Analyse Synaptische Modulation von Drosophila melanogaster Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die synaptische Dynamik in einem einzelnen Neuron unter verschiedenen Aktivierungsbedingungen zu verstehen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der synaptischen Plastizität zu beantworten, wie z.B. die Aufdeckung von Veränderungen in der molekularen Zusammensetzung von Synapsen bei der Reifung der Aktivität des Neurons. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die halbautomatische Analyse mehrerer Aspekte von Synapsen ermöglicht, einschließlich ihrer Anzahl, Verteilung und des Anreicherungsgrades der molekularen Komponenten nach Synapsen.

Sammeln Sie für dieses Experiment die Fliegen innerhalb von sechs Stunden nach der Eklosion in normalen Fläschchen. Legen Sie die Auffangfläschchen in ein transparentes Acrylgestell. Positionieren Sie das Gestell in einem kleinen Inkubator mit einer Temperatur von 25 Grad Celsius in einem präzisen Abstand zu einem LED-Panel, bei dem die Lichteinwirkung durchschnittlich 1000 Lux beträgt.

Dann fliegt das Heck ein bis drei Tage lang unter einer der folgenden Bedingungen, entweder konstante Dunkelheit, 12 Stunden Licht, gefolgt von 12 Stunden Dunkelheit, oder konstantes Licht. Später sezieren und färben Sie die Gehirne mit Standardtechniken. Um die Fliegengehirne zu montieren, beladen Sie eine Mikropipette mit Einbettmedium und legen Sie zwei 2-Mikroliter-Tropfen in der Mitte eines Objektträgers im Abstand von etwa 2 cm ab.

Legen Sie einen Deckglas auf jeden Tropfen und den Spalt zwischen ca. 0,2 mm. Anschließend 15 Mikroliter Eindeckmedium über die Deckgläser und in den Spalt geben. Legen Sie das Gehirn unter einem Präpariermikroskop in den Spalt von der Mikropipette.

Und dann positionieren Sie das Gehirn mit der Bauchseite nach oben. Zum Schluss bringen Sie einen Deckslip an und versiegeln diesen entlang der Ränder mit Klarlack. Die Gehirne können dann mit Standardtechniken abgebildet werden, um 3D-Bilder zu rekonstruieren.

In diesem Fall wird die GFP-Lumineszenz in Zellen mit aktiver Brp-Expression mit der Sternmethode dokumentiert. Auch in diesem Beispiel wurden R7- und R8-Photorezeptor-Axone mit Anticiaoptin immunisiert, was mit RFP-markierten Sekundärantikörpern betrachtet wurde. Um die Anzahl, Verteilung und den Delokalisierungsgrad des Brp zu quantifizieren, wurden zunächst 3D-Bilder des Gehirns rekonstituiert, die aus Bildstapeln erstellt wurden.

Brp-Punkte werden weiß angezeigt. Suchen Sie nun die Region von Interesse. In diesem Fall werden die Endigungen des R8-Axons lokalisiert, indem die Ausdünnung der positiven Anticiaoptin-Axone am Eintrittspunkt in die M3-Medullaschicht verfolgt wird.

An jedem R8-Axonterminal ist die Brp GFP Puncta mit dem Spot-Detektionsmodul zu identifizieren. Wählen Sie "Neue Spots hinzufügen" und dann in den Algorithmuseinstellungen "Nur Segmentbereich" aus. Nachdem der Analysebereich definiert ist, stellen Sie den Quellkanal auf Brp GFP und dann den geschätzten XY-Durchmesser auf 0,35 Mikrometer ein.

Und dann aktivieren Sie die Hintergrundsubtraktion in der Spot-Erkennung. Wählen Sie als Nächstes Qualität als Filtertyp aus, und die Punkte werden automatisch gefiltert. Schließen Sie diesen Schritt ab, indem Sie auf Fertig stellen klicken.

Wiederholen Sie die Spot-Erkennungsmethode für alle R8-Axone im Datensatz. Die nächste Region, die identifiziert werden muss, ist das Axonzytoplasma. Generieren Sie zunächst Oberflächenobjekte mit der Oberflächenfunktion.

Wählen Sie dann Neue Oberflächen hinzufügen aus, und schalten Sie unter den Algorithmuseinstellungen die Option Segment Nur Interessenbereich um. Wählen Sie nun manuell den gewünschten Bereich aus. Legen Sie als Nächstes die Berechnungsumfänge fest.

Um den Photorezeptorkanal als Quelle zu finden, wählen Sie die Option Glätten. Wählen Sie als Schwellenwert die absolute Intensität aus. Aktivieren Sie die Option zum Teilen von berührenden Objekten.

Stellen Sie den Durchmesser des Sitzpunkts auf 0,5 Mikrometer ein und verwenden Sie die Standardfiltereinstellungen für Qualität und Anzahl der Voxel. Der Filter wird dann automatisch angewendet. Wechseln Sie nun zum Bearbeiten und Löschen der DGM-Teile, die außerhalb des interessierenden Bereichs generiert wurden.

In diesem Fall die anderen Axone. Nach der Wiederholung der Erkennung der Axonregion für alle R8-Axone im Datensatz werden alle Brp-Puncta und R8-Axone als ein Satz von Spot-Objekten identifiziert. Und die entsprechenden zytoplasmatischen Regionen werden als Oberflächenobjekte identifiziert.

