiert werden können.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Kontinuum von der Entdeckungsbiochemie bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, insbesondere für Zielstrukturen, die stromal-epitheliale Wechselwirkungen bei der uterinen Rezeptivität und der Aufrechterhaltung der frühen Schwangerschaft vermitteln.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich stromaler Dezidualisierungsauslöser und epithelabgeleiteter Signalmoleküle in einem kontrollierten Kokultursystem.
- Screening: Ermöglicht die quantitative Beurteilung von Dezidualisierungsparametern (z. B. Prolaktinausschüttung, morphologische Veränderungen) als Reaktion auf epithelbedingte Medien oder Kandidaten-Modulatoren.
- Analytik: Erzeugt messbare abhängige Variablen wie Genexpressionsänderungen und Veränderungen der Vitalität, wodurch statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen ermöglicht werden.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischer Relevanz, indem hormonprimäre stromale Reaktionen in einem physiologisch kontextualisierten Kokultursystem modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Isolation primärer Zellen für die iterative Untersuchung von Signalwegen und verringert damit die Abhängigkeit von variablen In-vivo-Modellen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen in der Implantationsforschung, indem Variablen in der epithelial-stromalen Kommunikation isoliert werden.
- Operativer Wert: Standardisierte enzymatische Dissoziation und Reinigungsschritte verbessern die Konsistenz zwischen Chargen in verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in Programmen zur Erforschung von Fruchtbarkeitszielen, indem frühzeitige Vorhersagekraft bezüglich stromaler Reaktionsphänotypen bereitgestellt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf deren Fähigkeit, die Dezidualisation in einem humanrelevanten murinen Kokultursystem zu modulieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Dissektion von Primärgewebe, enzymatischer Verdauung und sterilen Zellkultivierungstechniken.
- Setzt den Zugang zu HBSS, Pankreatin, Trypsin, Kollagen- und Polylysin-beschichteten Oberflächen sowie zur Phasenkontrastmikroskopie zur Überwachung voraus.
- Erfordert die Synchronisierung der Mausöstruszyklen mittels Vaginalabstrich, um Gewebehomogenität sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Arten oder hormonelle Bedingungen kann eine Optimierung der Enzymkonzentrationen und Inkubationszeiten erfordern.
- Die Beurteilung der Reinheit mittels Immunfärbung für Vimentin und Zytokeratin fügt einen Validierungsschritt hinzu, wird jedoch durch die Quelle als zuverlässige Methode unterstützt.
