Name: Analyse Synaptische Modulation von Drosophila melanogaster Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Lernen Sie die halbautomatisierte Analyse synaptischer Aktivzonen in Drosophila melanogaster-Photorezeptoren nach Lichtexposition. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Synapsenzahl und räumlicher Verteilung.

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Wir danken T. Stürner für hilfreiche Korrekturen, Diskussionen und Kommentare zum Manuskript; SL Zipursky fly Aktien zu liefern; M Schölling zum Durchführen einer Bildverarbeitung. Ein Teil der Bildanalyse wurde bei A. Kakita Labor durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung und JSPS-Stipendien für Forschung unterstützt im Ausland (AS), JSPS-Stipendiaten (SH-S.), Grant-In-Hilfe für die Inbetriebnahme (24800024), auf innovative Bereiche (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE Kernfinanzierung (GT) und DZNE Einrichtung Lichtmikroskopie (CM).

Die experimentellen Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen beinhalten ausschließlich mit Drosophila funktionieren und nicht zu den Tierschutzgesetze in Deutschland und Japan unterzogen. 1. Lichtbelichtungsbedingungen <ol><li> Bereiten Sie Fliegen , die sinnlosen-Flippase (sens-FLP) und Bruchpilot-FRT-HALT-FRT-gfp (BRP-FSF-gfp) 15 zur Visualisierung von BRP-GFP in Photorezeptor R8 Neuronen (R8) tragen. Die genomische Locus Codierung brp innerhalb eines Bacterial Artificial Chromosome (BAC) wurde modifiziert , um dieses BRP-FSF-GFP - Konstrukt zu erzeugen. In den Fliegen dieser modifizierten BAC die Expression von BRP-GFP trägt , ist unter der Kontrolle der endogenen regulatorischen Sequenzen, aber nach sinnlosen-Flippase vermittelter Entfernung der FRT-STOPP-FRT - Kassette 15 bis R8 Photorezeptoren beschränkt. Beachten Sie, dass sens-FLP selten in R7s Flippase zum Ausdruck bringt. </li><li> Halten Sie die Fliegen in einem 12 h light / 12 h Dunkel - Zyklus (LD) bei 25 ° C von der Larve bis zum Schlüpfen (1A). </li><li> Sammeln Sie die Fliegen zum 0 - 6 h nach dem Schlüpfen und legen Sie sie in ein neues Fläschchen Fliege Nahrung enthält. </li><li> Stellen Sie die Phiolen in eine transparente Zahnstange aus Acrylharz mit drei Stufen (einer Höhe von 41 cm, einer Basis von 21 cm, einer Dicke von 4 cm und einer Höhe von 13 cm für jeden Schritt) (1B). </li><li> Stellen Sie den Abstand zwischen der Zahnstange und einem LED - Panel , die Beleuchtung mit einer durchschnittlichen Intensität von 1.000 Lux , um eine digitale Belichtungsmesser (1C) verwendet wird . </li><li> Halten Sie die Fliegen für 1-3 d unter einer der folgenden Bedingungen: konstanter Dunkelheit (DD), 12 h Licht / 12 h Dunkel - Zyklus (LD) oder Dauerlicht (LL) bei 25 ° C in einem kleinen Inkubator (1A und 1C). </li></ol> 2. Dissection, Immunhistochemie und Imaging <ol><li> Präparieren Fliegen Gehirne mit einer Pinzette, fixieren Sie diese mit 4% formaldehyde und immunostain mit dem primären Antikörper gegen Chaoptin (1:50) und einem zweiten Antikörper zur Visualisierung von auf früheren experimentellen Verfahren 25 basierend Photorezeptoren. Kurz: <ol><li> Bereiten 0,1% Triton X-100 in PBS (0,1% PBT). Diese Lösung wird verwendet, um Antikörpergewebepenetration verbessern. </li><li> Anesthetize fliegt auf einem CO 2 - Pad, sortieren Sie die richtigen Genotyp und übertragen sie in eine Petri mit 0,1% PBT gefüllten Teller. </li><li> Kleben Sie die Zange unter den Rüssel und ziehen Sie die rechte und linke Auge jeweils mit den anderen Zange. </li><li> Entfernen Sie den Rüssel und die Luftröhre an das Gehirn gebunden. </li><li> Übertragen, um das Gehirn mit der Zange in ein 1,5 ml-Röhrchen, enthaltend 150 &amp; mgr; l von 0,1% PBT bei RT. </li><li> Innerhalb von 10 min Wiederholung von 2.1.3 - 2.1.5 so viele Gehirne wie möglich zu erhalten. </li><li> In 50 &amp; mgr; l von 16% Formaldehyd in das Röhrchen und mischen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren Sie die Gehirne in Fixiermittel bei RaumTemperatur für 50 min. </li><li> Waschen dreimal mit 200 &amp; mgr; l von 0,1% PBT mit einer Mikropipette, Aufmerksamkeit die Gehirne in der Röhre zu verlassen. </li><li> Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die 0,1% PBT und die primäre Antikörperlösung hinzufügen, wie folgt hergestellt: in den 196 &amp; mgr; l von 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) 4 ul anti-Chaoptin Antikörper (Endverdünnung 1 : 50) für die Visualisierung von Photorezeptoren. </li><li> Inkubieren Sie die Gehirne in der primären Antikörperlösung bei 4 ° CO / N. </li><li> Wasch 3x mit 200 ul 0,1% PBT mit einer Mikropipette. </li><li> Nach der letzten Waschung, entfernen Sie die 0,1% PBT