Name: Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Erfahren Sie die gezielte Zellmembranlieferung hydrophober Wirkstoffe mit flüssigkristallinen Nanopartikeln in Säugetierzellen. Diese Methode verbessert die zelluläre Aufnahme und reduziert die Zytotoxizität erheblich.

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Diese Arbeit wurde von der NRL Basis Förderprogramm (Arbeitseinheit MA041-06-41-4943) unterstützt. ON wird von einem National Research Council Postdoctoral Forschung Associateship unterstützt.

1. Vorbereitung der OVI-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol <ol><li> Auflösen flüssigkristallines Diacrylat-Vernetzungsmittel (DACTP11, 45 mg), 3,3&#39;-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO, 2 mg) und einem Radikalinitiator (Azobisisobutyronitril, 1 mg) für die Polymerisation in 2 ml Chloroform gegeben. Fügen diese zu einer wässrigen Lösung von Acrylat-funktionalisierten Tensids (AC10COONa, 13 mg in 7 ml). </li><li> Rühre das Gemisch 1 h und beschallen bei 80% Amplitude für 5 min, um eine Miniemulsion herzustellen, das aus kleinen Tröpfchen des organischen Materials von polymerisierbarem Tensid in Wasser umgeben. </li><li> Das Gemisch wird auf 64 ° C in einem Ölbad zu initiieren die Polymerisation sowohl des Vernetzungsmittels und des Tensids, wie das Chloroform langsam verdampft, so dass eine DiO enthaltenden NP Suspension, die durch das oberflächenaktive Mittel stabilisiert ist. </li><li> Filtern Sie die NP-Suspension (3 mal) durch einen 0,2 &amp; mgr; m Spritzenfilter auf jede Aggregation zu entfernen. Store der gefilterten NP-Lösung bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Konjugation von PEG-Chol Dio-LCNP über EDC - Kopplung. <ol><li> Auflösen Chol-PEG-NH 2 · HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) in 25 mM HEPES - Puffer (pH 7,0). </li><li> Bereiten einer Arbeitslösung , enthaltend N -hydroxy-sulfosuccinimide Natriumsalz (NHSS, 40 mM) und 1-Ethyl-3- (3- (dimethylamino) -propyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC, 400 mM) in HEPES - Puffer aus konzentrierten Stammlösungen. </li><li> Sofort im 20 ul der frisch hergestellten Arbeitslösung von NHSS / EDC bis 1,0 ml der OVI-LCNP in HEPES-Puffer und rühre 5 min. </li><li> In 20 ul Stammlösung von Chol-PEG-NH 2 · HCl zu dieser Mischung und rühre 2 Stunden. </li><li> Zentrifuge kurz die Reaktionsmischung bei maximaler Geschwindigkeit (~ 2.000 × g) für 30 sec eine Tischplatte Mini - Zentrifuge und übergeben Sie den Überstand durch eine PD-10 Grßenausschlußchromatographie Säule 13 ins Gleichgewicht gebracht mitDulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 0,1x). </li></ol></li></ol> 2. Charakterisierung der OVI-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol <ol><li> Bestätigen Sie die erfolgreiche kovalente Konjugation von PEG-Chol zu DIO-LCNP Oberfläche durch Gelelektrophorese. <ol><li> Man löst 0,5 g Agarose in 50 ml (1x) Tris-Borat-Elektrophorese (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA) -Puffer. Die Lösung wird in einem Mikrowellenofen, um die Agarose aufzulösen. Lassen Sie die Lösung leicht abkühlen, und der Inhalt in eine Gelplatte in die Elektrophorese-Box gießen. Legen Sie eine Gelkamm zu Probenschächten erstellen. </li><li> Sobald das Gel erstarrt ist, fügen die erforderliche Menge (genug, um das Gel in die Kammer unterzutauchen) von TBE-Laufpuffer in die Kammer. </li><li> Mit 35 ul DiO-LCNP Probe (amended mit Glycerin, 5% v / v) in die Vertiefungen des Gels und bei einer Spannung von 110 V. 20 min laufen </li><li> Bild das Gel ein Gel Imaging-System wi mitth Anregungs- und Emissionsfilter bei 488 nm und 500-550 nm. </li></ol></li><li> Beurteilen Sie Partikelgröße und -verteilung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) von Dio-LCNP Lösung verdünnt (~ 200-fache Verdünnung) in PBS (pH ~ 8, 0,1x) und Messen auf einem DLS Instrument 14. Messen Sie die Zeta-Potential der OVI-LCNPs ein entsprechendes Zeta-Potential Messinstrument. </li></ol> 3. Herstellung von Zellkulturschalen für Lieferung Experimente und Imaging HINWEIS: DIO LCNP Kennzeichnung auf HEK 293T / 17 menschliche embryonale Nierenzellen (zwischen den Kanälen 5 und 15) durchgeführt wird , die kultiviert werden , wie zuvor 4 beschrieben. Führen Sie die Lieferung Experimente und die nachfolgende Zelle Bildgebung wie unten beschrieben. <ol><li> Vorbereitung 35 mm Durchmesser-Gewebekulturschalen (ausgestattet mit 14 mm No. 1 Abdeckglas Einsätze), indem sie mit bovine Fibronectin Beschichtung (~ 100 &amp; mgr; l bei einer Konzentration von 20 ug/ Ml) in DPBS 2 Stunden lang bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Fibronektin Beschichtungslösung von der Kulturschale. Ernte HEK 293 T1 / 7-Zellen aus dem T-25-Kolben, indem zuerst Waschen der Zellmonoschicht mit 3 ml DPBS und dann durch Zugabe von 2 ml Trypsin-EDTA (0,5% Trypsin-0,25% EDTA). </li><li> Inkubieren der Kolben bei 37 ° C für ~ 3 min. Entfernen Sie die Trypsin-EDTA und kehren die Kolben in den Inkubator. Sobald Zellen vom Kolben abgelöst werden, Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 4 ml vollständigem Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM; geänderte 10% fötalem Rinderserum, 5% Natriumpyruvat enthielt, und 5% Antibiotikum / Antimykotikum) in den Kolben . Bestimmen Sie die Zellkonzentration in der Suspension, indem sie in einem Zellzähler gezählt. </li><li> Stellen Sie die Zellkonzentration auf ~ 8 × 10 4 Zellen / ml mit Wachstumsmedium. 3 ml der Zellsuspension in die Schale und Kultur in den Inkubator über Nacht; Am nächsten Tag sollten die Zellen bei ~ 70% Konfluenz sein und sollten zur Verwendung bereit sein. AngemesseneZelldichte ist von entscheidender Bedeutung für eine robuste und effiziente Markierung von einem hohen Prozentsatz von Zellen. </li></ol> 4. Cellular Lieferung von DIO und DIO LCNPs und Bildgebung von fixierten Zellen <ol><li> Bereiten Sie 1 ml Lösungen Dio Dio-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol in Fördermedium (HEPES-DMEM; DMEM , das 25 mM HEPES) durch Verdünnen von Stammlösungen der OVI frei und DIO LCNPs; geeignete DiO Konzentrationen für die Inkubation auf Zellen werden ~ 1-10 uM (ausgedrückt als entweder die Konzentration der OVI frei oder Dio Form der OVI-LCNP). </li><li> Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Kulturschalen eine serologische Pipette und die Zellmonolayern waschen (siehe Schritt 3) zweimal mit HEPES-DMEM (je 2 ml Wasch). Führen Sie die Waschungen durch leichtes Hinzufügen und Entfernen von HEPES-DMEM eine Pipette zum / vom Rand der Speisen verwenden. </li><li> In 0,2 ml der vorbereiteten DiO frei oder DIO LCNP - Delivery - Lösungen zum Zentrum der Kulturschalen und geben die Gerichte an die incubator für einen angemessenen Zeitraum (typischerweise 15 oder 30 min, je nach den Bedürfnissen des Experimentes). Längere Inkubationszeiten in den mehr unspezifische zelluläre Kennzeichnung von nicht-membranartige Bereiche (zB Cytosol). </li><li> Nach der Inkubationszeit, entfernen Sie die Delivery-Lösungen eine serologische Pipette. Waschen Sie die Zellmonolayern zweimal mit DPBS (je 2 ml Wasch). Führen Sie die Waschungen durch leichtes Hinzufügen und Entfernen von DPBS zum / vom Rand der Schale. </li><li> Fix die Zellmonolayern unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd (hergestellt in DPBS) für 15 min bei Raumtemperatur. