Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, ein auf Flüssigkristallen basierendes Nanopartikel als Plattform für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Doppelladungs-Transports zu verwenden, um diesen gezielt an den lipophilen Bereich der Plasmamembran lebender Säugetierzellen abzugeben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Arzneimittelabgabe zu beantworten, beispielsweise wie die effiziente Abgabe und zelluläre Aufnahme schlecht wasserlöslicher hydrophober Frachten ermöglicht werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine spezifischere Abgabe membrangestützter hydrophober Frachten an die Plasmamembran ermöglicht und gleichzeitig deren zelluläre Toxizität verringert.

Den Vorgang wird Dr. Okhil Nag, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung von DiO-Flüssigkristall-Nanopartikeln, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie anschließend 20 µL frisch zubereitete Arbeitslösung von NHSS/EDC zu 1,0 mL der DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel in HEPES-Puffer.

Und fünf Minuten lang rühren. Als Nächstes 20 µL einer Stammlösung von Cholesterin-PEG-Amin zu dieser Mischung geben und zwei Stunden lang rühren. Nach zwei Stunden die Reaktionsmischung kurzzeitig mit maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden in einer Tischminizentrifuge zentrifugieren.

Anschließend das Überstand durch eine mit Dulbeccos gepuffertem phosphathaltigem Salzlösung äquilibrierte PD-10-Größenausschluss-Chromatographiesäule leiten. Um die erfolgreiche kovalente Konjugation von PEG-Cholesterin an die Oberfläche der DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel mittels Gelelektrophorese zu bestätigen, ein Agarosegel wie im Textprotokoll beschrieben herstellen. Sobald das Gel erstarrt ist, ausreichend TBE-Laufpuffer hinzufügen, um das Gel in der Kammer zu überdecken.

Anschließend 35 Mikroliter der DiO-Flüssigkristall-Nanopartikelprobe in die Vertiefungen des Gels geben und 20 Minuten bei einer Spannung von 110 Volt laufen lassen. Das Gel mit einem Gel-Imaging-System unter Verwendung eines Anregungsfilters bei 488 Nanometern und Emissionsfiltern von 500 bis 550 Nanometern aufnehmen. 35 Millimeter durchmessende Zellkultur-Schalen, ausgestattet mit 14 Millimeter großen Deckgläsern der Sorte eins, vorbereiten, indem sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit bovinem Fibronectin in DPBS beschichtet werden.

Nach zwei Stunden die Fibronectin-Beschichtungslösung aus der Kulturschale entfernen. Die HEK 293 T17-Zellen aus dem T25-Fläschchen gewinnen, indem man zuerst die Zellmonoschicht mit drei Milliliter DPBS wäscht und anschließend zwei Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügt. Das Fläschchen etwa drei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nachdem die Zellen vom Kolben gelöst wurden, neutralisieren Sie die Trypsin-Behandlung, indem Sie vier Milliliter komplettes Medium zum Kolben hinzufügen. Bestimmen Sie die Zellkonzentration in der Suspension durch Zählen in einem Zellzähler. Stellen Sie anschließend die Zellkonzentration mit Wachstumsmedium auf etwa 80.000 Zellen pro Milliliter ein.

Geben Sie drei Milliliter der Zellsuspension in die Schale und kultivieren Sie sie über Nacht im Inkubator. Am nächsten Tag sollten die Zellen eine Konfluenz von etwa 70 Prozent erreicht haben und gebrauchsfertig sein. Eine ausreichende Zelldichte ist entscheidend für eine robuste und effiziente Markierung eines hohen Prozentsatzes der Zellen.

Bereiten Sie eintausend Milliliter-Lösungen von DiO, DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel und DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel PEG-Cholesterin im Liefermedium durch Verdünnung der entsprechenden Stammlösungen vor. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Kulturschalen mithilfe einer serologischen Pipette und waschen Sie die Zellmonolagen zweimal mit HEPES DMEM. Führen Sie die Waschschritte durch, indem Sie mit einer Pipette vorsichtig HEPES DMEM an den Rand der Schalen geben und es anschließend wieder entfernen.

Geben Sie 0,2 Milliliter der hergestellten DiO-freien oder DiO-Flüssigkristall-Nanopartikel-Lieferlösung in die Mitte der Kulturschalen. Anschließend kehren Sie die Schalen für einen geeigneten Zeitraum in den Inkubator zurück. Längere Inkubationszeiten führen zu unspezifischer Zellmarkierung nicht membranöser Bereiche.