und einen sekundären Antikörper, die 200 &amp; mgr; l der 0,3% PBT hinzuzufügen. </li><li> Inkubieren bei 4 ° CO / N im Dunkeln. </li><li> Waschen dreimal mit 200 ul 0,1% PBT mit einer Mikropipette. </li></ol></li><li> Zur Montage setzen zwei kleine Tropfen (2 ul jeweils) eines Befestigungsmediums mit einer Mikropipette in der Mitte eines Objektträgers bei etwa 2 cm distaNOA voneinander. </li><li> Legen Sie zwei Deckgläser, ein auf jedem Tropfen und lassen einen schmalen Spalt zwischen den Deckgläsern von etwa 0,2 mm. </li><li> Legen Sie 15 ul einer Montagemedium auf dem Deckglas und fügen Sie die Gehirne mit einer Mikropipette in die Montagemedium. </li><li> Unter einem Binokular, positionieren das Gehirn mit der Bauchseite nach oben in den schmalen Spalt zwischen den beiden Deck (Abbildung 2). </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack , um die Probe zu beheben (Abbildung 2). </li><li> Erhalten Sie Bilder der Gehirne mit einem konfokalen Mikroskop. Verwenden Sie ein 63X -Ölimmersionsobjektiv Objektiv (1,4 NA) und ein 2.6X Digitalzoom. Erzeugen mehr als 20 optische Schnitte der zweiten Optik ganglion medulla mit einer Schrittweite von 0,5 um. </li></ol> 3. Die Erzeugung der Spots, Oberfläche Objekte, Startpunkte und End-Punkte <ol><li> Zur Quantifizierung der Zahl, die distribution und die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP puncta, öffnen Sie das durch konfokale Mikroskopie erhalten Stapel in der Analyse - Software - Image und Rekonstitution von 3D - Bildern (3A). Beachten Sie, dass der Schritt in dieser Studie wurde mit Imaris durchgeführt. </li><li> Identifizieren Sie die BRP-GFP puncta durch das Punkterfassungsmodul für jeden R8 Axonterminal. <ol><li> Wählen Sie &quot;Neuen Spots&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie einen R8 Axonterminal in der Medulla manuell. </li><li> Wählen Sie den Quellkanal des BRP-GFP-Signal. HINWEIS: Die R7 und R8 Photorezeptor Axone wurden mit immunmarkierten anti-Chaoptin (3A). Nur wenn enthält R8, BRP-GFP puncta und somit leicht zu unterscheiden (3A) werden könnte. Ferner könnte der Endpunkt R8 durch die Verdünnung der anti-Chaoptin-positive Axone am Eintrittspunkt in die Medulla M3 Schicht identifiziert werden. </li><li> Stellen Sie den geschätzten XY Durchmesser to 0,35 um und prüfen &quot;Hintergrund Subtraktion&quot; im Spot-Erkennung aus. </li><li> Wählen Sie &quot;Qualität&quot; in Filtertyp und Filter automatisch. Dann klicken Sie auf Fertig. </li><li> Wiederholen von 3.2.1 t- 3.2.5 für andere R Axone (3B). </li></ol></li><li> Um die Delokalisierung Ebene von BRP-GFP in R8 Axone messen, Oberflächenobjekte mit dem &quot;Surface&quot; -Funktion für jedes Axon (3C) erzeugen. <ol><li> Wählen Sie &quot;Add new Oberflächen&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie dann manuell einen R8 Axonterminalen in der Medulla. </li><li> Wählen Sie den Quellkanal der Photorezeptoren. </li><li> Abhaken &quot;glatt&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Absolute Intensität&quot; in der Schwelle. </li><li> Check &quot;Enable&quot;. &quot;Seed-Punkte-Durchmesser&quot; ist 0,5 um. </li><li> Wählen Sie Filtertyp &quot;Qualität&quot; und &quot;Anzahl der Voxel&quot;, und dann filtern automamatisch. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Bearbeiten&quot; und löschen Sie die Stücke auf andere nicht interessant Axone erzeugt Oberflächen. </li><li> Wiederholen von 3.3.1 - 3.3.8 für andere R Axone (3C). Hinweis wurden einige Oberflächen Objekte unterbrochen wegen der geringen Dicke und das schwache Signal in Photorezeptoren bei M2-Schicht, aber sie waren immer noch als ein einziges Objekt von Anfang bis Ende Punkte berücksichtigt. </li></ol></li><li> Um die Verteilung der BRP-GFP puncta entlang jedes Neuron in der Medulla neuropil identifizieren, zu definieren den Startpunkt und Endpunkt mit dem Messpunkt - Funktion (3D). <ol><li> Wählen Sie &quot;Neuen Messpunkte&quot;. Wählen Sie dann &quot;Bearbeiten&quot; und wählen Sie &quot;Oberfläche des Objekts&quot; mit der Spitze der Flächenobjekte zu schneiden. </li><li> Setzen Sie Messpunkte auf der Oberfläche Objekte von R Axone in M1 Schicht um. Diese sind definiert nun als Startpunkte (3D). </li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Messpunkte&quot;.Wählen Sie dann &quot;Bearbeiten&quot; und wählen Sie &quot;Oberfläche des Objekts&quot; mit der Unterseite der Oberfläche Objekte zu schneiden. </li><li> Setzen Sie Messpunkte auf der Unterseite der Oberflächenobjekte von R Axone in M3 Schicht um. Diese sind definiert nun als Endpunkte (Abbildung 3D). </li></ol></li><li> Um das Hintergrundsignal von der GFP - Kanal subtrahieren, erzeugen