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist brennbar, ein Atmungsreizmittel, und ein Verdacht, karzinogen. </li><li> Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung mit einer Pipette und die Zellen vorsichtig 1-mal mit DPBS waschen (2 ml) durch Hinzufügen und Entfernen von DPBS zum / vom Rand der Gerichte mit Pipette. </li><li> Die fixierten Zellen sind bereit für die Anwesenheit eines membranösen Fluoreszenzsignal unter Verwendung von konfokaler Laserscanning abgebildet werdenMikroskopie (CLSM). Führen Sie die Bild sofort oder alternativ, ersetzen Sie das Medium mit DPBS mit 0,05% NaN 3 und speichern Sie die Gerichte bei 4 ° C. ACHTUNG: NaN 3 ist giftig; äußerste Vorsicht walten lassen, wenn man 3 NaN verwenden. HINWEIS: Feste Proben auf diese Weise gelagert werden, sollten innerhalb von 48 Stunden für optimale Ergebnisse abgebildet werden. </li></ol> 5. Cellular Lieferung von DIO und DIO LCNPs und FRET-Imaging in lebenden Zellen HINWEIS: In diesem Verfahren werden Zellen colabeled mit 6 &amp; mgr; M jedes DiO-LCNP-PEG-Chol (wobei DiO ein FRET-Donor) und 1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanin Perchlorat (DiI frei, wo Dil ist ein FRET - Akzeptor). Die Veröffentlichung der OVI von DiO-LCNP-PEG-Chol und dessen Einbau in die Plasmamembran wird durch eine beobachtete Zunahme der Energieübertragung von den DIO-Donor auf den Akzeptor Dil bestätigt. <ol><li> Label - Zellen nacheinander mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil free unter Verwendung der in Schritt beschriebenen Verfahren 4. </li><li> Nach dem Färben Waschen Sie die Zellen 1 mal mit DPBS (2 ml) einer serologischen Pipette und der Waschpuffer mit 2 ml Live Cell Imaging-Lösung (LCIS) ersetzen. </li><li> Auf einem Mikroskoptisch mit einem beheizten Inkubationskammer ausgestattet, Bild der Live-Zellprobe mit einem konfokalen Mikroskop (60x Objektiv) mit einem FRET-Imaging-Konfiguration in 30-Minuten-Intervallen über einen 4 Stunden-Zeitraum durch Anregung des DiO Spender bei 488 nm und das Sammeln volle Emission mit Spektren der beiden Dio Spender und Dil Akzeptor 490-700 nm mit einem 32-Kanal-spektral-Detektor. </li><li> HINWEIS: Weitere Informationen über FRET - Imaging finden Sie unter 15 verweisen. </li><li> Bestimmen Sie die zeitaufgelöste Emissionsintensität sowohl den DIO-Spender und Dil Akzeptor von Zellen gefärbt mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil. Berechnen Sie die zeitaufgelöste Akzeptor / Donor - FRET - Verhältnis (Dil emi / DiO EWI) für die Bilder, die stetig zunehmen wird und schließlich Platteau einmal die Menge der OVI Spender in die Membran unterteilt ist maximal 16 erreicht. </li></ol> 6. Zytotoxizitätstest von DIO und DIO LCNPs zu den HEK 293T / 17-Zellen HINWEIS: Die Zytotoxizität der OVI-LCNP Materialien bewertet wird 17 einen Tetrazoliumfarbstoffs basierten Proliferationstest verwendet wird . Zellen werden in einer Mikrotiterplatte in Gegenwart von variierenden Konzentrationen der Materialien unter Bedingungen, die Lieferung / Kennzeichnung emulieren. Die Zellen werden dann für 72 Stunden kultiviert Proliferation zu ermöglichen. Ein Farbstoff (MTS (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) wird dann zu den Vertiefungen und metabolisch aktiv Zellen wandeln den Farbstoff in einem blauen Formazan Produkt. die Menge an Farbbildung auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen direkt proportional ist. <ol><li> Ernte HEK 293 T1 / 7-Zellen aus dem T-25-Kolben durch das Verfahren beschrieben in Schritt folgenden 3.2.SeedHEK 293T / 17-Zellen (5000 Zellen / 100 ul / Vertiefung) zu den Vertiefungen einer 96-Well-Gewebekultur-behandelte Platte und die Kultur für 24 Std. </li><li> Entfernen Sie vollständig die Kulturmedien aus den Vertiefungen mit einer Mikropipette und 50 ul