3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration
27. April 2017
Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.
Das übergeordnete Ziel dieser magnetischen Zellaggregations- und dynamischen Reifungsmethode ist es, die in vitro Chondrogenese von mesenchymalen Stromazellen oder MSCs zu verbessern. Die magnetische Aggregation von Stammzellen anstelle der Chondrogenese als Zellkondensation ist ein früher wichtiger Schritt des Knorpelregenerationsprozesses. Nachdem die Stammzellen in Gerüste eingeschlossen wurden, können die Gerüste in den zellulären Bioreaktor gebracht werden, um die dynamische Reifung der Zellen zu beurteilen.
Die wichtige Dynamikmethode kann auf andere Biosysteme wie Muskel-, Herz- oder Gefäßreparatur angewendet werden. Aber wie Sie sehen werden, eignet es sich sehr gut für die Regeneration des Knorpels. Die visuelle Demonstration der magnetischen Zellaussaat und der dynamischen Zellreifung am eigentlichen Bioreaktor ist von entscheidender Bedeutung, da diese beiden Techniken nur schwer mit Textanweisungen zu erlernen sind.
Um die Mikromagnetvorrichtung für die Aggregatbildung zu konstruieren, führen Sie zunächst eine Magnetspitze mit einem Durchmesser von 750 Mikrometern in jedes drei Zentimeter große Loch in eine sechs Millimeter dicke Aluminiumplatte ein und legen Sie die Platte über einen permanenten Neodym-Magneten. Um eine Vorrichtung für die Gerüstaussaat zu konstruieren, schneidet man zunächst hartes Polystyrol in 2,4 Quadratzentimeter große Quadrate und setzt drei Millimeter Durchmesser und sechs Millimeter lange Magnete in gleichem Abstand auf einer Fläche von 1,6 Quadratzentimetern ein. Platzieren Sie dann das Gerät über einem Neodym-Permanentmagneten.
Um menschliche MSCs zu markieren, kultivieren Sie die Stammzellen zunächst in vollständigem MSC-Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius bei 5 % Kohlendioxid, bis sie zu 90 % konfluent sind. Aspirieren und spülen Sie die Zellen dann mit Serum drei RPMI-Medium ohne Glutamin und fügen Sie 10 Milliliter Eisenoxid-Nanopartikellösung pro 150 Quadratzentimeter Kulturkolben für eine 30-minütige Inkubation im Zellkultur-Inkubator hinzu. Spülen Sie die Zellen am Ende der Inkubation fünf Minuten lang mit Serum drei RPMI-Medium ohne Glutamin, um die Nanopartikel zu internalisieren, die noch an der Plasmamembran haften.
Ersetzen Sie dann das RPMI in jedem Kolben durch 25 Milliliter vollständiges MSC-Wachstumsmedium und stellen Sie die Zellen über Nacht wieder in den Zellkultur-Inkubator ein. Am nächsten Morgen lösen Sie die Magnetzellen mit acht Millilitern 05%Trypsin-EDTA pro Kolben. Und sammeln Sie die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation.
Wir hängen die Pellets zum Zählen auf und platzieren eine 35-Millimeter-Zellkultur-Petrischale mit Glasboden auf jedem magnetischen Gerät. Um die Aggregate magnetisch zu bilden, geben Sie drei Milliliter chondrogenes Medium in jede Petrischale und scheiden Sie vorsichtig nicht mehr als acht Mikroliter von 2,5 mal 10 bis 5. markierten Zellen pro Aggregat ab. Entscheidend ist, dass die Zellen weder zu langsam noch zu schnell abgelagert werden.
Und das weder zu nah noch zu weit vom Magnetismus entfernt. Wenn alle Aggregate platziert sind, lassen Sie die Sphäroide 20-30 Minuten lang ungestört entstehen. Anschließend werden die Aggregate in den Zellkultur-Inkubator überführt.