Flächenobjekte, Flecken, Start-Punkte und Endpunkte für zwei R Axone in M6 Schicht (Abbildung 3E). <ol><li> Wählen Sie &quot;Add new Oberflächen&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; in den Einstellungen des Algorithmus. Wählen Sie dann ein Axon R7 Klemme zwischen M5 und M6 manuell Schicht. </li><li> Wählen Sie den Quellkanal des Photorezeptors. </li><li> Abhaken &quot;glatt&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Absolute Intensität&quot; in der Schwelle. </li><li> Wählen Sie Filtertyp &quot;Qualität&quot; und &quot;Anzahl der Voxel&quot;, dann automatisch filtern. </li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Spots&quot;;. </li><li> Wählen Sie &quot;automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Center of Object&quot; und einen Platz im inneren Bereich der Oberfläche Objekt hinzufügen, erzeugt aus 3.5.1 - 3.5.6. </li><li> Wiederholen von 3.5.1 - 3.5.9 für eine andere R7 Axonterminal. </li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Messpunkte&quot;. Wählen Sie dann &quot;Bearbeiten&quot; und stellen Messpunkte auf der Oberseite der beiden Oberflächenobjekte von der Spitze des R7 Axonterminal in M6 Schicht. Diese werden nun als Startpunkte definiert. </li><li> Wählen Sie &quot;Neuen Messpunkte&quot;. Wählen Sie dann &quot;Bearbeiten&quot; und stellen Messpunkte auf der Unterseite der beiden Oberflächenobjekte von der Spitze des R7 Axonterminal in M6 Schicht. Diese sind definiert nun als Endpunkte (Abbildung 3E). </li></ol></li></ol> 4. Berechnung der Anzahl der Spots, Verteilung des Spot-Frequenz und Pegel des Anreicherung von BRP-GFP mit einer angepassten Bilddatenanalyse-Software <ol><li> Kopieren Sie die Datei&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; und die &quot;Funktionen&quot; Ordner in den Imaris XT Matlab Ordner. Beachten Sie, dass die Berechnung in dieser Studie mit einem angepassten Plugin implementiert in Matlab durchgeführt wurde. Laden Sie das Plugin von der Website ( <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> Öffnen Sie einen Datensatz mit n-Spots, n Oberflächen und zwei Messpunktobjekte, die jeweils n Messpunkte (hergestellt 3,1 bis 3,4). Der erste Messpunkt Objekt definiert die Startpositionen für alle Axone. Der zweite Messpunkt Objekt definiert die Endposition aller Axone. Beide Messpunktobjekte müssen die gleiche Anzahl von Messpunkten zu haben (dh die Anzahl von Axonen). </li><li> Führen Sie die Bildverarbeitung &gt;&gt; CUSTOM&gt; atsushis Synapse Erkennung Vs 6. </li><li> Überprüfen Sie Metadaten und Pixelgrößen in Bildanalyse-Software für den Fall, ändern Sie es nicht korrekt ist. </li><li> Wählen Sie den Kanal für die performance der Intensitätsanalyse von Spots Regionen und Cytoplasma-Regionen (der Kanal mit BRP-GFP). </li><li> Definieren Sie den Dateinamen, die Ergebnisse für den Export. </li><li> Definieren Sie die Anzahl der Bins und Axonlänge in Prozent. Geben Sie die Anzahl der Behälter als &quot;10&quot; und den Bereich der Behälter als &quot;100%&quot; (4A und 4B). </li><li> Definieren Sie die Bereiche der Spots und den anderen zytoplasmatischen Regionen für die BRP-GFP Delokalisierung Analyse. Geben Sie Flecken Radius als &quot;0,35 um&quot; und der Breite auf die Umgebung als &quot;50 &amp; mgr; m&quot;. Der Flecken Radius definiert den Bereich für das puncta GFP-Signal (0,35 &amp; mgr; m Durchmesser, auf einer punctum zentriert). Die Breite Bereich der umgebenden definiert den Bereich für das GFP - Signal im Cytoplasma - Bereich (50 &amp; mgr; m Durchmesser, auf dem punctum zentriert, aber auch nur R8 und unter Ausschluss aller Punktbereiche im Zytoplasma) (4A und 4C). </li><li> Warten Sie, bis alle Neuron Masken verarbeitet werdenund exportiert als PDF - Dateien (4B und 4C) und eine CSV - Tabelle zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm . Die CSV-Tabelle enthält die Anzahl der Punkte, die mittlere Signalintensität in der &quot;Cytoplasma-Bereich&quot; und die maximale Signalintensität in der &quot;Punkt&quot; in jedem Fach für alle R8 Axone. </li><li> Öffnen Sie einen Datensatz erstellt in 3.5 für die Subtraktion des Hintergrundsignals. </li><li> Führen Sie die Bildverarbeitung von 4.3 - 4.9. </li><li> Berechne den Mittelwert der Gesamtzahl und der Verteilung der BRP-GFP puncta in ein Tabellenkalkulationsprogramm (Figuren 4D und 4E). </li><li> Berechne den Mittelwert der Delokalisierung von BRP-GFP - Signal in einer Kalkulationstabelle durch das Verhältnis der durchschnittlichen Intensität in der &quot;zytoplasmatische Bereich&quot; geteilt durch die maximale Intensität in der &quot;Spot&quot; subtrahiert durch die durchschnittliche Intensität des Hintergrundsignals (4F) . </li></ol>

