Intravitalmikroskopie und Thrombusinduktion im Ohrläppchen eines Hairless Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, den Einfluss potenzieller vasoktiver Wirkstoffe auf die Bildung mikrovaskulärer Thromben in vivo zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Thrombusbildung zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung neuer antithrombotischer Substanzen, die zur Verhinderung der mikrovaskulären Thrombusbildung beitragen könnten – einer der Hauptkomplikationen bei Sepsis und Gewebetransplantation. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass das Ohrmodell der haarlosen Maus die intravitale Fluoreszenzmikroskopie und die phototoxische Thrombusinduktion ohne vorherige chirurgische Präparation des untersuchten mikrovaskulären Bettbereichs ermöglicht.

Beginnen Sie mit dem Wiegen und Notieren des Gewichts der Maus. Danach die geeignete Menge der Testsubstanz in eine Insulinspritze aufziehen. Verabreichen Sie das Medikament 30 Minuten vor der Thrombusinduktion.

Nachdem die Maus 15 Minuten vor der Thrombusinduktion anästhesiert wurde, stellen Sie die Maus bis zum Einsetzen der Anästhesie zurück in den Käfig. Um eine ausreichende Anästhesie zu überprüfen, zwicken Sie mit einer Pinzette in den Schwanz und achten Sie auf das Fehlen einer Reaktion. Danach pipettieren Sie 0,05 ml aufgetauten 50 Dextran in eine Insulinspritze.

Nachdem die Spritze befüllt wurde, sicherstellen, dass keine Luftblasen verbleiben, da selbst kleine Luftblasen, die intravenös verabreicht werden, für das Tier tödlich sein können. Die anästhesierte Maus in Bauchlage auf ein Acrylglas-Tablett mit integrierter Heizplatte legen. Die Heizplatte auf 37 Grad Celsius einstellen.

Bedecken Sie die Hornhäute der Mausaugen mit einem Augenölsalbe. Anschließend setzen Sie zwei Nähte aus Polypropylen 7,0 in den kranialen und kaudalen Rand des rechten Ohres. Platzieren Sie die Nähte so nah wie möglich am Rand und so proximal wie möglich zur Basis.

Bewegen Sie die Maus in eine dorsale Position. Befestigen Sie alle Beine mit einem Klebeverband an der Plattform. Führen Sie eine Naht unter den Vorderzähnen ein und positionieren Sie den Kopf in Dorsalflexion, indem Sie die Naht mit einem Klebeverband an der Plattform befestigen.

Platzieren Sie das Tier auf der Plattform unter dem Stereomikroskop. Verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerung. Für die Mikroskopie des rechten Ohrs bereiten Sie die linke Vena jugularis vor, indem Sie zunächst einen 5 mm langen Schnitt in die Haut des Halses in kraniokaudaler Richtung machen.

Verwenden Sie dann Mikrozangen und Mikroscheren, um das subkutane Gewebe zu dissezieren. Lösen Sie anschließend die Vene von ihrer Adventitia, ohne das Gefäß zu berühren. Verwenden Sie nun die zuvor vorbereitete Insulinspritze zur Injektion des fluoreszierenden Farbstoffs.

Greifen Sie die Gefäßwand vorsichtig mit der Mikrozange, ohne die Vene zu perforieren. Durchstoßen Sie die aufgeblähte Gefäßwand mit der Spritzennadel und injizieren Sie 50 Dextran intravenös. Ziehen Sie die Nadel zurück und stillen Sie die Blutung mit Wattestäbchen.

Vermeiden Sie Blut- und Farbkontamination des Ohrs. Übertragen Sie das Tier auf die Heizplatte zu einer Acro-Glasanordnung mit einem Schlitz für die Hörplatte und einer 0,5 cm hohen Ebene zur Positionierung des Ohrs. Fixieren Sie das Tier in Bauchlage auf der Heizplatte mit einem adhäsiven Verband.

Platzieren Sie den konvexen Knorpel an der Basis des Ohres neben der Ebene für das Ohr, sodass der apikale Teil des Ohres flach auf der Ebene aufliegen kann. Geben Sie einen Tropfen Aqua bei Raumtemperatur auf die Akro-Glasplatte. Nehmen Sie mit Wattestäbchen den Tropfen Aqua auf und lassen Sie die Kapillarkräfte das Ohr in der Ebene an die Akro-Glasplatte anheften.

