Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, ein flüssigkristallbasiertes Nanopartikel als Verabreichungsplattform für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Dicargos an den lipophilen Teil der Plasmamembran lebender Säugetierzellen zu verwenden. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Wirkstoffverabreichung zu beantworten, z. B. wie die Verabreichung und zelluläre Aufnahme von schwer wasserlöslichen hydrophoben Frachten effizient ermöglicht werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine spezifischere Abgabe von membrangesteuerten hydrophoben Frachten an die Plasmamembran ermöglicht, gepaart mit deren reduzierter Zytotoxizität.

Das Verfahren wird von Dr. Okhil Nag, einem Postdoc aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung des DiO-Flüssigkristall-Nanopartikels, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie dann 20 Mikroliter frisch zubereitete Arbeitslösung von NHSS/EDC zu 1,0 Millileter des DiO-Flüssigkristall-Nanopartikels in HEPES-Puffer.

Und fünf Minuten lang umrühren. Fügen Sie dann 20 Mikrolettern einer Stammlösung von Cholesterin PEG Amin zu dieser Mischung hinzu und rühren Sie zwei Stunden lang. Nach zwei Stunden wird das Reaktionsgemisch mit einer Tisch-Minizentrifuge 30 Sekunden lang bei maximaler Drehzahl kurz zentrifugiert.

Führen Sie dann den Überstand durch eine PD 10-Größenausschlusschromatographiesäule, die mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung von Dulbecco äquilibriert ist. Um die erfolgreiche kovalente Konjugation von PEG-Cholesterin an die Oberfläche der DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel durch Gelelektrophorese zu bestätigen, bereiten Sie ein Agarosegel her, wie im Textprotokoll beschrieben. Sobald das Gel fest geworden ist, fügen Sie genügend FSME-Laufpuffer hinzu, um das Gel in die Kammer einzutauchen.

Geben Sie dann 35 Mikroliter DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel in die Vertiefungen des Gels und lassen Sie es 20 Minuten lang bei einer Spannung von 110 Volt laufen. Bilden Sie das Gel mit einem Gel-Imaging-System mit einem Anregungsfilter bei 488 Nanometern und Emissionsfiltern von 500 bis 550 Nanometern ab. Bereiten Sie Gewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 35 Millimetern vor, die mit 14 Millimetern Deckglaseinsätzen ausgestattet sind, indem Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit Rinderfibronektin in DPBS beschichten.

Entfernen Sie nach zwei Stunden die Fibronektin-Beschichtungslösung aus der Kulturschale. Ernten Sie HEK 293 T17-Zellen aus dem T25-Kolben, indem Sie zuerst die Zellmonoschicht mit drei Millilitern DPBS waschen und dann zwei Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen. Inkubieren Sie den Kolben etwa drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Sobald die Zellen aus dem Kolben gelöst sind, wird das Trypsin neutralisiert, indem vier Milliliter vollständiges Medium in den Kolben gegeben werden. Bestimmen Sie die Zellkonzentration in der Suspension, indem Sie sie in einem Zellzähler zählen. Stellen Sie dann die Zellkonzentration mit Wachstumsmedium auf ca. 80.000 Zellen pro Milliliter ein.

Geben Sie drei Milliliter der Zellsuspension in die Schale und kultivieren Sie sie über Nacht im Inkubator. Am nächsten Tag sollten die Zellen bei etwa 70 Prozent Konfluenz und einsatzbereit sein. Eine angemessene Zelldichte ist entscheidend für eine robuste und effiziente Markierung eines hohen Prozentsatzes der Zellen.

Bereiten Sie eine Milliliterlösung von DiO, DiO-Flüssigkristall-Nanopartikeln und DiO-Flüssigkristall-Nanopartikeln PEG-Cholesterin im Fördermedium vor, indem Sie die entsprechenden Stammlösungen verdünnen. Nehmen Sie das Wachstumsmedium mit einer serologischen Pipette aus den Kulturschalen und waschen Sie die Zellmonoschichten zweimal mit HEPES DMEM. Führen Sie die Spülgänge durch, indem Sie HEPES DMEM mit einer Pipette vorsichtig an den Rand des Geschirrs geben und dann entfernen.

Geben Sie 0,2 Milliliter der vorbereiteten DiO-freien oder DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel-Verabreichungslösungen in die Mitte der Kulturschalen. Stellen Sie die Schalen dann für einen angemessenen Zeitraum wieder in den Inkubator. Längere Inkubationszeiten führen zu einer unspezifischen zellulären Markierung von nicht-membranösen Bereichen.