Fahren Sie nun fort, indem Sie die Ausrichtung und den Abstand jedes Axons manuell definieren. Dies ist wichtig für die spätere Quantifizierung der Brp-GFP-Dichte entlang jedes Neurons im Medulla-Neuropil. Definieren Sie dazu zunächst deren Start- und Endpunkte.

Wählen Sie Neue Messpunkte hinzufügen und dann Bearbeiten und anschließend Oberfläche des Objekts auswählen, um mit der Oberseite der Oberflächenobjekte zu arbeiten. Um die Startpunkte zu definieren, setzen Sie Messpunkte auf alle Oberflächenobjekte der R-Axone in der M1-Schicht. Ordnen Sie diese Punkte in einer systematischen, reproduzierbaren Reihenfolge an.

Definieren Sie als Nächstes die Endpunkte. Wählen Sie erneut Neue Messpunkte hinzufügen, Bearbeiten und Oberfläche des Objekts aus. Wiederholen Sie dann die gleiche systematische Reihenfolge und platzieren Sie Messpunkte an der Unterseite der R-Axone in der M3-Schicht.

Um die Brp-Hintergrundintensität zu quantifizieren, analysieren Sie die zytoplasmatischen Regionen von zwei R7-Axonen. Wählen Sie Neue Flächen hinzufügen aus, und definieren Sie den Bereich eines R7-Axons manuell, wie dies bei den R8-Axonen der Fall war. Verwenden Sie identische Einstellungen, aktivieren Sie jedoch nicht die Option "Geteilte berührende Objekte aktivieren".

Lassen Sie das weg. Fügen Sie als Nächstes ein Dummy-Spots-Objekt in einer definierten R7-Axonregion hinzu. Wählen Sie Neue Spots hinzufügen und dann Automatische Erstellung überspringen und manuell bearbeiten.

Wählen Sie dann die Mitte des Objekts und klicken Sie auf das Oberflächenobjekt, um das Dummy-Spots-Objekt innerhalb des R7-Axons zu platzieren. Wiederholen Sie nun die Schritte zur Oberflächen- und Spot-Erkennung für ein zweites R7-Axon. Definieren Sie dann die Start- und Endpunkte der R7-Axone, wie es bei den R8-Axonen der Fall ist.

Stellen Sie für diese Analyse sicher, dass die richtige Software installiert ist. Öffnen Sie das Dataset mit den Punktdaten, den Oberflächendaten und zwei Messpunktobjekten, die jeweils die gleiche Anzahl von Messpunkten enthalten. Überprüfen Sie die Daten.

Beide Messpunktobjekte müssen die gleiche Anzahl von Messpunkten haben, damit die Berechnungen funktionieren. Nachdem die Spots, Axonregionen sowie Start- und Endpunkte definiert wurden, starten Sie das Plugin. Überprüfen Sie zunächst die Metadaten, insbesondere die Voxelgröße.

Öffnen Sie die Bildeigenschaften aus der Bearbeitung und überprüfen Sie dann die 3 Dimensionen des Voxels und der Mikrometer unter den Koordinaten in der Geometrie. Wählen Sie als Nächstes einen Kanal für die Intensitätsanalyse aus. In diesem Fall wird der Kanal ausgewählt, auf dem Brp GFP angezeigt wird.

Definieren Sie dann den Dateinamen für die Ergebnisse. Definieren Sie als Nächstes die Anzahl der Bins als 10 und legen Sie die Axonlänge auf 100 % fest. Definieren Sie dann die Regionen der Punktzahl, indem Sie den Spotradius auf 0,35 Mikrometer und die umgebende zytoplasmatische Region auf 50 Mikrometer festlegen. Führen Sie abschließend den Befehl zur Synapseerkennung aus, und analysieren Sie später die Ausgabe statistisch.

Gemäß den beschriebenen Protokollen wurden Brp GFP puncta in den R8-Synapsen von Fliegen analysiert, die ständiger Dunkelheit, konstantem Licht oder einem normalen Hell-Dunkel-Zyklus ausgesetzt waren. Die Anzahl der Brp puncta war in R8-Photorezeptoren von Fliegen, die unter konstantem Licht gehalten wurden, signifikant reduziert. Die Verteilung der puncta wurde mit Hilfe eines benutzerdefinierten Plugins berechnet.

R8-Synapsen waren entlang des axonalen Schaftes von der M1- bis zur M3-Schicht verteilt, aber ihre Dichte war in den M1- und M3-Schichten höher. In ähnlicher Weise wurden die Delokalisationsgrade der Puncta berechnet. Sie blieben unter allen Bedingungen unverändert, jedoch unterschieden sich die Delokalisierungswerte von Brp GFP von denen anderer Reporter, wie z.B. Brp-short-cherry, das unter konstantem Licht deutlich entschärft wird.

Es ist möglich, dass das kurze Brp-Fragment nach der Demontage aus der AZ unsachgemäß verarbeitet wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man synaptische plastische Eigenschaften in einem einzelnen Neuron analysiert. Zu diesen plastischen Eigenschaften gehören die Anzahl der Synapsen, ihre Verteilung und die Markierung der Anreicherung einer bestimmten molekularen Komponente nach den Synapsen.