HEPES-DMEM frei dio-LCNPs oder DiO-LCNP-PEG-Chol bei steigenden Konzentrationen Brunnen zu replizieren enthält DiO hinzuzufügen. Inkubieren auf die Zellen bei 37 ° C für 30 min. HINWEIS: In der Regel Replikaten in dreifacher Ausfertigung oder vierfacher Ausfertigung durchgeführt sind ausreichend statistisch zuverlässige Daten zu erhalten. <ol><li> Nach der Inkubation, entfernen Sie das Fördermedium die Materialien mit einer Mikropipette und ersetzen Sie es mit 100 ul Wachstumsmedium enthält. Kultur die Zellen für 72 Stunden. </li></ol></li><li> In 20 ul des Tetrazolium-Substrat in jede Vertiefung, kehren die Platte in den Inkubator und lassen die Farbbildung bei 37 ° C für 4 Stunden, um fortzufahren. Die optische Dichte (abs) des Formazanprodukts bei 570 nm (Absorptionsminima für die OVI-LCNPs in diesem stu verwendetdy) und 650 nm (für die Subtraktion der unspezifischen Hintergrundabsorption) eines Mikrotiterplatten-Lesegerät verwenden. </li><li> Plotten des Differenzabsorptionswert (abs 570 - abs 650) gegenüber der Materialkonzentration und berichten die Ergebnisse als Prozent der Kontrolle der Zellproliferation (Grad der Proliferation von Zellen in Zellkulturmedium only). </li></ol> 7. Datenanalyse <ol><li> Statistisch gesehen, die Daten mit einer univariaten Varianzanalyse (ANOVA) analysiert werden. Für multiple Vergleiche gelten die post-hoc-Test nach Bonferroni. Geben Sie alle Mittelwerte als ± Standardabweichung vom Mittelwert (SEM), sofern nicht anders angegeben. HINWEIS: Die akzeptable Wahrscheinlichkeit für Signifikanz war p &lt;0,05. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Ein ständiges Ziel der NMDD ist die kontrollierte Ausrichtung und Abgabe von Arzneimittelformulierungen an Zellen und Geweben, bei gleichzeitiger Verbesserung der Wirksamkeit von Medikamenten kombiniert. Eine spezielle Klasse von Arzneimittelmolekülen, für die dies eine große Herausforderung gestellt hat, hydrophobe Arzneimittel / Abbildungsmittel, die schwer bis gar keine Löslichkeit in wäßrigen Medien aufweisen. Dieses Problem ist der Übergang von wirksamen Arzneimitteln aus in vitro - Zellkultursysteme zur k...

Seit dem Aufkommen der Schnittstelle Nanomaterialien (Materialien ≤100 nm in mindestens einer Dimension) mit lebenden Zellen, ein kontinuierliches Ziel wurde für verschiedene Anwendungen Vorteile der einzigartigen größenabhängigen Eigenschaften von Nanopartikeln (NPs) zu nehmen. Diese Anwendungen umfassen die Zell- und Gewebemarkierungs / imaging (sowohl in vitro als auch in vivo), Echtzeiterfassung, und die gesteuerte Abgabe von Arzneimitteln und anderen cargos 1. Beispiele für solche relevanten NP Eigenschaften umfassen die größenabhängige Emission von Halbleiter-Nanokristallen (Quantum Dots, QD); die Eigenschaften Lichtwärmeumsetzmaterial von Gold-Nanopartikeln; die große Ladekapazität des wässrigen Kern von Liposomen; und die ballistische Leitfähigkeit von Kohlenstoffallotrope, wie einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren und Graphen. In jüngerer Zeit hat großes Interesse an der Verwendung von NPs für die kontrollierte Modulation von Arzneimitteln und anderen Frachten, wie Kontrast / Abbildungs ​​a entstandenHerren. Hier ist das Grundprinzip deutlich zu verbessern / optimieren den gesamten Löslichkeit abgegebenen Dosis, Kreislaufzeit und eventuelle Clearance des Arzneimittels Ladung durch sie als NP-Formulierung zu liefern. Dies hat sich als NP-vermittelte Arzneimittelabgabe bekannt sein (NMDD), und es gibt derzeit sieben FDA-zugelassenen NP Arzneimittel-Formulierungen für den Einsatz in der Klinik verschiedene Krebsarten und Hunderte mehr in verschiedenen Phasen der klinischen Studien zu behandeln. Im Wesentlichen ist es das Ziel, &quot;mehr