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<li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In dieser Studie haben wir gezeigt, wie die Lichtverhältnisse vorzubereiten Fliegen auf eine gleiche Lichtintensität zu belichten. Wir quantifiziert nicht nur die Anzahl der synaptischen puncta Marker könnte aber auch räumlich die Dichte von Synapsen entlang Axone lösen und die Delokalisierung Ebene des Markerproteins in zytoplasmatischen Bereichen zu messen. Diese drei Beurteilungen ermöglichen es uns, die Details der synaptischen Dynamik bei einzelnen Neurons Ebene in verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten. Unser...

<html> Die Modulation der synaptischen Funktion trägt zu der bemerkenswerten Fähigkeit des Nervensystems genau zu reagieren oder auf sich ändernde Umweltstimuli anpassen. Die präsynaptischen Vesikelfreisetzung Wahrscheinlichkeit Einstellen ist eine Möglichkeit , 1 synaptischen Stärke zu steuern. Synaptische Vesikel - Freisetzung erfolgt an der aktiven Zone (AZ), einem spezialisierten Bereich der präsynaptischen Membran 2. Die AZ wird durch eine Kassette von spezifischen Proteinen charakterisiert 3, 4. Die meisten Proteine zu AZ Montage beitragen , werden in Nematoden, Insekten und Säugetieren 5 hoch konserviert. Neuere Studien legen nahe , dass das Niveau von neuronaler Aktivität der molekularen Zusammensetzung des AZ reguliert, das wiederum trägt zur Regelung der Funktionsausgang sowohl in vitro als auch in vivo 6, 7,&gt; 8. Wir fanden vorher , dass Photorezeptor AZs molekulare Umbau in Drosophila unterzogen werden nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht 9. In diesem Zustand wurde beobachtet, dass die Anzahl der Bruchpilot (BRP) -positiven AZs in dem Photorezeptor Axone reduziert wurde. Die Brp / CAST / ELKS Familie Proteine sind Grundbausteine von AZs in Wirbeltieren und wirbellosen Synapsen 10. Bei Drosophila brp Mutanten, evozierte Vesikelfreisetzung 11 unterdrückt wird, 12. Die 17 C-terminalen Aminosäurereste von Brp sind für synaptic vesicle clustering an der Drosophila Neuromuscular Junction (NMJ) 13, 14. Diese Studien zeigten, die zentrale Rolle dieses Moleküls in AZ Organisation und Funktion. Mit einem neu entwickelten genetischen Werkzeug, synaptic tagging mit Rekombinations (Stern), Brpkann in vivo in spezifische Zelltypen, bei endogenen Expressionsniveaus und bei einer einzelnen Synapse Auflösung 15 beobachtet werden. Dieses Werkzeug ermöglicht es, die endogene Dynamik der Synapsen quantitativ in dem Komplex des zentralen Nervensystems zu bewerten. Es wurden mehrere Studien Quantifizierungen einschließlich Synapsen basierend auf Daten aus der konfokalen Mikroskopie erhalten. Synaptische Veränderungen wurden durch Messen der Länge, die Fläche, das Volumen, die Dichte und das Zählen der Anzahl basierend auf hoch entwickelten Software-Anwendungen bewertet. Zum Beispiel stellt die Freeware ImageJ eine Quantifizierungsmethode für die gesamte synaptischen Bereich und Synapsendichte Maßnahmen an der Drosophila NMJ 16. Die Anzahl der Kolokalisation Websites von Pre - und postsynaptischen Markern wurden 17 mit dem Plugin &quot;Puncta Analyzer&quot; auf der ImageJ Software - Plattform quantifiziert. Alternativ kann ein Multi-Paradigm numerischen Rechenumgebung basiertes Programm, Synapse Detector (SYND) können automatisch mit einem fluoreszierenden Marker markiert Dendriten von Neuronen Spuren und quantifiziert dann die synaptischen Proteinmengen als Funktion des Abstands von dem Zellenkörper 18. Die Software Synaptische Puncta Analysis (SynPAnal), hat sich für die schnelle Analyse von 2D-Bildern von Neuronen erworben von konfokalen oder Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Die primäre Funktion dieser Software ist die automatische und schnelle Quantifizierung von Dichte und Intensität der Protein puncta 19. Vor kurzem wurde eine automatische lernbasierte Synapse Erkennungsalgorithmus wurde für die Quantifizierung der synaptischen Zahl in 3D 20, erzeugt wurde 21 die Vorteile der 3D - Visualisierung-Assisted Analysis (Vaa3D) Software nehmen. Kommerzielle Bildanalyse-Software sind auch leistungsfähige Werkzeuge für die synaptische Quantifizierungen. Zum Beispiel kann die fluoreszenzmarkiertem Neurotransmitter - Rezeptoren oder eine präsynaptische AZ Komponente in drei Dimensionen mit Einzelsiebzug Synapse Auflösung in C. elegans 22 oder der Drosophila olfaktorische System 23, 24, so dass Hunderte von Synapsen zu schnell charakterisiert innerhalb einer einzigen Probe quantifiziert. Hier präsentieren wir eine Methode, durch eine maßgeschneiderte Bildanalyse-Software-Plug-in in einem Multi-Paradigma numerische Rechenumgebung implementiert, die halbautomatisch mehrere Aspekte der AZs analysieren können, einschließlich deren Anzahl, Verteilung und dem Grad der Anreicherung von molekularen Komponenten zu der AZ. Somit ist diese komplexe Analyse erlaubt uns, die Dynamik der synaptischen Komponenten in Axonterminalen unter verschiedenen Umweltbedingungen zu bewerten. Wir untersuchten die Wirkung von Licht-Exposition auf den Ausgangs Synapsen der erwachsenen Fliege Photorezeptoren. Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1)Vorbereitung zur Belichtung, 2) Dissektion, Immunhistochemie und konfokale Bildgebung und 3) Bildanalyse.

