Name: 3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Erfahren Sie die magnetische Aggregation von mesenchymalen Stromazellen zur Verbesserung der Chondrogenese in einem Bioreaktor. Diese Methode steigert die Produktion extrazellulärer Matrix für die Knorpelregeneration.

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Die Autoren möchten sich QuinXell Technologies und CellD, insbesondere Lothar Grannemann und Dominique Ghozlan für ihre Hilfe mit dem Bioreaktor bestätigen. Wir danken Catherine Le Visage, die uns mit den Pullulan / Dextran-Polysaccharid-Gerüste zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union (ERC-2014-Cog Projekt MATISSE 648.779) und von der AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankreich (MagStem Projekt ANR-11 SVSE5) unterstützt.

1. Aufbau der Magneteinrichtungen HINWEIS: Die Vorrichtungen zur Zellbesiedelung verwendet , variieren je nach der Anwendung (Abbildung 1). Aggregat zu bilden, wird die Anzahl der Zellen auf 2,5 × 10 5 / Aggregat begrenzt, so dass die magnetischen Spitzen sehr dünn sein muss (750 &amp; mgr; m im Durchmesser). Um das 1,8 cm 2/7 mm dickes Scaffolds Saatgut, müssen die Magnete größer (3 mm im Durchmesser) , und werden die Zellmigration durch die Poren des Gerüsts gewährleisten. <ol><li> Aufbau einer Vorrichtung mit Mikromagnete für Aggregatbildung (1A) <ol><li> Make Mikrolöcher mit einem 0,8-mm-Bohrer durch Aluminiumbleche (3 cm im Durchmesser und 6 mm dick). </li><li> Legen Sie eine magnetische Spitze (750 &amp; mgr; m im Durchmesser) in jedes Loch der Platte. </li><li> Diese Scheibe über einen Permanentmagnet Neodymium, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet. </li></ol></li><li> Aufbau einer Vorrichtung für Gerüst Aussaat ( <strOng&gt; 1B) <ol><li> Schneidet harten Polystyrol in 2,4 cm 2 Quadrate. </li><li> Einsatz 9 kleine Magnete (3 mm im Durchmesser, 6 mm lang) in einem gleichen Abstand über eine Fläche von 1,6 cm 2. </li><li> Dieses Gerät über einen permanenten Neodym-Magneten. </li></ol></li></ol> 2. Stem Cell Labeling HINWEIS: Es wurden Stammzellen mit 0,1 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (2,6 ± 0,2 pg Eisen / Zelle) markierte Aggregate zu bilden, während sie mit 0,2 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (5 ± 0,4 pg Eisen / Zelle) markiert wurden auf Saatgut Gerüste. Diese Nanopartikel - Konzentrationen und Inkubationszeiten wurden bereits veröffentlicht und für MSC und anderen Zellen 18, 19, verwendet , und es bestimmt wurde , dass Nanopartikel beeinflusst weder die Lebensfähigkeit der Zellen noch MSC Differenzierungsfähigkeit. Die Eisenmasse von den Stammzellen eingebracht wurde mittels Single-ce gemessenll Magnetophorese 19, 20. <ol><li> Kultur von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) in komplettem mesenchymalen Stammzellwachstumsmedium (MSCGM) bei 37 ° C und 5% CO 2 , bis nahe zur Konfluenz (~ 90%). </li><li> Bereiten Sie die magnetische Markierungslösung durch Mischen von 0,1 oder 0,2 mM Maghemit Citrat beschichteten Eisenoxid (γFe 2 O 3; Kern: 8 nm Durchmesser) in serumfreien 5A Medium McCoy modifizierte bei Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ohne Glutamin und enthaltend 5 mM Natriumcitrat. </li><li> Entsorgen des Mediums, spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI - Medium ohne Glutamin und 10 ml Eisenoxid - Nanopartikel - Lösung pro 150 cm 2 Kulturkolben, dem minimalen Volumen benötigt , um alle Zellen zu bedecken. </li><li> Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2 und dann die Nanopartikel - Lösung verwerfen. Spülen für 5 Minuten mit serumfreiem RPMI-Medium ohne Glutamin nan das internalisierenoparticles noch an die Plasmamembran gebunden. </li><li> Verwerfen Sie den RPMI-Medium und 25 ml komplettes Medium MSCGM pro Kolben. Inkubiere über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Magnetische Zell Seeding <ol><li> Frisch bereiten das chondrogenen Medium nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose mit L-Glutamin durch Zugabe von 50 &amp; mgr; M L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 0,1 &amp; mgr; M Dexamethason, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM L-Prolin, 1% universelle Kultur Ergänzung mit Insulin, Transferrin und menschliche Selenige Säure (ITS-Premix) und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-beta 3 (TGF-β3). </li><li> Lösen sie die magnetischen Zellen unter Verwendung von 8 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro 150 cm 2 Kulturkolben und zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 260 × g für 5 min. Anzusaugen, das Medium und zähle die resuspendierten Zellen. </li><li> Eine Glasboden-Zellkultur-Petrischale (35 mm) auf der Oberseite der beiden Magnetvorrichtungen. </li><li> Um magnetically Aggregate bilden, 3 ml chondrogenen Medium zu der Petrischale hinzuzufügen und sanft das kleinste Volumen möglich ist (nicht mehr als 8 &amp; mgr; l) , die 2,5 × 10 5 Zellen pro Aggregat markierten Ablagerung (bis zu 16 Aggregaten abgelagert werden kann). Lassen Sie die Petrischale für 20-30 min ohne ihn zu bewegen, so dass es Sphäroide zu bilden, und dann das komplette Gerät, einschließlich der Petrischale mit 16 die Aggregate in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Formsteuer Aggregate nach dem gleichen Protokoll und ersetzen das gesamte Medium mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3. <ol><li> Um das 3D-Aggregat-Konstrukt zu erzeugen, legen zwei Aggregate in Kontakt am Tag 8-8 Dubletten zu bilden und die Fusion einzuleiten. Am Tag 11, fusionieren 2 Dubletten 4 Vierlinge zu bilden. Schließlich verschmelzen die vier Vierlinge am Tag 15 die endgültige Struktur zu erhalten. </li><li> Zur gleichen Zeit bilden sich Aggregate von 2,5 x 10 5 Zentrifugieren markierten Stammzellen bei 26015; g für 5 min in 15-ml-Röhrchen mit 1,5 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe und die Kontrolle, jeweils). </li></ol></li><li> Magnetisch seed Scaffolds Platzieren jedes getrocknetes Gerüst in eine Petrischale. Verwenden Polysaccharid poröse Gerüste aus Pullulan / Dextran - 21. Für jedes Gerüst, verdünnte 2 × 10 6 markierte Stammzellen in 350 &amp; mgr; l von chondrogenen Medium ohne TGF-β3 und sorgfältig die Zellen auf das Gerüst pipettieren. <ol><li> bei 37 ° C für 5 min inkubieren Vollzellpenetration innerhalb des Gerüsts zu ermöglichen, und fügen Sie dann vorsichtig 3 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe oder Kontrolle, jeweils), um die Petrischale. </li><li> Inkubiere das cellularized Gerüst an seiner Magnetvorrichtung bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 Tage für Zellmigration durch die Poren und das Gerüstes Confinement zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Zur gleichen Zeit, Samen Gerüste mit 2 x 10 6 </sbis&gt; markierte Stammzellen nach dem gleichen Verfahren und Inkubieren ohne die Magneten gleichmäßig seeded Gerüste als positive Kontrollen zu erhalten. </li></ol> 4. Differenzierung in Chondrozyten HINWEIS: Nach 4 Tagen Inkubation entfernen, die Magnete und weiterhin die chondrogene Reifung entweder in einer Petrischale (statische Bedingungen) oder in einem Bioreaktor (dynamische Bedingungen). Negative Kontrollproben werden in statischen Bedingungen mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3 gereift. <ol><li> In statischen Bedingungen halten die cellularized Gerüste oder Aggregate in der gleichen Petrischale. Ändern Sie den chondrogenen Medium zweimal pro Woche für 21 Tage. </li><li> In dynamischen Bedingungen, bereitet den Bioreaktor. <ol><li> Schneiden Silikonschlauch an der entsprechenden Länge entsprechend dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Autoklaviert alle Materialien: 500 ml Kulturkammer, Schläuche, 2-Wege-Rotatoren und Käfige. </li><li> Legen Sie die Bioreaktor Teile in einen sterilen microbiologische Sicherheit Station. Schließen Sie den Schlauch an den 2-Wege-Rotatoren und in die Kulturkammer nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> übertragen sorgfältig die cellularized Scaffolds in sterilisierte Käfigen einem sterilen Spatel verwendet wird. Platz 2 Gerüste pro Käfig. Wenn die Käfige bereit sind, legen Sie sie in die Nadeln des Deckels, damit sie nicht während der weiteren Drehung bewegt. Füllen der Kulturkammer mit chondrogenem Medium und schließen, wobei der Deckel