Name: Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Erfahren Sie die morphologische und biochemische Charakterisierung von Pferdeozyten mittels ultraschallgesteuerter OPU. Diese Methode untersucht Chromosomensegregation, Spindelmorphologie und Histonacetylierung bei monovularen Arten.

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Die Autoren danken Fabrice Vincent für die Unterstützung bei der Laserscanning-konfokalen Mikroskopie (LSCM) und Philippe Barrière und Thierry Blard für die tägliche Ultraschall-Ovarial-Scanning und hCG-Injektion. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Projekt &quot;Regione Sardegna und Regione Lombardia&quot; &quot;Ex Ovo Omnia&quot; (Zuschuss Nr. 26096200 an AML) unterstützt; Die &quot;L&#39;Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012&quot; Stipendium (Vertrag 2012 bis FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Forschungsausschuss (REA) &quot;Pro-Ovum&quot; (Zuschuss Nr. 303640 bis VL); Und durch die vom Europäischen Sozialfonds kofinanzierte Postdoktorandenschule für Landwirtschaft und Veterinärmedizin, Sektorielles operationelles Programm für die Entwicklung der Humanressourcen 2007-2013 (Vertrag Nr. POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 bis IM). Die In-vivo- Oozyten-Sammlung wurde vom Institut Français du Cheval et de l&#39;Equitation finanziert.

Alle Verfahren wurden vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss CEEA Val de Loire Nr. 19 genehmigt und wurden gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. 1. Oozytensammlung und in vitro Reifung <ol><li> Ovum Pick-up <ol><li> Tägliche Beurteilung durch Ultraschall der Durchmesser der Ovarialfollikel in einer Kohorte von erwachsenen Stuten. Bei der Entstehung eines Follikels ≥33 mm (dominanter Follikel) injizieren Sie die Stute mit 1.500 IE menschlichem Choriongonadotrophin (hCG) im oberen Teil der Vena jugularis (iv). <ol><li> Bevor Sie die Injektion durchführen, den Bereich mit Alkohol abtupfen, die Jugularfurche lokalisieren und den Daumen 2-3 cm unter die Injektionsstelle stellen, um die Vene zu veranlassen, zu steigen. Setzen Sie die Nadel fast parallel zum Hals und aspirieren, um sicherzustellen, dass die Nadel in der Vene ist (das Blut wird in die Spritze eindringen). An diesem Punkt spritzen; HCG wird das m induzierenAturation der Oozyte im dominanten Follikel. </li></ol></li><li> 35 h nach der hCG-Injektion die Stute mit Detomidin (15 μg / kg, iv), Butorphanoltartrat (10 μg / kg, iv) und Butylscopolaminbromat (0,2-0,3 mg / kg, 15 mL / Stute, iv) sedieren. </li><li> Verbinden Sie die Nadel mit der Ultraschallsonde. Setzen Sie die Ultraschallsonde vaginal ein und halten Sie das Eierstock transsektal gegenüber der Ultraschallsonde. Weisen Sie einen Bediener an, die Nadel zu manövrieren, und der andere, um das Eierstock an Ort und Stelle zu halten, wobei die Follikel der Ultraschallsonde zugewandt ist . Beginnen Sie vom Eierstock mit dem dominanten Follikel. </li><li> Punktion der Scheidenwand und der Wand des dominanten Follikels mit der Nadel (Ultraschallsonden für OPU sind mit einem Kanal für die Nadel ausgestattet, die an ein Absaugsystem angeschlossen ist); Theneedle wird im echographischen Bild sichtbar. </li><li> Die Follikelflüssigkeit in einem 50-mL-Kegelrohr, das mit dem Absaugsystem verbunden ist, Gießen Sie den Inhalt der KonischenIn eine große Petrischale geben und mit einem Stereomikroskop nach dem Cumulus-Oozyten-Komplex (COC) suchen. </li><li> Da der COC nicht immer mit der Follikelflüssigkeit abgerufen wird, spülen Sie den Follikel mit Dulbecco&#39;s modifizierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit 5 IE / ml Heparinat 37 ° C ab. Untersuche DPBS für COC-Präsenz, wie zuvor für die Follikelflüssigkeit in Schritt 1.1.5 beschrieben. Spülen Sie mehrere Male, bis der COC abgerufen wird. </li><li> Sobald der COC aus dem dominanten Follikel gewonnen wird, punktiert und