<table><tbody><tr><td>Fläschchen</td><td>Hightech, Japan</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>Stecker</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>Kundenspezifisches transparentes Gestell aus Acrylharz&nbsp;</td><td>Shin-Shin Corporation, Japan</td><td></td><td>eine Höhe von 41 cm, eine Basis von 21 cm, eine Dicke von 4 cm und eine Höhe von 13 cm für jede</td></tr><tr><td>Stufe Cool Inkubator</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japan</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>LED-Panel</td><td>MISUMI, Japan</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Lichtmesser</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>Fliegenpad</td><td>Tokken, Japan</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (35 x 10 mm)</td><td>Greiner Bio-One International, Deutschland</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablette</td><td>Takara, Japan</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, Japan</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tube</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 16%</td><td>NEM, Japan</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Chaoptin-Antikörper</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-konjugierter Anti-Maus-Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckglas (18 x 18 mm, 0,17 mm)</td><td>Zeiss, Deutschland</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Industriemikroskope</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Beleuchtung</td><td>Olympus, Japan</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskopie</td><td>Zeiss, Deutschland</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, Schweiz</td><td></td><td>Version 7.6.4 oder höher</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel für Mac&nbsp;</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse synaptische modulation von<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; photorezeptoren nach der einwirkung von längerer licht

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Das Nervensystem hat die bemerkenswerte Fähigkeit, auf verschiedene Reize anzupassen und zu reagieren. Diese neuronale Anpassung wird weitgehend durch Plastizität bei der synaptischen Ebene erreicht. Die aktive Zone (AZ) ist der Bereich an der präsynaptischen Membran, die die Freisetzung von Neurotransmittern vermittelt und ist von einer dichten Ansammlung von Gerüstproteine ​​bestehen. AZs von Drosophila melanogaster (Drosophila) Photorezeptoren unterziehen molekularen Remodeling nach längerer Exposition gegenüber natürlichen Umgebungslicht. Somit ist die Höhe der neuronalen Aktivität kann die molekulare Zusammensetzung der AZ neu anordnen und die Regulierung des Funktionsausgang beitragen. Ausgehend von der Belichtung Set-up Vorbereitung auf die Immunhistochemie, Details dieses Protokoll , wie die Anzahl zu quantifizieren, um die räumliche Verteilung und die Delokalisierung Ebene synaptischer Moleküle an AZs in Drosophila Photorezeptoren. Mit Bildanalyse software, Cluster des GFP-fusionierten AZ Komponente Bruchpilot wurden für jede R8 Photorezeptor (R8) Axonterminal identifiziert. Erkannt Bruchpilot Spots wurden auf einzelne R8 Axone automatisch zugewiesen. Um die Verteilung der Frequenzkanal entlang des Axons zu berechnen, führten wir eine maßgeschneiderte Software-Plugin. Jedes Axon Startpunkt und Endpunkt wurden manuell definiert und die Position jedes Bruchpilot Stelle wurde auf der Verbindungslinie zwischen Start- und Endpunkt projiziert. Neben der Anzahl der Bruchpilot Cluster, quantifiziert wir auch die Delokalisierung Niveau der Bruchpilot-GFP innerhalb der Cluster. Diese Messungen beziehen sich im einzelnen ortsaufgelösten synaptic Dynamik in einem einzigen Neuron unter verschiedenen Umgebungsbedingungen auf Reize.