die Käfige enthalten. </li></ol></li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe den Schlauch mit chondrogenem Medium zu füllen und Luftblasen zu beseitigen. </li><li> Und sichern die gefüllte Kammer in den Motor des Bioreaktors und schalten auf dem Computer, der die Drehungen steuert sowohl des Armes und der Kammer. </li><li> Anwenden einer Rotationsgeschwindigkeit von 5 Umdrehungen pro Minute (rpm), die beide auf dem Arm und der Kammer. Stellen Sie die peristaltische Pumpe bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Minute für die kontinuierliche Zuführung der cellularized Gerüste. </li></ol> HINWEIS: Vor der RNA-Extraktion, verdaut die Gerüste mit einer enzymatischen Lösung. <ol><li> Herstellung von 1 ml Enzymlösung durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l von Pullulanase (40 U / ml) und 50 ul Dextranase (60 mg / ml) zu 850 ml serumfreiem DMEM Medium. </li><li> Spülen Sie die Gerüste zweimal mit serumfreiem DMEM-Medium, entsorgen Sie das Medium, und fügen Sie 800 ul der Enzymlösung pro Gerüst. Inkubieren für 15-30 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Wenn das Gerüst vollständig gelöst ist, werden die Lösung um die Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 300 × g für 10 min enthält, sorgfältig das Medium absaugen, spült zweimal mit steriler 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Zentrifuge bei 300 × g für 10 min und erneut suspendieren die Zellen in der RNA-Isolierungslösung. </li><li> Um die RNA aus den Aggregaten zu extrahieren, legen Sie die Sphäroiden in der RNA-Isolationslösung undvollständig zerquetscht sie mit einem Homogenisator RNA-Extraktion vor der Durchführung. </li><li> Isolieren Sie die RNA ein Kit zur Gesamt-RNA-Extraktion unter Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Synthetisieren komplementärer DNA von 400 ng Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 250 ng-Zufallsprimer, 1 &amp; mgr; l dNTP-Mix (jeweils 10 mM) und 40 U / ml RNase-Inhibitor; Das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 &amp; mgr; L. Am Ende der Reaktion, fügen 80 ul destilliertes Wasser, um ein Endvolumen von 100 &amp; mgr; l zu erhalten. </li><li> Für eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), mit einem PCR-Gemisch ein fluoreszierendes Reagens enthält, um die relative Expression der Gene von Interesse, wie Aggrecan (AGC) und Kollagen II (Col II) quantitativ zu bestimmen, das mit 10 × verdünnt cDNA. Normalisieren des Niveaus der Genexpression mit dem Referenz-Genen ribosomale Protein, Groß, P0 (RPLP0). Führen Sie die Berechnungen mit der 2 - ΔΔCT FormelGegebenen ΔΔCT = ACT von differenzierten Zustand - bedeuten ACT der Kontrollbedingung, und jeder ACT stellt die CT des Gens von Interesse - die CT des Referenzgens (RPLP0). </li><li> Bestimmen, statistische Messungen als Mittelwert, die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) ±. Führen Sie die Analyse mit n ≥ 2 unabhängigen Experimenten. Verwenden Sie T-Test die statistischen Unterschiede zwischen zentrifugierten Pellets und magnetischen Fusionen (* p &lt;0,05) zu analysieren. Bestimmen Sie die Bedeutung mit Kruskal-Wallis-Test (one-way ANOVA nichtparametrischer) statistisch signifikante Unterschiede zwischen differenzierten Gerüsten und mit dem Steuer Gerüst (* p &lt;0,05) zu analysieren. </li></ol> 6. Die histologische Analyse <ol><li> Spülen Sie die cellularized Gerüste oder Aggregate mit sterilem 1 × PBS, fixieren sie in 10% Formalin-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur und spült mit 1 × PBS. </li><li> Entfernen Sie die PBS, bettet die Proben in optimaler cutting Temperatur Verbindung (OCT), und sie in einem Bad Isopentan in flüssigen Stickstoff getaucht einzufrieren. Lagern Sie die Probe bei -20 ° C. Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostat-8 &amp; mgr; m Kryoschnitte für die Aggregate oder 12 &amp; mgr; m für die cellularized Gerüste zu erhalten. </li><li> Verfärbung die Kryoschnitte mit 0,5% Toluidinblau-Lösung für 2 min, Spülen in Leitungswasser, Entwässern mit 100% Ethanol, Toluol klären, und montieren die Objektträger mit einem Befestigungsmittel für die Lichtmikroskopie. </li></ol>