Die Ohrmuschel muss so flach wie möglich positioniert werden, obwohl der Knorpel ihr eine konvexe Form verleiht. Daher sollte nur der flexiblere distale Teil der Ohrmuschel auf der Acrylglasplatte platziert werden. Um Gewebeschäden und Extravasation von Flüssigkeiten und Farbstoff zu vermeiden, sollte das Ohr mit der Pinzette so wenig wie möglich berührt werden.

Fügen Sie anschließend einen Tropfen Aqua auf die konvexe dorsale Seite des Ohrs hinzu. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf das Ohr, ohne die basalen Gefäße, die ins Ohr eintreten, zu komprimieren. Verwenden Sie Wattestäbchen, um so viel Aqua wie möglich unter dem Deckglas zu entfernen, um den Abstand zwischen dem Deckglas und den Zielgefäßen im Ohr zu minimieren.

Beginnen Sie damit, das intravitale Fluoreszenzmikroskop für die Visualisierung von 50 Dextran einzustellen. Übertragen Sie das präparierte Tier auf die Plattform des intravitalen Fluoreszenzmikroskops. Suchen Sie mithilfe der 5fachen, 10fachen und 20fachen Vergrößerung und einer Lichtintensität von 20 % nach einem venösen Gefäß mit einem Durchmesser von 50 bis 60 Mikrometern und einem antegraden Blutfluss.

Geben Sie einen Tropfen Wasser mit Raumtemperatur auf das Deckglas, um die Wasserimmersion für das Objektiv mit 63facher Vergrößerung zu ermöglichen. Beginnen Sie unmittelbar nach dem Auftragen des Wassertropfens mit der Aufzeichnung des Gefäßes für 20 Sekunden zur Bestimmung des Basisdurchmessers und des Blutflusses. Starten Sie die Thrombusinduktion fünf Minuten nach der Injektion von 50 Dextran.

Zu diesem Zweck die Lichtintensität auf 100 % erhöhen. Während der phototoxischen Thrombusinduktion die Blende des Mikroskops innerhalb eines 30-Sekunden-Zeitraums für zwei Sekunden schließen, um eine Verstopfung des Blutflusses zu überprüfen. Wenn der Blutfluss weiterhin besteht, die Blende erneut öffnen. Das Gefäß wird als verstopft klassifiziert, wenn der Fluss 30 Sekunden oder länger stillsteht oder wenn der Blutfluss rückläufig ist.

Wählen Sie fünf Gefäße pro Ohr aus und verschließen Sie diese innerhalb einer Stunde nach der Injektion von 50 Dextran. In diesem Fall wurden die Tiere vor der Injektion von 50 Dextran und vor der Thrombusinduktion mit einem Fahrzeugmittel oder mit Cannabinoiden, Anandamid, WIN 155,212-2 oder Cannabidiol behandelt. Anandamid, jedoch nicht CBD, und WIN 155,212-2 beschleunigten nach einmaliger Behandlung im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle signifikant das Thrombuswachstum.

In einer anderen Versuchsreihe wurde Anandamid mit Indometacin kombiniert, um den Einfluss von Cyclooxygenase-abhängigen Produkten auf die Thrombusbildung über Anandamid zu untersuchen. Die gleichzeitige Gabe mit Indometacin neutralisierte die prothrombotische Wirkung von Anandamid. Daher bewirkt eine akute Exposition gegenüber Anandamid in vivo eine cyclooxygenaseabhängige prothrombotische Wirkung.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Thrombusinduktion in engen Gefäßen inklusive Vorbereitung innerhalb von 90 Minuten durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, das Aurikel jedes Mal äußerst vorsichtig zu handhaben, um eine Extravasation der Flüssigkeiten und des Farbstoffs zu vermeiden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Thrombusbildung ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewandt werden, wie beispielsweise die Wundheilung, das Versagen von Hautlappenplastiken und die Angiogenese.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die intravenöse Applikation von Fluoreszenzfarbstoffen, die Position des Ohrs und die Beleuchtung spezifischer Gefäße haben, um eine intravitale phototoxische Thrombusinduktion durchführen zu können.