Das Facettenauge von Drosophila umfasst ~ 780 Ommatidien, die jeweils acht Typen von Photorezeptoren (R1-8). R7 und R8 Projekt ihre Axone in die zweite Optik Ganglion, der Medulla, wo sie Synapsen in Schichten M6 und M3 bilden jeweils 26. Um die Wirkung von längerer Einwirkung von Licht auf der molekularen Zusammensetzung des Photorezeptors R8 aktiven Zonen zu untersuchen, nutzten wir die STaR Methode 15. Endogene Expression von Br...

Hier zeigen wir , wie die Anzahl und die räumliche Verteilung der synaptischen aktiven Zonen in Drosophila melanogaster Photorezeptoren zu quantifizieren, markiert mit einem genetisch molekularen Marker codiert und deren Modulation nach längerer Einwirkung von Licht.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die synaptischen Dynamiken in einem einzelnen Neuron unter verschiedenen Aktivierungsbedingungen zu verstehen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der synaptischen Plastizität zu beantworten, beispielsweise indem sie Veränderungen in der molekularen Zusammensetzung der Synapsen im Zuge der Reifung der neuronale Aktivität aufdeckt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die halbautomatisierte Analyse mehrerer Aspekte von Synapsen ermöglicht, einschließlich ihrer Anzahl, Verteilung und des Anreicherungsgrads molekularer Bestandteile nach der Synaptogenese.Sammeln Sie für dieses Experiment die Fliegen innerhalb von sechs Stunden nach der Eclose in normale Gefäße. Stellen Sie die Sammelgefäße in ein transparentes Acrylgestell. Positionieren Sie das Gestell in einem kleinen Inkubator, der auf 25 Grad Celsius eingestellt ist, in einem genauen Abstand zu einem LED-Panel, sodass die Lichtexposition durchschnittlich 1000 Lux beträgt.Anschließend Fliegen für ein bis drei Tage unter einer der folgenden Bedingungen aufziehen: entweder konstante Dunkelheit, 12 Stunden Licht gefolgt von 12 Stunden Dunkelheit oder konstantes Licht. Danach die Gehirne unter Verwendung standardisierter Techniken dissezieren und einfärben. Um die Fliegengehirne auf einen Objektträger aufzubringen, eine Mikropipette mit Eindeckmedium füllen und zwei Tropfen à 2 µL in die Mitte eines Objektträgers geben, die etwa 2 cm voneinander entfernt sind.Platzieren Sie einen Deckgläser auf jeden Tropfen und lassen Sie einen Spalt von etwa 0,2 mm. Geben Sie dann 15 Mikroliter Einbettmedium über die Deckgläser und in den Spalt. Unter einem Stereomikroskop geben Sie das Gehirn mit einer Mikropipette in den Spalt.Danach positionieren Sie die Gehirne mit der Bauchseite nach oben. Schließlich bringen Sie einen Deckglaser auf und versiegeln ihn an den Rändern mit klarem Nagellack. Die Gehirne können dann mithilfe gängiger Techniken abgebildet werden, um 3D-Bilder zu rekonstruieren.In diesem Fall wird die GFP-Lumineszenz in Zellen mit aktiver Brp-Expression mithilfe der STAR-Methode dokumentiert. Ebenfalls in diesem Beispiel wurden die Axone der R7- und R8-Photorezeptoren mit Anti-Caoptin immunmarkiert, das mit RFP-markierten sekundären Antikörpern sichtbar gemacht wurde. Um die Anzahl, Verteilung und den Delokalisierungsgrad der Brp-GFP-Punkte zu quantifizieren, laden Sie zunächst rekonstruierte 3D-Bilder des Gehirns, die aus Bilddatenstapeln erstellt wurden.Brp-Punkte werden in Weiß dargestellt. Suchen Sie nun den interessierenden Bereich. In diesem Fall werden die Endigungen des R8-Axons lokalisiert, indem dem Dünnerwerden der anticiaoptin-positiven Axone am Eintrittspunkt in die Medullaschicht M3 gefolgt wird.Identifizieren Sie an jedem R8-Axonterminal die Brp-GFP-Punkte mithilfe des Spot-Erkennungsmoduls. Wählen Sie „Neue Spots hinzufügen“ und dann „Nur Bereich von Interesse segmentieren“ in den Algorithmuseinstellungen. Sobald der Analysebereich definiert ist, stellen Sie den Quellkanal auf Brp GFP ein und legen Sie den geschätzten XY-Durchmesser auf 0,35 Mikrometer fest.Danach aktivieren Sie die Hintergrundsubtraktion bei der Fleckendetektion. Wählen Sie anschließend „Qualität“ als Filtertyp aus, wodurch die Punktstrukturen automatisch gefiltert werden. Schließen Sie diesen Schritt ab, indem Sie auf „Fertig stellen“ klicken.Wiederholen Sie die Punkt-Erkennungsmethode für alle R8-Axone im Datensatz. Die nächste zu identifizierende Region ist das Axonzytoplasma. Erstellen Sie zunächst Oberflächenobjekte mit der Oberflächenfunktion.Danach „Neue Oberflächen hinzufügen“ auswählen und unter den Algorithmuseinstellungen „Nur Bereich von Interesse segmentieren“ aktivieren. Anschließend manuell den Bereich von Interesse auswählen. Danach die Berechnungsparameter festlegen.Um den Fotorezeptorkanal als Quelle zu finden, wählen Sie die Option „glätten“. Wählen Sie für die Schwelle die absolute Intensität. Aktivieren Sie die Option zum Trennen berührender Objekte.Stellen Sie den Durchmesser der Sitzpunkte auf 0,5 Mikrometer ein und verwenden Sie die Standardfiltereinstellungen für Qualität und Anzahl der