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<li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Erstens, weil die hier vorgestellten Techniken auf der Internalisierung von magnetischen Nanopartikeln beruhen, ein wichtiges Thema ist das Ergebnis der Nanopartikel, wenn sie innerhalb der Zellen zu lokalisieren. Es ist wahr , dass Eisen - Nanopartikeln potenzielle Toxizität oder beeinträchtigter Differenzierung Kapazität auslösen können je nach ihrer Größe, Beschichtungs- und Belichtungszeit 19, 22. Jedoch haben mehrere Studien keinen Einfluss auf die Zellphys...

Magnetische Nanopartikel ist bereits in der Klinik als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRI) verwendet wird, und die therapeutischen Anwendungen weiter wachsen. Zum Beispiel hat es vor kurzem , dass markierte Zellen in vivo unter Verwendung eines externen Magnetfeld manipuliert werden können , gezeigt worden und können an einer definierten Stelle der Implantation 1, 2, 3 gerichtet und / oder aufrechterhalten werden. In der regenerativen Medizin, können sie organisierte Gewebe in vitro 4, einschließlich Gefäßgewebe 5, 6, 7, 8 Knochen, Knorpeln und 9 zu konstruieren , werden verwendet. Gelenkknorpel wird in einer avaskuläre Umgebung eingetaucht, Reparaturen der extrazellulären Matrix-Komponenten Herstellung sehr begrenzt, wenn Schäden auftreten. Aus diesem Grund research wird zur Zeit auf dem Engineering von hyalinem Knorpelersatz konzentriert, die an der defekten Stelle implantiert werden können. Um einen autologe Ersatz einige Forschungsgruppen untersuchen die Verwendung von autologem Chondrozyten als Zellquelle 10, 11, zu erzeugen , während andere die Fähigkeit der mesenchymalen Stammzellen (MSC) in 12 betonen Chondrozyten zu differenzieren, 13. In früheren Studien hier rekapituliert, wählten wir MSC, als ihr Knochenmark Probenahme ist ziemlich einfach und erfordert nicht das Opfer von gesunden Chondrozyten, die ihren Phänotyp 14 verlieren riskieren. Ein früher Schritt wesentlich für die chondrogene Differenzierung von Stammzellen Einleitung ist ihre Kondensation. Zellaggregate werden unter Verwendung entweder Zentrifugation oder Mikromassenkultur 15 allgemein gebildet; jedoch neithe diese Kondensationsverfahrenr stellen die potentiellen Zellcluster innerhalb dicken Gerüste noch das Potential zu schaffen, die Fusion von Aggregaten zu steuern. unter Verwendung von MSC magnetische Markierung und magnetische Anziehung In diesem Papier beschreiben wir einen innovativen Ansatz Stammzellen zu kondensieren. Diese Technik hat sich bewährt miteinander zu erhalten , die eine Millimeterskala knorpeligen Gewebe 9 gerüstfreie 3D - Konstrukte über die Fusion von Aggregaten zu bilden. Magnetische Aussaat von dicken und großen Gerüsten hat auch die Möglichkeit der Erhöhung die Größe des erzeugten Gewebes erlaubt, eine Form leichter nützlich für die Implantation der Gestaltung und das Potenzial für die klinische Anwendung bei der Knorpelreparatur zu diversifizieren. Hier stellen wir detailliert das Protokoll für das magnetische Aussäen von MSC in poröse Gerüste , bestehend aus natürlichen Polysacchariden, Pullulan und Dextran, Gerüste bisher verwendeten Stammzellen beschränken 16, 17. Chondrogene Differenzierung war finally durchgeführt in einem Bioreaktor kontinuierliche Nährstoff- und Gasdiffusion in die Matrixkerne der Gerüste mit einer hohen Dichte von Zellen ausgesät zu gewährleisten. Neben Nährstoffe, chondrogene Wachstumsfaktoren und Gas zu den Zellen bereitstellt, bot der Bioreaktor mechanische Stimulation. Insgesamt ist die magnetische Technologie zu beschränken Stammzellen verwendet, kombiniert mit dynamischer Reifung in einem Bioreaktor, kann deutlich chondrogene Differenzierung verbessern.