Am selben Tag bilden Sie Aggregate, indem Sie 2,5 mal 10 bis zur 5. markierten Stammzellen in konischen 15-Milliliter-Röhrchen mit 1,5 Millilitern chondrogenem Medium zentrifugieren. Um die Gerüste magnetisch zu bepflanzen, legen Sie ein getrocknetes poröses Pullulan/Dextran-Polysaccharid-Gerüst pro Petrischale und verdünnen Sie 2 mal 10 bis zur 6. markierten Zellen in 350 Mikrolitern chondogenem Medium ohne TGFbeta3. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig auf die Gerüste und inkubieren Sie die Strukturen bei 37 Grad Celsius, um eine vollständige Zellpenetration zu ermöglichen.
Geben Sie nach fünf Minuten vorsichtig drei Milliliter chondrogenes Medium in die Petrischale und stellen Sie die Gerüste für vier Tage wieder in den Zellkultur-Inkubator, damit die Zellen durch die Gerüstporen wandern können. Am selben Tag säen Sie ebenfalls einen weiteren Satz Gerüste mit 2 mal 10 bis 6 markierten Stammzellen wie demonstriert aus und inkubieren Sie die Zellen ohne den Magneten, um gleichmäßig ausgesäte Gerüste als Positivkontrollen zu erhalten. Für die Chondrogenese in Gerüste am fünften Tag entfernen Sie das magnetische Gerät von allen Gerüsten und geben Sie die statischen Gerüste bis zum 25. Tag wieder in den Zellkultur-Inkubator zurück, wobei Sie das Medium zweimal pro Woche wechseln.
Für die dynamische Zellkultur auch am fünften Tag Silikonschläuche nach Herstellerangaben auf die passende Länge zuschneiden und den Schlauch, die 500 Milliliter Kulturkammer, die Zwei-Wege-Rotatoren und die Cages zu einer sterilen mikrobiologischen Sicherheitsstation einstufen. Schließen Sie den Schlauch gemäß den Anweisungen des Herstellers an die Zweiwegerotatoren in der Kulturkammer an. Verwenden Sie dann einen sterilen Spatel, um vorsichtig zwei zellularisierte Gerüste in jeden Käfig zu übertragen.
Wenn alle Gerüste umgelagert sind, führen Sie die Käfige durch die Nadeln im Deckel ein, damit sie sich während der Drehung nicht bewegen. Und füllen Sie die Kulturkammer mit chondrogenem Medium. Verwenden Sie bei der Vorbereitung der Kammern eine sterile antiseptische Technik, um eine Kontamination der Werkzeuge oder Gerüste zu vermeiden.
Setzen Sie dann die Käfige in die Kammer ein, schließen Sie die Kammer und schalten Sie die Schlauchpumpe ein, um den Schlauch mit chondrogenem Medium zu füllen und Luftblasen zu entfernen. Platzieren und befestigen Sie die gefüllte Kammer im Motor des Bioreaktors und schalten Sie den Computer ein, der die Umdrehungen des Arms und der Kammer steuert. Wenden Sie dann eine Drehzahl von fünf Umdrehungen pro Minute sowohl auf den Arm als auch auf die Kammer an und stellen Sie die Peristaltikpumpe auf eine Durchflussrate von 10 Umdrehungen pro Minute ein, um die zellularisierten Gerüste kontinuierlich zu versorgen.
Um ein gerüstfreies 3D-Aggregatkonstrukt zu erzeugen, initiieren Sie am achten Tag die Fusion, indem Sie zwei Aggregate in einem chondrogenen Medium in Kontakt bringen, um acht Dublets zu erhalten. Füge dann an Tag 11 zwei Dublets zu vier Vierlingen zusammen und bilde an Tag 15 die endgültige Struktur, indem du die vier Vierlinge verschmilzt. Gewebe, die durch magnetische Fusion gebildet werden, zeigen eine signifikante Steigerung der Kollagen-II-Expression im Vergleich zu den durch Zentrifugation gewonnenen Pellets.