Nach der Inkubationszeit entfernen Sie die Verabreichungslösungen mit einer serologischen Pipette. Waschen Sie die Zellmonoschichten zweimal mit DPBS und verwenden Sie bei jeder Wäsche zwei Milliliter. Fixieren Sie die Zellmonoschichten mit vier Prozent Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit zwei Millilitern DPBS. Nun sind die fixierten Zellen bereit, mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie auf das Vorhandensein eines membranösen Fluoreszenzsignals abgebildet zu werden. Auf einem Mikroskoptisch, der mit einer beheizten Inkubationskammer ausgestattet ist, wird die lebende Zellprobe mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet, um die Membranmarkierung zu beurteilen.

Wenn die Bildgebung nicht sofort durchgeführt wird, ersetzen Sie das Medium durch DPBS mit 0,05 Prozent Natriumazid und lagern Sie das Geschirr bei vier Grad Celsius. Bei dieser Methode werden Zellen mit DiO als FRET-Donor und DiI als FRET-Akzeptor co-markiert. Beschriften Sie die verkauften Produkte nacheinander mit DiO, Flüssigkristall, Nanopartikeln, PEG, Cholesterin und DiI-frei wie bisher.

Waschen Sie die Zellen nach dem Färben einmal mit zwei Milliletern DPBS mit einer serologischen Pipette und ersetzen Sie sie durch zwei Milliliter der Lebendzell-Bildgebungslösung. Auf einem Mikroskoptisch, der mit einer beheizten Inkubationskammer ausgestattet ist, wird die lebende Zellprobe mit einem konfokalen Mikroskop mit FRET-Bildgebung abgebildet. Konfigurieren Sie das Experiment für 30-Minuten-Intervalle über einen Zeitraum von vier Stunden, indem Sie den DiO-Donor bei 488 Nanometern anregen und mit einem 32-Kanal-Spektraldetektor vollständige Emissionsspektren sowohl des DiO-Donors als auch des DiI-Akzeptors von 490 bis 700 Nanometern sammeln.

Bestimmen Sie dann die zeitaufgelöste Emissionsintensität sowohl des DiO-Donors als auch des DiI-Akzeptors aus Zellen, die mit DiO, Flüssigkristall, Nanopartikeln, PEG, Cholesterin und DiI gefärbt wurden. Berechnen Sie abschließend das zeitaufgelöste FRET-Verhältnis des Akzeptorspenders für die Bilder, wie im Textprotokoll beschrieben. Freies DiO reichert sich unspezifisch im Zellinneren an und nicht in den Plasmamembranen der Zellen, die mit einem abgegrenzten Membranphospholipid gegengefärbt wurden.

Dies kann mit den zusammengefügten Bildern visualisiert werden. Umgekehrt markiert das DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel-PEG-Cholesterin spezifisch nur die Plasmamembran der Zelle, wie durch Kolokalisation mit dem markierten Membran-Phospholipid sichtbar gemacht wird. FRET bestätigt die Diopartitionierung vom Flüssigkristall-Nanopartikel in die Membranlipid-Doppelschicht durch eine beobachtete Erhöhung des Energietransfers vom DiO-Donor zum DiI-Akzeptor.

FRET zwischen DiO und DiI sowie DiO- und DiI-Emissionsänderungen bestätigen eine Erhöhung des FRET von DiO zu DiI in Abhängigkeit von der Zeit. Die DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel PEG-Cholesterin-Nanopartikel weisen eine minimale Zytotoxizität bei einer Lebensfähigkeit von 90 Prozent auf, verglichen mit einer signifikanten Toxizität für freies DiO bei einer Lebensfähigkeit von etwa 50 Prozent. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit Fracht beladene Flüssigkristall-Nanopartikel synthetisiert, sie für das zelluläre Targeting biofunktionalisiert und die mit Fracht beladenen Zellen für eine erfolgreiche zelluläre Abgabe abbildet.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die spezifische Abgabe von DiO aus der wässrigen Lösung an die Plasmamembran eine erhebliche Herausforderung darstellt. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, nachdem wir die Flüssigkristall-Nanopartikel-Plattform für die zelluläre Abgabe des Krebsmedikaments Doxorubicin verwendet hatten und ihre Fähigkeit sahen, die zelluläre Aufnahmekinetik des Medikaments zu modulieren. Nach diesem Verfahren kann dieser Ansatz für die zelluläre Abgabe einer Vielzahl von hydrophoben Frachten implementiert werden, die eine besondere Herausforderung in Bezug auf ihre Abgabe an Zellen aus wässrigen Medien darstellen.

Dieser Ansatz kann genutzt werden, um eine effizientere Verabreichung von membrangerichteten Medikamenten und bioaktiven Molekülen zu erreichen, wie z. B. spannungsempfindliche Farbstoffe für die Bildgebung des Gehirns oder photodynamische Medikamente für die photonisch unterstützte Arzneimitteltherapie.