mit weniger zu erreichen;&quot; Das heißt, das NP als Gerüst zu verwenden , um mehr Medikament mit weniger Dosierungs Verabreichungen liefern durch Ausnutzung der großen Oberflächenbereich einnehmen: Volumen (beispielsweise harte Partikel, wie QD und Metalloxiden) von NPs oder deren großen Innenvolumen zum Beladen große Fracht Nutzlasten (zB Liposomen oder Mizellen). Der Zweck ist hier die Notwendigkeit für mehrere systemisch zugeDosierungsSchemata zu reduzieren, während gleichzeitig die wässrige Stabilität und eine verbesserte Durchblutung fördern, insbesondere füranspruchsvolle hydrophobe Arzneimittel cargos, die zwar hochwirksam, in wässrigen Medien schwer löslich sind. Somit war das Ziel der hierin beschriebene Arbeit, die Lebensfähigkeit der Verwendung eines neuen NP-Gerüst für die spezifische und gesteuerte Abgabe von hydrophoben cargos dem lipophilen Plasmamembran-Doppelschicht zu bestimmen. Die Motivation für die Arbeit war die inhärente begrenzte Löslichkeit und die Schwierigkeit bei der Bereitstellung von hydrophoben Molekülen an Zellen aus wäßrigen Medien. Typischerweise erfordert die Lieferung solcher hydrophoben Molekülen die Verwendung von organischen Lösungsmitteln (beispielsweise DMSO) oder amphiphile Tenside (beispielsweise Poloxamere), die 2 oder Mizelle Träger toxischen und Kompromisse Zell- und Gewebelebensfähigkeit sein kann, die interne Belastung begrenzt haben kann Kapazitäten. Der NP Träger ausgewählt hier war eine neue Flüssigkristall NP (LCNP) Formulierung zuvor 3 entwickelt und dass zuvor eine ~ 40-fache zu erreichen gezeigt worden war<html> Verbesserung der Wirksamkeit des Antikrebsmedikament Doxorubicin in kultivierten Zellen 4. In der hier beschriebenen Arbeiten wählte die repräsentative Ladung war die potentiometrischen Membranfarbstoff, 3,3&#39;-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO). DiO ist ein wasserunlöslicher Farbstoff, der für die anterograde und retrograden Tracing in lebenden und fixierten Neuronen, Membranpotentialmessungen verwendet wurde und für die allgemeine Kennzeichnung Membran 5, 6, 7, 8, 9. Aufgrund seiner hydrophoben Natur ist DiO typischerweise direkt zu Zellmonolayern oder Geweben in einer kristallinen Form 10, oder es wird in sehr hohen Konzentrationen inkubiert (~ 1-20 uM) nach Verdünnung von einer Konzentration Stammlösung 11, 12. content &quot;&gt; Hierbei ist die Vorgehensweise war die Verwendung zur LCNP Plattform, ein multifunktionales NP, dessen innere Kern vollständig hydrophob ist und deren Oberfläche gleichzeitig hydrophile und zugänglich Biokonjugation, als Abgabevehikel für DiO. DiO in die LCNP Kern während der Synthese eingearbeitet und die NP Oberfläche dann mit einem PEGylierten Cholesterin-Einheit zu fördern, um die Bindung an die Membran der OVI-LCNP Ensemble an der Plasmamembran. Dieser Ansatz führte zu einem Abgabesystem, das partitioniert Dio in die Plasmamembran mit größerer Treue und Membran Residenz funktionalisiert ist Zeit als die freie Form von DiO von Massenlösung geliefert (DIO frei). Ferner ist dieses Verfahren zeigte , dass die LCNP-vermittelte Abgabe von DiO moduliert wesentlich und treibt die Rate der spezifischen Unterteilung des Farbstoffes in die lipophile Plasmamembran bilayer. Dies ist erreicht, während gleichzeitig die Zytotoxizität des freien Arzneimittels von ~ 40% zu reduzieren, indem es als LCNP Formulierung zu liefern. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Es wird erwartet, dass die hier beschriebene Methode eine leistungsstarke ermöglicht Technik für die Forscher, deren Arbeit mit sein wird oder erfordert die zelluläre Bereitstellung von stark hydrophoben Frachten, die schwer löslich oder vollständig unlöslich in wässriger Lösung sind.

