Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für In Vitro decidualization

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre Endometrium-, Stroma- und Epithelzellen der Maus für ihre Co-Kultur für die Untersuchung der In-vitro-Dezidualisierung zu isolieren und zu kultivieren. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Reproduktionsmedizin zu beantworten, z. B. wie hoch der parakrine Signalweg zwischen Epithel- und Stromazellen während wichtiger Prozesse wie Dezidualisierung und Trophoblasteninvasion ist und wie dieser Signalweg reguliert wird. Diese Techniken können verwendet werden, um den Prozess der Dezidualisierung in einem epithelialen und stromalen Co-Kultursystem zu untersuchen.

Mit diesem System können Sie bewerten, ob Signalmoleküle, die von einer der beiden Zellen sezerniert werden, diesen Prozess beeinflussen können. Führen Sie vor der Entnahme der Gebärmutter einen Vaginalabstrich durch, um die Zyklusphasen der Tiere zu überprüfen. Um nur Mäuse in der Brunstphase auszuwählen.

Gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Hornhautepithelzellen in der Vaginalspülung. Als nächstes öffnen Sie mit Pinzette und Schere den Bauch des ersten Brunsttieres und reflektieren den Darm zur Seite, um beide Gebärmutterhörner sichtbar zu machen. Fassen Sie ein Horn am distalsten Ende unter dem Eileiter und präparieren Sie das Gebärmuttergewebe mit einer Präparierzange vom Eileiter und mit einer Dumont-Zange Nummer fünf, um das Fett- und Bindegewebe zu entfernen.

Entfernen Sie dann das Horn am distalen Ende über dem Gebärmutterkörper. Nachdem Sie die Gebärmutterhörner entfernt haben, legen Sie sie in eine 35-Millimeter-Petrischale mit drei Millilitern HBSS. Wenn alle Gebärmutterhörner entnommen wurden, übertragen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop und entfernen Sie mit einer Pinzette das restliche Fett- und Bindegewebe

Öffnen Sie dann mit einer Dumont-Pinzette Nummer fünf, einer Präparierzange und einer kleinen Federschere die Gebärmutterhörner in Längsrichtung, um ihre Lumen freizulegen, und spülen Sie das Gewebe in einer neuen Petrischale mit frischem HBSS ab. Übertragen Sie nun alle Hörner in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das Pankreatin und Trypsin enthält. Und inkubieren Sie das Gewebe 60 Minuten lang horizontal bei vier Grad Celsius und 50 U/min auf einem Orbitalschüttler.

Am Ende der Stunde stellen Sie das Röhrchen für eine 45-minütige horizontale Inkubation ohne Schütteln auf die Bank, gefolgt von einer 15-minütigen horizontalen Inkubation ohne Schütteln in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Am Ende der Inkubation im Wasserbad wird der Überstand vorsichtig dekantiert und die Gebärmutter fünf Minuten lang in eine Petrischale mit kaltem Maus-Endometriumepithelzellmedium überführt, um die Trypsinaktivität zu inaktivieren. Übertragen Sie dann das Gewebe in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern kaltem HBSS und wirbeln Sie das Gewebe 10 Sekunden lang vortexen, um die Epithelschichten freizusetzen.

Spülen Sie dann die Gebärmutter in einer neuen Petrischale, die drei Milliliter frisches HBSS enthält, und sammeln Sie zwei weitere Epithelblattsuspensionen in zwei neuen 15-Milliliter-Röhrchen, wie gerade gezeigt. Nach dem dritten Gewebewirbel wird die Gebärmutter in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit einer Mischung aus endometrialen Stromazellen der Maus für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 200 U/min überführt. Gewinnen Sie die Epithelschichten zurück, indem Sie die drei Zellsuspensionen vorsichtig durch ein 100-Mikron-Nylonnetz pipettieren, um die Gewebetrümmer zu entfernen, gefolgt von einer Zentrifugation der resultierenden Zellsuspension.