Voxel. Der Filter wird dann automatisch angewendet. Gehen Sie nun zu „Bearbeiten“ und löschen Sie die Teile der Oberfläche, die außerhalb des interessierenden Bereichs erzeugt wurden.In diesem Fall die übrigen Axone. Nachdem die Axonbereichserkennung für alle R8-Axone im Datensatz wiederholt wurde, werden alle Brp-Punkte und R8-Axone als eine Menge von Punktobjekten identifiziert. Und die entsprechenden zytoplasmatischen Bereiche werden als Flächenobjekte identifiziert.Fahren Sie nun fort, indem Sie manuell die Orientierung und den Verlauf jedes Axons definieren. Dies ist wichtig für die spätere Quantifizierung der Brp-GFP-Dichte entlang jedes Neurons im Medulla-Neuropil. Definieren Sie dazu zunächst deren Start- und Endpunkte.Wählen Sie „neue Messpunkte hinzufügen“, dann „bearbeiten“ und anschließend „Oberfläche des Objekts auswählen“, um mit der Oberseite der Oberflächenobjekte zu arbeiten. Um die Startpunkte festzulegen, platzieren Sie Messpunkte auf allen Oberflächenobjekten der R-Axone in der M1-Schicht. Bringen Sie diese Punkte in einer systematischen, reproduzierbaren Reihenfolge an.Als Nächstes definieren Sie die Endpunkte. Wählen Sie „neue Messpunkte hinzufügen“, „bearbeiten“ und erneut „Oberfläche des Objekts“. Platzieren Sie dann in der gleichen systematischen Reihenfolge Messpunkte auf der Unterseite der R-Axone in der M3-Schicht.Um die Brp-Grundintensität zu quantifizieren, analysieren Sie die zytoplasmatischen Bereiche von zwei R7-Axonen. Wählen Sie „neue Oberflächen hinzufügen“ und definieren Sie manuell den Bereich eines R7-Axons, wie zuvor bei den R8-Axonen durchgeführt. Verwenden Sie identische Einstellungen, aktivieren Sie jedoch nicht die Option „Überlappende Objekte aufteilen“.Lassen Sie dies deaktiviert. Fügen Sie als Nächstes ein Platzhalter-Punkte-Objekt innerhalb eines definierten R7-Axon-Bereichs hinzu. Wählen Sie „neue Punkte hinzufügen“ aus, wählen Sie „automatische Erstellung überspringen“ und bearbeiten Sie manuell.Danach den Mittelpunkt des Objekts auswählen und auf das Oberflächenobjekt klicken, um das Platzierungshilfsobjekt innerhalb des R7-Axons zu platzieren. Anschließend die Schritte zur Oberflächen- und Punkt-Erkennung für ein zweites R7-Axon wiederholen. Danach die Start- und Endpunkte der R7-Axone definieren, wie bereits bei den R8-Axonen durchgeführt.Stellen Sie für diese Analyse sicher, dass die korrekte Software installiert ist. Öffnen Sie den Datensatz, der die Spot-Daten, Oberflächendaten und zwei Messpunkte-Objekte enthält, wobei jedes Objekt die gleiche Anzahl an Messpunkten aufweist. Überprüfen Sie die Daten.Beide Messpunkte-Objekte müssen die gleiche Anzahl von Messpunkten aufweisen, damit die Berechnungen funktionieren. Sobald die Flecken, Axonbereiche sowie Start- und Endpunkte definiert wurden, starten Sie das Plugin. Überprüfen Sie zuerst die Metadaten, insbesondere die Voxelgröße.Öffnen Sie die Bild-Eigenschaften über Bearbeiten und prüfen Sie dann die 3 Dimensionen des Voxel sowie die Mikrometer unter Koordinaten in der Geometrie. Wählen Sie anschließend einen Kanal für die Intensitätsanalyse aus. In diesem Fall wird der Kanal ausgewählt, der Brp GFP zeigt.Legen Sie anschließend den Dateinamen für die Ergebnisse fest. Definieren Sie danach die Anzahl der Klassen als 10 und stellen Sie die Axonlänge auf 100 %. Legen Sie dann die Bereiche der Punktstrukturen fest, indem Sie den Fleckradius auf 0,35 Mikrometer und den umgebenden zytoplasmatischen Bereich auf 50 Mikrometer setzen. Führen Sie abschließend den Befehl zur Synapsenerkennung aus und analysieren Sie die Ausgabe später statistisch.Nach den beschriebenen Protokollen wurden Brp-GFP-Punkte in den R8-Synapsen von Fliegen analysiert, die konstantem Dunkel, konstantem Licht oder einem normalen Licht/Dunkel-Wechsel ausgesetzt waren. Die Anzahl der Brp-Punkte war signifikant verringert in R8-Photorezeptoren von Fliegen, die konstantem Licht ausgesetzt waren. Die Verteilung der Punkte wurde mithilfe eines benutzerdefinierten Plugins berechnet.Die R8-Synapsen waren entlang des gesamten axonalen Fortsatzes von der M1- bis zur M3-Schicht verteilt, wobei ihre Dichte in den Schichten M1 und M3 höher war. Ebenso wurden die Delokalisierungsgrade der Pünktchen berechnet. Diese blieben unter allen Bedingungen unverändert; die Delokalisierungsgrade von Brp GFP unterschieden sich jedoch von denen anderer Reporter, wie beispielsweise Brp-short-cherry, das unter konstantem Licht deutlich diffus wird.Es ist möglich, dass eine fehlerhafte Verarbeitung des kurzen Brp-Fragments nach dem Auseinanderbau von der AZ stattfindet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man synaptische Plastizitätseigenschaften in einem einzelnen Neuron analysiert. Solche Plastizitätseigenschaften umfassen die Anzahl der Synapsen, ihre Verteilung sowie die Markierung der Anreicherung einer bestimmten molekularen Komponente an den Synapsen.