<table><tbody><tr><td>1-Ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimidhydrochlorid (EDCA)</td><td>ThermoFisher</td><td>E2247</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat (DiO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292-20MG</td><td>Gefährlich; Herstellung einer Stammlösung in DMSO</td></tr><tr><td>Cholesterin Poly(ethylenglykol) aminhydrochlorid</td><td>Nanocs, Inc.</td><td>PG2-AMCS-2k</td><td></td></tr><tr><td>Countess automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Dioctadecyl-3,3,3&prime; &#8288;,3&prime;-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Gefährlich; Stofflösung in DMSO herstellen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Warm in 37 μd; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14040182</td><td>Warm in 37 & Grad; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Dynamisches Lichtstreugerät</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin Rinderprotein, Plasma</td><td>ThermoFisher</td><td>33010018</td><td>Herstellung einer Stammlösung 1 mg/ml mit DPBS. Verwenden Sie 20-30 & Mikro; g/ml für die Beschichtung der MetTek-Schale, 2 Std. bei 37 &°; C</td></tr><tr><td>Formaldehyd (16%, W/V)</td><td>ThermoFisher</td><td>28906</td><td>Gefährlich; mit DPBS auf 4% verdünnen</td></tr><tr><td>Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK 293T/17)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC&reg; CRL-11268&Handel;</td><td></td></tr><tr><td>Lebendzell-Imaging-Lösung (LCIS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>Warm in 37 °; C vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>MatTek 14 mm # 1.0 Deckglaseinsatz Zellkulturschale</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Modified Eagle Medium (DMEM) mit 25 mM HEPES</td><td>ThermoFisher 21063045</td><td></td><td>Warm in 37 °; C vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz (NHSS)</td><td>ThermoFisher</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1si konfokales Spektralmikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Fleck (0,4%)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>mischt 50% der Zellsuspension zu, bevor die Zellen gezählt</td></tr><tr><td>werden Zeta-potentielles Instrument</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallprozessor</td><td>Sonics and Materials Inc</td><td>GEX 600-5</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cetntrifuge</td><td>Benchmark</td><td>Mini-fuge-04477</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex&trade; G-25 Medium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc XRS Bildgebungssystem</td><td>Bio-RAD</td><td>76S/07434</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

gezielte plasma membrane lieferung eines hydrophobic transport encapsulated in einem liquid crystal nanoparticle träger

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

Die kontrollierte Abgabe von Arzneimittel / Abbildungsmittel für Zellen ist entscheidend für die Entwicklung von Therapeutika und für die Untersuchung von zellulären Signalprozessen. Vor kurzem Nanopartikel (NPs) sehr vielversprechend sind in der Entwicklung solcher Abgabesysteme gezeigt. Hierbei wird ein Flüssigkristall NP (LCNP) basierende Verabreichungssystem wurde für die kontrollierte Abgabe eines wasserunlöslichen Farbstoff eingesetzt, 3,3&#39;-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO), von innerhalb des NP Kern zu den hydrophoben Bereich eines Plasma Membran-Doppelschicht. Während der Synthese der NPs wurde der Farbstoff effizient in den hydrophoben Kern LCNP eingebaut, wie bestätigt durch mehrere spektroskopische Analysen. Konjugation eines PEGylierten Cholesterinderivat zur NP Oberfläche (DIO-LCNP-PEG-Chol) aktiviert die Bindung der farbstoffbeladenen NPs an die Plasmamembran in HEK 293T / 17-Zellen. Zeitaufgelöste Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung bestätigte den Passive Efflux von DiO vom LCNP Kern und seine Insertion in die Plasmamembran-Doppelschicht. Schließlich abgeschwächt die Lieferung der OVI als LCNP-PEG-Chol die Zytotoxizität von DiO; die NP Form Dio ausgestellt ~ 30-40% geringere Toxizität im Vergleich zu DiO frei von Massenlösung geliefert. Dieser Ansatz zeigt die Nützlichkeit der LCNP Plattform als effiziente Modalität für die membranspezifische Abgabe und Modulation der hydrophoben Molekül cargos.

LCNPs wurden, in denen der hydrophobe Kern des NP, hergestellt mit einem repräsentativen membranMarkierungsSonde geladen wurde die Nützlichkeit des LCNP als effizientes Abgabevehikel für hydrophobe Frachten zu demonstrieren. Zu diesem Zweck gewählte Ladung war sehr wasserunlöslichen potentiometrische membranMarkierungsFarbstoff, DiO. DiO belasteten LCNPs (DIO-LCNPs) wurden unter Verwendung synthetisiert ein zweiphasiges Miniemulsionstechnik mit der chemischen Komponenten DACTP11, AC10COONa und DiO, wie in Abbild...