<table><tbody><tr><td>Eisenoxid (Maghemit) Nanopartikel (&gamma;-Fe2O3)</td><td>PHENIX - Universität Paris 6</td><td>Hergestellt und gegeben von C. M&eacute; nager</td><td>Mittlerer Durchmesser von 8,1 nm und negativer Oberflächenladung</td></tr><tr><td>Polysaccharid Pullulan/Dextran-Gerüste</td><td>LIOAD - Universität Nantes</td><td>Hergestellt und gegeben von C. Le Visage</td><td>Hergestellt aus einer 75:25-Mischung von Pullulan/Dextran unter alkalischen Bedingungen (10&nbsp; M NaOH). Porosität: 185-205&nbsp; &Mikro; m; Dicke: 7&nbsp; Mm; Fläche: 1,8&nbsp; cm2.</td></tr><tr><td>TisXell Regenerationssystem</td><td>QuinXell Technologies</td><td>QX900-002</td><td>Biaxialer Bioreaktor mit 500 mL Kulturkammer</td></tr><tr><td>Käfig für Gerüste: Histosette II M492&nbsp;</td><td>VWR</td><td>720-0909</td><td></td></tr><tr><td>Mesenchymale Stammzelle (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td> Es <td>wurden drei unabhängige Chargen verwendet</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit Medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Für das vollständige Medium fügen Sie das mitgelieferte BulletKit (enthält Serum, Glutamin und Antibiotika) zum MSCGM Medium</td></tr><tr><td>DMEM mit Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>hinzu Kein Natriumpyruvat, kein HEPES</td></tr><tr><td>RPMI-Medium 1640, kein Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Kein Natriumpyruvat, kein HEPES</td></tr><tr><td>PBS ohne CaCl2 ohne MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (10.000/nbsp; U/mL) / Streptomycin (10.000&nbsp; &Mikro; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvatlösung 100 mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure 2-phosphat</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Bereiten Sie die konzentrierte Lösung (25 mM) in destilliertem Wasser extemporan</td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma</td><td>P5607</td> <td>vorDie 175 mM Stammlösung in destilliertem Wasser verdünnt zubereiten und bei 4&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Bereiten Sie die 1 mM Stammlösung zu 100% in Ethanol verdünnt vor und lagern Sie sie bei -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>TGF-beta 3 Eiweiß 10&nbsp; &Mikro; g</td><td>Interchim</td><td>30R-AT028</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Bereiten Sie die 1&nbsp; M Stammlösung in destilliertem Wasser verdünnt und bei 4&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Pullulanase aus Bacillus acidopullulyticus</td><td>Sigma</td><td>P2986</td><td></td></tr><tr><td>Dextranase aus Chaetomium erraticum</td><td>Sigma</td><td>D0443</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA Extraction Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transkriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Zufällig Grundierung - Hexamer&nbsp;</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>500 & Mikro; g/ml: Verwenden Sie verdünnt 1/2 und geben Sie 1 & Mikro; L pro Probe</td></tr><tr><td>Rekombinante RNAs im Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>40 U/&micro; L: 1 & Mikro setzen; L pro Probe</td></tr><tr><td>PCR-Nukleotid-dNTP-Mix (10&nbsp; Roche</td><td></td> <td>10842321</td><td></td></tr><tr><td>SyBr Green PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>Step One Plus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4381792</td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung 10% neutral gepuffert</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>OCT Lösung</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Toluidinblau O</td><td>VWR</td><td>1.15930.0025</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>VWR</td><td>1.08323.1000</td><td></td></tr><tr><td>Einbettmedium Pertex</td><td>Histolab</td><td>840</td><td></td></tr><tr><td>RPLP0 Primer für qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan</td></tr> <tr><td>Primer für qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Kollagen</td></tr> <tr><td>II Primer für qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGGAGAAAACCTTCA-5'</td></tr></tbody></table>