Mit einem verstärkten Trend zur Äußerung von Aggreganten. Bei zellularisierten statischen Gerüsten und bei der Verwendung von magnetischem Seeding wird eine Zunahme der Aggregant- und Kollagen-II-Expression im Vergleich zu einem Gerüst ohne magnetische Kräfte beobachtet. Interessanterweise ist die Expression von Kollagen II viel höher, wenn magnetisches Seeding mit dynamischer Differenzierung kombiniert wird.
Die histologische Analyse mit Toluidinblau zeigt, dass die sequentielle magnetische Fusion von 16 Aggregaten eine häufige Ablagerung von Glucosaminglykanen aufweist. Darüber hinaus ist der Glucosamin-Glykangehalt in magnetisch besäten Gerüsten höher, wenn die Gerüste in einem Bioreaktor differenziert werden, als wenn sie statisch kultiviert werden. Einmal gemeistert, kann die magnetische Zellaggregation in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die markierten Zellen in einem möglichst kleinen Volumen zu resuspendieren, um die Aggregatbildung zu erleichtern. Nach dem magnetischen Seeding der Gerüste kann die dynamische Reifung mit dem eigentlichen Bioreaktor durchgeführt werden, um die Expression neu synthetisierter Chondrozyten zu verbessern. Seit ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der regenerativen Medizin, um die Regeneration des Gelenkknorpels beim Menschen zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man magnetische Geräte konstruiert, Stammzellen markiert, Stammzellaggregate bildet, Gerüste magnetisch sät und einen echten Bioreaktor verwendet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen und Geweben äußerst gefährlich sein kann und dass immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen von Handschuhen, Laborkitteln und Schutzbrille.
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Übersicht
Diese Studie stellt einen magnetischen Ansatz zur Verdichtung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) zur Verbesserung der Chondrogenese vor. Die Methode beinhaltet eine dynamische Reifung in einem Bioreaktor, bei der mechanische Stimulation angewendet wird, um die Produktion der extrazellulären Matrix zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Geweberegeneration des Knorpels
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Die Chondrogenese ist entscheidend für die Knorpelreparatur.
- Die Zellkondensation ist ein wesentlicher früher Schritt im Regenerationsprozess.
- Die dynamische Reifung kann die Eigenschaften zellulärer Konstrukte verbessern.
- Die magnetische Aggregation bietet einen neuartigen Ansatz für die Zellbesiedlung.
Zweck der Studie
- Verbesserung der in-vitro-Chondrogenese von MSCs.
- Nachweis der Wirksamkeit der magnetischen Zellaggregation.
- Beurteilung des Einflusses der dynamischen Reifung auf die Knorpelregeneration.
Verwendete Methoden
- Magnetische Aggregation von Stammzellen.
- Verwendung von Gerüsten zur Zellkonfinierung.
- Dynamische Reifung in einem Bioreaktor.
- Visuelle Demonstrationen der Techniken.
Hauptergebnisse
- Die magnetische Aggregation kondensiert MSCs erfolgreich.
- Die dynamische Reifung verbessert die Produktion der extrazellulären Matrix.
- Die Methode ist auf andere Gewebetypen über den Knorpel hinaus anwendbar.
- Visuelle Hilfsmittel verbessern das Verständnis komplexer Techniken.
Schlussfolgerungen
- Der magnetische Ansatz ist wirksam für die Chondrogenese.
- Die dynamische Reifung trägt erheblich zur Knorpelgewebeengineering bei.