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Forschung

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Neurowissenschaften

Bei diesem Verfahren wird ein blaues Licht aktiviert Algen Kanal-und Zell-spezifische genetische Expression Tools zur synaptischen Potentiale mit Lichtimpulsen evozieren an der neuromuskulären Synapse (NMJ)...

Channelrhodopsin2 vermittelte Stimulation der synaptischen Potentiale an Drosophila Neuromuskulären Endplatten

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Elektrophysiologische Aufzeichnung der Spannungsantworten von retinalen Photorezeptoren der Drosophila auf Lichtreize

Dieses Video zeigt ein experimentelles Protokoll zur Untersuchung des verlängerten depolarisierenden Nachpotentials (PDA) bei weißäugigen Drosophila. Das Auge der Fliege wird intensiven blauen Lichtimpulsen ausgesetzt, um das Photopigment Rhodopsin in Metarhodopsin umzuwandeln, wodurch eine Signalkaskade in Gang gesetzt wird, die positive Ionenkanäle öffnet und eine Membrandepolarisation verursacht. Da blaues Licht die Rückumwandlung von Metarhodopsin in Rhodopsin verhindert, führt der...

Untersuchung des verlängerten depolarisierenden Nachpotentials (PDA) in Drosophila-Photorezeptoren

Dieses Video zeigt die Aufzucht von Drosophila melanogaster unter spezifischen Lichtbedingungen, um die Rolle von Bruchpilot-Proteinen bei der Freisetzung von Neurotransmittern und der daraus resultierenden Modulation der synaptischen Aktivität zu untersuchen.

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Analyse des synaptischen Vesikelrecyclings und der Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen in Drosophila-Larven

Hier beschreiben wir eine Hell-Dunkel-Präferenz-Test für Drosophila Larve. Dieser Test liefert Informationen zur angeborenen und zirkadiane Regulierung von Licht Abtasten und Verarbeiten photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

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Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay ein, um das phototaktische Verhalten von Drosophila larval zu untersuchen. In diesem Test wird ein Lichtfleck als Lichtstimulation erzeugt, und der Prozess der Larvenlichtvermeidung wird durch ein infrarotlichtbasiertes Bildgebungssystem aufgezeichnet.

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Wir präsentieren ein Protokoll zur elektrophysiologischen Charakterisierung bistabiler Photopigmente: (i) Ausnutzung der Ladungsverschiebungen innerhalb der Photopigmentmoleküle nach Photonenabsorption und ihrer riesigen Menge in den Photorezeptoren und (ii) Ausnutzung der Absorptionsspektrenunterschiede von Rhodopsin- und Metarhodopsin-Photopigmentzuständen. Diese Protokolle sind nützlich, um nach Mutationen zu suchen, die bistabile Photopigmentsysteme betreffen.

Elektrophysiologische Methoden zur Messung des Photopigmentgehalts in Drosophila-Photorezeptoren

Lernen Sie die halbautomatisierte Analyse synaptischer Aktivzonen in Drosophila melanogaster-Photorezeptoren nach Lichtexposition. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Synapsenzahl und räumlicher Verteilung.

Analyse Synaptische Modulation von

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