3d magnetic stem cell aggregation und bioreactor ausreifung für knorpelregeneration

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage Engineering bleibt eine Herausforderung aufgrund der Schwierigkeiten in einer in - vitro - Funktions Implantat ähnlich dem nativen Gewebe zu schaffen. Ein Ansatz vor kurzem für die Entwicklung von autologem Ersatz erforscht beinhaltet die Differenzierung von Stammzellen in Chondrozyten. Zur Einleitung dieses Chondrogenese, einen Verdichtungsgrad der Stammzellen erforderlich ist; Somit haben wir gezeigt, die Machbarkeit der magnetisch Kondensieren Zellen sowohl innerhalb dicken Gerüste und Gerüstfrei, unter Verwendung von miniaturisierten Magnetfeldquellen als Zell Attraktoren. Dieser magnetische Ansatz wurde auch zur Führung Aggregat Fusion verwendet und gerüstfrei organisiert, dreidimensionale (3D) Gewebe mehr Millimeter groß zu bauen. Zusätzlich zur Bereitstellung einer verbesserten Größe aufweist, wobei die durch magnetische angetriebene fusion gebildete Gewebe stellte eine signifikante Zunahme der Expression von Kollagen II, und ein ähnlicher Trend wurde für Aggrecan Expression beobachtet. Da die nativen Knorpel wurde Kräfte t ausgesetztHut seine 3D-Struktur, dynamische Reifung beeinflusst wurde ebenfalls durchgeführt. Ein Bioreaktor, die mechanischen Reiz liefert wurde, um die magnetisch ausgesät Gerüste über einen Zeitraum von 21 Tagen zur Kultur verwendet. Bioreactor Reifung weitgehend Chondrogenese in die cellularized Gerüste verbessert; die extrazelluläre Matrix unter diesen Bedingungen erhalten wurde, war reich an Kollagen II und Aggrecan. Diese Arbeit beschreibt das innovative Potential der magnetischen Kondensation von markierten Stammzellen und dynamischer Reifung in einem Bioreaktor für eine verbesserte chondrogene Differenzierung, beide Gerüstfrei und innerhalb Polysaccharid Gerüste.