- Diese Methoden können für andere regenerative Anwendungen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die magnetische Stammzellaggregation löst eine zentrale Engstelle bei der Knorpelregeneration, indem sie eine kontrollierte Zellkondensation ermöglicht, die eine Voraussetzung für die Chondrogenese darstellt. In Kombination mit der dynamischen Bioreaktor-Maturierung verbessert dieser Ansatz die Ablagerung der extrazellulären Matrix und erhöht somit die Vorhersagekraft von In-vitro-Modellen zur Risikominimierung von Knorpelreparaturstrategien. Die Methode unterstützt die Target-Validierung und die Entwicklung von Assays, indem sie ein reproduzierbares und skalierbares System bereitstellt, um das chondrogene Potenzial unter physiologisch relevanten mechanischen Reizen zu bewerten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung chondrogener Hypothesen durch magnetisch gesteuerte Stammzellkondensation und klärt frühe funktionelle Angriffspunkte bei der Knorpelbildung.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes Verfahren zur Induktion der Zellverdichtung und verringert so die Variabilität in Chondrogenese-Assays der frühen Phase.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt gerüstfreie 3D-Aggregate und magnetisch besiedelte Gerüste mit erhöhter Expression von Kollagen II und Aggrecan, wodurch quantitative Messungen der chondrogenen Differenzierung ermöglicht werden.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch eine konsistente Bildung von Aggregaten und eine bioreaktorvermittelte Reifung, wodurch die Reproduzierbarkeit in Screening-Kampagnen verbessert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Zeigt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung auf, indem eine verbesserte Matrixproduktion unter dynamischer Kultur demonstriert wird, die den biomechanischen Eigenschaften des nativen Knorpels nachempfunden ist.
- Operationaler Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die magnetische Besiedlung und die Bioreaktor-Maturierung mit einer verbesserten Ablagerung der extrazellulären Matrix korreliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in die Entdeckungskette von der Stammzellkondensation über die dreidimensionale Gewebebildung bis hin zur dynamischen Reifung und unterstützt die Identifizierung von Leitkandidaten sowie die präklinische Bewertung von Knorpel-regenerativen Wirkstoffen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem sie eine präzise Kontrolle über die Stammzellaggregation ermöglicht, einen entscheidenden frühen Schritt der Chondrogenese.
- Screening: Stellt testbereite biologische Systeme mit standardisierter Größe und verbesserter Expression von Matrixmarkern bereit und ermöglicht so eine zuverlässige Bewertung von Wirkstoffen oder Bedingungen.
- Analytik: Bietet quantitative Messungen abhängiger Variablen wie der Expression von Kollagen II und Aggrecan, wodurch Teams chondrogene Ergebnisse zwischen experimentellen Gruppen vergleichen können.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem gezeigt wird, dass die Bioreaktor-Maturierung die Eigenschaften der extrazellulären Matrix sowohl in systemen ohne Gerüst als auch in gerüstbasierten Systemen verbessert.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Erzeugung von Knorpelmodellen, die an verschiedene MSC-Quellen und Gerüsttypen angepasst werden kann, um wiederholte Zielvalidierungen durchzuführen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der chondrogenen Differenzierung, indem die Expression von Kollagen II und Aggrecan durch magnetische Aggregation und dynamische Reifung gesteigert wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit von 3D-Knorpelmodellen durch reproduzierbare magnetische Besiedlung und bioreaktorbasierte Reifung.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem mechanistische Unklarheiten bei frühen Ansätzen zur Knorpelregeneration reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf einer verbesserten Ablagerung der extrazellulären Matrix unter physiologisch relevanten Bedingungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultivierung von Stammzellen, der Markierung mit magnetischen Nanopartikeln und der Bedienung von Bioreaktoren.
- Setzt den Zugang zu mikrofabrizierten magnetischen Vorrichtungen, chondrogenen Medien und rotierenden Bioreaktorsystemen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams hinsichtlich des Zeitpunkts der Aggregatbildung, der Zelldichte und der Dauer der Reifung, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Transfer der Methode auf unterschiedliche MSC-Quellen oder Gerüstmaterialien.
- Ist durch die Notwendigkeit einer präzisen Kontrolle des Magnetfelds und des Zellsuspensionsvolumens begrenzt, um eine gleichmäßige Aggregatbildung sicherzustellen.