Eine Flüssigkristall-Nanopartikel (LCNP) Nanotransporter wird als Träger für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Ladung an die Plasmamembran lebender Zellen ausgenutzt.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, ein auf Flüssigkristallen basierendes Nanopartikel als Plattform für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Doppelladungs-Transports zu verwenden, um diesen gezielt an den lipophilen Bereich der Plasmamembran lebender Säugetierzellen abzugeben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Arzneimittelabgabe zu beantworten, beispielsweise wie die effiziente Abgabe und zelluläre Aufnahme schlecht wasserlöslicher hydrophober Frachten ermöglicht werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine spezifischere Abgabe membrangestützter hydrophober Frachten an die Plasmamembran ermöglicht und gleichzeitig deren zelluläre Toxizität verringert.Den Vorgang wird Dr. Okhil Nag, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung von DiO-Flüssigkristall-Nanopartikeln, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie anschließend 20 µL frisch zubereitete Arbeitslösung von NHSS/EDC zu 1,0 mL der DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel in HEPES-Puffer.Und fünf Minuten lang rühren. Als Nächstes 20 µL einer Stammlösung von Cholesterin-PEG-Amin zu dieser Mischung geben und zwei Stunden lang rühren. Nach zwei Stunden die Reaktionsmischung kurzzeitig mit maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden in einer Tischminizentrifuge zentrifugieren.Anschließend das Überstand durch eine mit Dulbeccos gepuffertem phosphathaltigem Salzlösung äquilibrierte PD-10-Größenausschluss-Chromatographiesäule leiten. Um die erfolgreiche kovalente Konjugation von PEG-Cholesterin an die Oberfläche der DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel mittels Gelelektrophorese zu bestätigen, ein Agarosegel wie im Textprotokoll beschrieben herstellen. Sobald das Gel erstarrt ist, ausreichend TBE-Laufpuffer hinzufügen, um das Gel in der Kammer zu überdecken.Anschließend 35 Mikroliter der DiO-Flüssigkristall-Nanopartikelprobe in die Vertiefungen des Gels geben und 20 Minuten bei einer Spannung von 110 Volt laufen lassen. Das Gel mit einem Gel-Imaging-System unter Verwendung eines Anregungsfilters bei 488 Nanometern und Emissionsfiltern von 500 bis 550 Nanometern aufnehmen. 35 Millimeter durchmessende Zellkultur-Schalen, ausgestattet mit 14 Millimeter großen Deckgläsern der Sorte eins, vorbereiten, indem sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit bovinem Fibronectin in DPBS beschichtet werden.Nach zwei Stunden die Fibronectin-Beschichtungsl&ouml;sung aus der Kulturschale entfernen. Die HEK 293 T17-Zellen aus dem T25-Fl&auml;schchen gewinnen, indem man zuerst die Zellmonoschicht mit drei Milliliter DPBS w&auml;scht und anschlie&szlig;end zwei Milliliter Trypsin-EDTA hinzuf&uuml;gt. Das Fl&auml;schchen etwa drei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nachdem die Zellen vom Kolben gelöst wurden, neutralisieren Sie die Trypsin-Behandlung, indem Sie vier Milliliter komplettes Medium zum Kolben hinzufügen. Bestimmen Sie die Zellkonzentration in der Suspension durch Zählen in einem Zellzähler. Stellen Sie anschließend die Zellkonzentration mit Wachstumsmedium auf etwa 80.000 Zellen pro Milliliter ein.Geben Sie drei Milliliter der Zellsuspension in die Schale und kultivieren Sie sie über Nacht im Inkubator. Am nächsten Tag sollten die Zellen eine Konfluenz von etwa 70 Prozent erreicht haben und gebrauchsfertig sein. Eine ausreichende Zelldichte ist entscheidend für eine robuste und effiziente Markierung eines hohen Prozentsatzes der Zellen.Bereiten Sie eintausend Milliliter-Lösungen von DiO, DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel und DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel PEG-Cholesterin im Liefermedium durch Verdünnung der entsprechenden Stammlösungen vor. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Kulturschalen mithilfe einer serologischen Pipette und waschen Sie die Zellmonolagen zweimal mit HEPES DMEM. Führen Sie die Waschschritte durch, indem Sie mit einer Pipette vorsichtig HEPES DMEM an den Rand der Schalen geben und es anschließend wieder entfernen.Geben Sie 0,2 Milliliter der hergestellten DiO-freien oder DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel-Lieferlösung in die Mitte der Kulturschalen. Anschließend kehren Sie die Schalen für einen geeigneten Zeitraum in den Inkubator zurück. Längere Inkubationszeiten führen zu unspezifischer Zellmarkierung nicht membranöser Bereiche.Nach der Inkubationszeit entfernen Sie die Applikationslösungen mit einer serologischen Pipette. Waschen Sie die Zellmonolagen zweimal mit DPBS, wobei Sie für jede Waschung zwei Milliliter verwenden. Fixieren Sie die Zellmonolagen mit vier Prozent Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen vorsichtig einmal mit zwei Millilitern DPBS. Die fixierten Zellen sind nun bereit, auf das Vorhandensein eines membranösen fluoreszierenden Signals mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht zu werden. Bilden Sie die lebende Zellprobe auf einem Mikroskoptisch, der mit einer beheizten Inkubationskammer ausgestattet ist, mithilfe eines konfokalen Mikroskops ab, um die Markierung der Membran zu beurteilen.Wenn die Bildgebung nicht unmittelbar durchgeführt wird, ersetzen Sie das Medium durch DPBS, das 0,05 Prozent Natriumazid enthält, und lagern Sie die Schalen bei vier Grad Celsius. Bei dieser Methode werden die Zellen gleichzeitig mit DiO als FRET-Donor und DiI als FRET-Akzeptor markiert. Markieren Sie die Zellen nacheinander wie zuvor mit DiO-Flüssigkristall-Nanopartikeln, PEG-Cholesterin, und freiem DiI.Nach der Färbung die Zellen einmal mit zwei Milliliter DPBS unter Verwendung einer serologischen Pipette waschen und durch zwei Milliliter der Live-Cell-Imaging-Lösung ersetzen. Auf einer Mikroskopbühne, die mit einer beheizten Inkubationskammer ausgestattet ist, die Live-Cell-Probe mittels eines konfokalen Mikroskops mit FRET-Imaging aufnehmen. Konfigurieren Sie das Experiment für 30-minütige Intervalle über einen Zeitraum von vier Stunden, indem der DiO-Donor bei 488 Nanometern angeregt wird und volle Emissionsspektren sowohl des DiO-Donors als auch des DiI-Akzeptors von 490 bis 700 Nanometern mit einem 32-Kanal-Spektrodetektor aufgezeichnet werden.Anschließend bestimmen Sie die zeitlich aufgelöste Emissionsintensität sowohl des DiO-Donors als auch des DiI-Akzeptors aus Zellen, die mit flüssigkristallinen DiO-Nanopartikeln aus PEG-Cholesterin und DiI gefärbt wurden. Abschließend berechnen Sie das zeitlich aufgelöste Akzeptor-Donor-FRET-Verhältnis für die Bilder, wie im Textprotokoll beschrieben. Freies DiO reichert sich unspezifisch im Zellinneren an, statt in den Plasmamembranen der Zellen, die mit einem mit Dil markierten Membranphospholipid gegengefärbt wurden.Dies kann anhand der überlagerten Bilder veranschaulicht werden. Umgekehrt markiert das flüssigkristalline DiO-Nanopartikel-PEG-Cholesterin spezifisch lediglich die Plasmamembran der Zelle, wie durch die Kolokalisation mit dem mit Dil markierten Membranphospholipid sichtbar wird. FRET bestätigt die Verteilung von DiO aus dem flüssigkristallinen Nanopartikel in die lipidische Doppelschicht der Membran durch einen beobachteten Anstieg des Energietransfers vom DiO-Donor zum DiI-Akzeptor.Der FRET zwischen DiO und DiI sowie die Änderungen der DiO- und DiI-Emission bestätigen einen zeitabhängigen Anstieg des FRET von DiO zu DiI. Die flüssigkristallinen DiO-Nanopartikel mit PEG-Cholesterin weisen eine minimale Zytotoxizität bei einer Vitalität von 90 Prozent auf, verglichen mit einer erheblichen Toxizität von freiem DiO bei etwa 50 Prozent Vitalität. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man beladene flüssigkristalline Nanopartikel synthetisiert, sie zur zellulären Zielsteuerung biofunktionalisiert und die beladenen Zellen zur Bestätigung einer erfolgreichen zellulären Abgabe abbildet.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die gezielte Abgabe von DiO aus wässriger Lösung an die Plasmamembran eine erhebliche Herausforderung darstellt. Wir entwickelten die Idee zu dieser Methode erstmals, nachdem wir die flüssigkristalline Nanopartikelplattform zur zellulären Abgabe des Antikrebsmittels Doxorubicin verwendet und deren Fähigkeit beobachtet hatten, die zelluläre Aufnahmekinetik des Wirkstoffs zu modulieren. Mit dieser Vorgehensweise kann die Methode auf die zelluläre Abgabe einer breiten Palette hydrophober Substanzen angewandt werden, die insbesondere hinsichtlich ihrer Verabreichung an Zellen aus wässrigen Medien eine besondere Herausforderung darstellen.Dieser Ansatz kann genutzt werden, um eine effizientere Abgabe von membranzielgerichteten Arzneimitteln und bioaktiven Molekülen zu erreichen, wie beispielsweise spannungsabhängige Farbstoffe für die Bildgebung des Gehirns oder photodynamische Arzneimittel für die photonengestützte Arzneimitteltherapie.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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