Erstens können Aggregate gebildet werden , einzeln Mikromagnete unter Verwendung von 2,5 x 10 5 markierten Stammzellen (2A) abzuscheiden. Diese einzelnen Aggregate (~ 0,8 mm groß), kann dann in größeren Strukturen durch sequenzielle, magnetisch induzierte Fusion fusioniert werden. Zum Beispiel am Tag 8 der chondrogenen Reifung wurden Aggregate in Kontakt paarweise angeordnet Dubletts zu bilden; Vierlinge wurden am Tag versammelt 11 von 2 Dubletten vermischt; u...

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode zur magnetischen Zellaggregation und dynamischen Reifung besteht darin, die in-vitro-Chondrogenese von mesenchymalen stromalen Zellen oder MSCs zu verbessern. Die magnetische Aggregation von Stammzellen anstelle der Chondrogenese als Zelldichte erhöhen ist ein früher, entscheidender Schritt des Knorpelregenerationsprozesses. Nachdem die Stammzellen in Gerüsten eingeschlossen wurden, können die Gerüste in einen zellulären Bioreaktor überführt werden, um die dynamische Reifung der Zellen zu untersuchen.Wichtige dynamische Methoden können auf andere biologische Systeme wie Muskel-, Herz- oder Gefäßreparatur angewendet werden. Wie Sie jedoch sehen werden, eignet sich diese Methode besonders gut zur Regeneration von Knorpel. Die visuelle Demonstration der magnetischen Zellbesiedlung und der dynamischen Zellreifung mithilfe des eigentlichen Bioreaktors ist entscheidend, da diese beiden Techniken allein anhand schriftlicher Anleitungen nur schwer zu erlernen sind.Um die Mikromagnetvorrichtung zur Aggregatbildung herzustellen, führen Sie zunächst eine magnetische Spitze mit einem Durchmesser von 750 Mikrometern in jedes drei Zentimeter durchmessende Lo

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir haben eine neuartige mechanische Belastung Bioreaktor uniaxialen oder biaxialen mechanischen Belastung zu einer Knorpel Biokomposit können vor der Transplantation in eine Anwendung Gelenkknorpeldefekt.

Entwurf eines Biaxiale Mechanische Belastung Bioreaktor für Tissue Engineering

In dieser Arbeit stellen wir eine Technik zur schnellen Herstellung von lebendem Gefäßgewebe durch direkte Kultivierung von Kollagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen vor. Darüber hinaus wird ein neues Protokoll zur mechanischen Charakterisierung von künstlich hergestellten Gefäßgeweben beschrieben.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Die Knorpelreparatur stellt eine ungelöste medizinische Herausforderung dar und zellbasierte Ansätze zur Entwicklung von menschlichem Gelenkknorpel sind eine vielversprechende Lösung. Hier beschreiben wir dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogele als ideales Werkzeug für die Expansion und Reifung menschlicher Gelenkchondrozyten.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Hier schlagen wir ein Protokoll für die chondrogene Differenzierung von Nervenblut mononuklearen Zell-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen vor.

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur 3D-Kultur-Systeme selbst Montage Peptid Gerüste zur Förderung der Differenzierung der entdifferenzierten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten Knorpel-ähnliches Gewebe zu erhalten.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

Dieser Artikel stellt eine einfache und kostengünstige Protokoll für die einfache Isolierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus New Zealand white Kaninchen Gelenkflüssigkeit.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Ein dreidimensionales uniaxiales mechanisches Stimulations-Bioreaktorsystem ist ein idealer Bioreaktor für tenogen-spezifische Differenzierung von Sehnenstammzellen und Neotendonbildung.

Anwendung eines dreidimensionalen uniaxialen mechanischen Stimulations-Bioreaktorsystems zur Induzieren tenogener Differenzierung von tendonabgeleiteten Stammzellen

Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu...

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Erfahren Sie die magnetische Aggregation von mesenchymalen Stromazellen zur Verbesserung der Chondrogenese in einem Bioreaktor. Diese Methode steigert die Produktion extrazellulärer Matrix für die Knorpelregeneration.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

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