Nach der Inkubationszeit entfernen Sie die Applikationslösungen mit einer serologischen Pipette. Waschen Sie die Zellmonolagen zweimal mit DPBS, wobei Sie für jede Waschung zwei Milliliter verwenden. Fixieren Sie die Zellmonolagen mit vier Prozent Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen vorsichtig einmal mit zwei Millilitern DPBS. Die fixierten Zellen sind nun bereit, auf das Vorhandensein eines membranösen fluoreszierenden Signals mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht zu werden. Bilden Sie die lebende Zellprobe auf einem Mikroskoptisch, der mit einer beheizten Inkubationskammer ausgestattet ist, mithilfe eines konfokalen Mikroskops ab, um die Markierung der Membran zu beurteilen.

Wenn die Bildgebung nicht unmittelbar durchgeführt wird, ersetzen Sie das Medium durch DPBS, das 0,05 Prozent Natriumazid enthält, und lagern Sie die Schalen bei vier Grad Celsius. Bei dieser Methode werden die Zellen gleichzeitig mit DiO als FRET-Donor und DiI als FRET-Akzeptor markiert. Markieren Sie die Zellen nacheinander wie zuvor mit DiO-Flüssigkristall-Nanopartikeln, PEG-Cholesterin, und freiem DiI.

Nach der Färbung die Zellen einmal mit zwei Milliliter DPBS unter Verwendung einer serologischen Pipette waschen und durch zwei Milliliter der Live-Cell-Imaging-Lösung ersetzen. Auf einer Mikroskopbühne, die mit einer beheizten Inkubationskammer ausgestattet ist, die Live-Cell-Probe mittels eines konfokalen Mikroskops mit FRET-Imaging aufnehmen. Konfigurieren Sie das Experiment für 30-minütige Intervalle über einen Zeitraum von vier Stunden, indem der DiO-Donor bei 488 Nanometern angeregt wird und volle Emissionsspektren sowohl des DiO-Donors als auch des DiI-Akzeptors von 490 bis 700 Nanometern mit einem 32-Kanal-Spektrodetektor aufgezeichnet werden.

Anschließend bestimmen Sie die zeitlich aufgelöste Emissionsintensität sowohl des DiO-Donors als auch des DiI-Akzeptors aus Zellen, die mit flüssigkristallinen DiO-Nanopartikeln aus PEG-Cholesterin und DiI gefärbt wurden. Abschließend berechnen Sie das zeitlich aufgelöste Akzeptor-Donor-FRET-Verhältnis für die Bilder, wie im Textprotokoll beschrieben. Freies DiO reichert sich unspezifisch im Zellinneren an, statt in den Plasmamembranen der Zellen, die mit einem mit Dil markierten Membranphospholipid gegengefärbt wurden.

Dies kann anhand der überlagerten Bilder veranschaulicht werden. Umgekehrt markiert das flüssigkristalline DiO-Nanopartikel-PEG-Cholesterin spezifisch lediglich die Plasmamembran der Zelle, wie durch die Kolokalisation mit dem mit Dil markierten Membranphospholipid sichtbar wird. FRET bestätigt die Verteilung von DiO aus dem flüssigkristallinen Nanopartikel in die lipidische Doppelschicht der Membran durch einen beobachteten Anstieg des Energietransfers vom DiO-Donor zum DiI-Akzeptor.

Der FRET zwischen DiO und DiI sowie die Änderungen der DiO- und DiI-Emission bestätigen einen zeitabhängigen Anstieg des FRET von DiO zu DiI. Die flüssigkristallinen DiO-Nanopartikel mit PEG-Cholesterin weisen eine minimale Zytotoxizität bei einer Vitalität von 90 Prozent auf, verglichen mit einer erheblichen Toxizität von freiem DiO bei etwa 50 Prozent Vitalität. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man beladene flüssigkristalline Nanopartikel synthetisiert, sie zur zellulären Zielsteuerung biofunktionalisiert und die beladenen Zellen zur Bestätigung einer erfolgreichen zellulären Abgabe abbildet.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die gezielte Abgabe von DiO aus wässriger Lösung an die Plasmamembran eine erhebliche Herausforderung darstellt. Wir entwickelten die Idee zu dieser Methode erstmals, nachdem wir die flüssigkristalline Nanopartikelplattform zur zellulären Abgabe des Antikrebsmittels Doxorubicin verwendet und deren Fähigkeit beobachtet hatten, die zelluläre Aufnahmekinetik des Wirkstoffs zu modulieren. Mit dieser Vorgehensweise kann die Methode auf die zelluläre Abgabe einer breiten Palette hydrophober Substanzen angewandt werden, die insbesondere hinsichtlich ihrer Verabreichung an Zellen aus wässrigen Medien eine besondere Herausforderung darstellen.

Dieser Ansatz kann genutzt werden, um eine effizientere Abgabe von membranzielgerichteten Arzneimitteln und bioaktiven Molekülen zu erreichen, wie beispielsweise spannungsabhängige Farbstoffe für die Bildgebung des Gehirns oder photodynamische Arzneimittel für die photonengestützte Arzneimitteltherapie.