Suspendieren Sie das Pellet in 12 Millilitern Endometriumepithelzellmedium der Maus unter gründlichem Mischen und lassen Sie die Lösung dann fünf Minuten lang absetzen, um die verbleibende Endometriumstromazelle der Maus durch die Schwerkraft zu trennen. Am Ende der Sedimentation entfernen Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig die oberen zwei Milliliter des Überstands und zentrifugieren die gesammelten Zellen. Suspendieren Sie dann das Epithelpellet der Maus durch vorsichtiges Pipettieren wieder in Epithelmedium.

Und plattieren Sie die Zellen auf kollagenbeschichtete Deckgläser in der richtigen Dichte für die geplante Downstream-Analyse. Fahren Sie nach der Isolierung der Epithelzellen mit den Stromazellen fort und entfernen Sie den Verdauungsschlauch der Mausstromazellen mit der Gebärmutter aus dem Inkubator. Nach einer 30-minütigen Inkubation, wie gerade gezeigt, schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig 10 Sekunden lang mit der Hand und übertragen Sie die Gebärmutter in eine Petrischale, die drei Milliliter Celsisus HBSS enthält.

Spülen Sie das Gewebe gut aus, geben Sie dann drei Milliliter Stromazellmedium in das Verdauungsröhrchen, um die Trypsinaktivität zu inaktivieren, und übertragen Sie die Gebärmutter in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das drei Milliliter frisches endometriumes Stromazellmedium der Maus enthält. Schütteln Sie die Tube mit dem Taschentuch 10 Sekunden lang sanft. Übertragen Sie dann die Gebärmutter in eine Schale mit kaltem HBSS, gefolgt von der Übertragung in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen mit Stromazellmedium.

Nach einer dritten Gewebespülung und -übertragung inkubieren Sie das Gebärmuttergewebe in einer frischen Mischung aus Endometriumstromazellverdauung der Maus für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende des Aufschlusses passieren Sie die Zellsuspensionen von Röhrchen eins bis drei und das Trypsinröhrchen durch ein 40-Mikron-Nylonnetz und spülen Sie das Netz mit weiteren fünf Millilitern Endometriumstromazellmedium der Maus aus. Sammeln Sie dann die Zellen durch Zentrifugation.

Und suspendieren Sie das Pellet erneut in frischem Endometriumstromazellmedium der Maus zum Plattieren auf Polylysin-beschichteten Deckgläsern in der geeigneten Dichte für die geplante nachgelagerte Analyse. Die Reinheit der primären Zellkulturen kann anhand der Unterschiede in der Vimentin- und Cytokeratin-Expression beurteilt werden, da die Vimentin-Spiegel in endometrialen Stromazellen der Maus hoch und in den endometrialen Epithelzellen der Maus niedrig sind. Während die Cytokeratinspiegel in den Endometriumepithelzellen der Maus hoch und in den endometrialen Stromazellen der Maus niedrig sind.

Die Mentin/Cytokeratin-Doppelfärbung verdeutlicht die Expression des Mentins durch Stromazellen sowie die ausschließliche Expression von Cytokaratin durch die Epithelzellen. Die Induktion der Dezidualisierung in den Stromazellkulturen durch die Anwendung von zyklischem Adenosinmonophosphat und MPA zeigt, dass die Prolaktin-MRNA-Spiegel nach fünftägiger Behandlung im Vergleich zu Kontrollstromazellkulturen dramatisch erhöht sind. Da die Epithelzellen in Seitenzellkultureinsätzen schwer zu visualisieren sind, könnte unmittelbar nach einer fünftägigen Dezidualisierungssimulation ein Viabilitätsassay durchgeführt werden, bei dem eine Farbverschiebung von blau zu hellrosa auf das Vorhandensein lebensfähiger Epithelzellen hinweist.

Im Anschluss an diese Technik können andere Methoden, wie z. B. Blastozystenadhäsionsassays, durchgeführt werden, um zu bewerten, ob Faktoren, die von den Epithelzellen in Gegenwart einer Blastozyste sezerniert werden, eine Dezidualisierung der Stromazellen induzieren können.