bündig die Follikel ≥5 und ≤25 mm, wie für den dominanten Follikel in den Schritten 1.1.3-1.1.4 beschrieben; Follikel ≥5 und ≤25 nicht ausdrücken luteinisierendes Hormon / Choriogonadotropin Rezeptor (LHCGR), und daher werden ihre Oozyten nicht reifen in Reaktion auf hCG und wird in GV-Stadium (unreif) gesammelt werden. Nur COCs mit mehreren kompletten Schichten von Cumulus-Zellen und braunem, fein granuliertem Ooplasma halten. Verwerfe die anderen. </li><li> Am Ende der OPU, inDie Stute mit Benzyl-Penicillin 15.000 IU / Tier zu verhindern, um eine Infektion zu verhindern. </li><li> Haus die Stute in einem ruhigen, sauberen Stall für mindestens 2 h. Überprüfen Sie die Anzeichen des Bewusstseins, indem Sie die Position der Ohren, die Reaktion auf Reize ( zB Lärm) und den Gang vor der Rückkehr der Stute in die Gesellschaft anderer Tiere bestimmen. </li></ol></li><li> In-vitro- Reifung <ol><li> Warme HEPES-gepufferte TCM199 (20 mM Hepes), ergänzt mit 1.790 IE / L Heparin, 0,4% Rinderserumalbumin (BSA), Penicillin und Streptomycin auf 37 ° C. Bereiten Sie dieses Medium vorab vor. Filter-sterilisieren und bei 4 ° C bis zu 6 Monate aufbewahren. </li><li> Bereiten Sie das IVM-Medium vor, indem Sie NaHCO 3- gepuffertes TCM199 (25 mM NaHCO 3 ) mit 50 ng / ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und 20% Kälberserum 7 ergänzen. Verwenden Sie NaHCO 3- gepufferte TCM199 innerhalb von 3 Wochen nach dem Öffnen einer neuen Flasche. Den EGF im Voraus als 100x Lager vorbereiten, bei -20 ° C einfrieren, Und benutze es innerhalb von 6 Monaten. 500 μl in die Vertiefungen einer 4-Well-Schale geben und in befeuchteter Luft mit 5% CO 2 bei 38,5 ° C für mindestens 2 h inkubieren. </li><li> Nach dem Abrufen der COCs aus den ≥5 und ≤25 mm Follikeln legen Sie sie in eine Petrischale (3,5 cm Durchmesser), gefüllt mit 2 ml HEPES-TCM199. Bewegen Sie die COCs in verschiedene Bereiche der Schale, um die Zelltrümmer zu waschen. </li><li> Übertragen Sie die COCs auf das IVM-Medium und inkubieren für 28 h in befeuchteter Luft mit 5% CO 2 bei 38,5 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Immunfluoreszenz und Bildanalyse <ol><li> Chromosomen zählen <ol><li> Nach der Entnahme aus dem dominanten Follikel oder am Ende des IVM inkubieren die COCs mit 100 μM Monastrol 1 h in befeuchteter Luft mit 5% CO 2 bei 38,5 ° C. Bereiten Sie Monastrol im Voraus als 100x Lager vor und lagern Sie es bei -20 ° C für bis zu 1 Jahr. </li><li> Entfernen Sie die CumuluszellenIndem man sie mit 0,5% Hyaluronidase behandelt oder durch sanftes Pipettieren; Entfernen Sie die Zona Pellucida, indem Sie sie in 0,2% Pronase behandeln. Hyaluronidase und Pronase im Voraus als 10x Lager vorbereiten und bei -20 ° C für bis zu 1 Jahr aufbewahren. </li><li> Fixieren Sie die Oozyten in 4% Paraformaldehyd in DPBS für 15 min bei 38,5 ° C, gefolgt von weiteren 45 min bei 4 ° C. VORSICHT! Bei der Handhabung von Paraformaldehyd persönliche Schutzausrüstung tragen und kontaminierte Stoffe gemäß den Entsorgungsrichtlinien entsorgen. </li><li> Waschen der Oozyten durch sequentielles Übertragen in 3 Vertiefungen, gefüllt mit 500 &amp; mgr; l DPBS, ergänzt mit 0,1% Polyvinylalkohol (PVA). Permeabilisieren in 0,3% Triton X-100 für 10 min bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Blockierung der unspezifischen Bindung durch Inkubation in DPBS, ergänzt mit 1% Rinderserumalbumin (DPBS-1% BSA) und 10% normalem Eselserum für mindestens 30 min bei RT. Proben können in einer Sperrlösung bei 4 ° C für 3-4 Tage gehalten werden. </li><li> Zur Primärfärbung inkubieren die Oozyten in Kaninchen-Anti-Aurora-B-Phospho-Thr232 in DPBS, ergänzt mit 1% BSA (Verdünnung 1:50) bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Waschen Sie die Oozyten wie in Schritt 2.1.4 beschrieben. Inkubieren Sie die Oozyten in einer Lösung von Tetra-Methylrhodaminisothiocyanat (TRITC) -konjugiertem Esel-Anti-Kaninchen-IgG (1: 100 in DPBS-1% BSA) für 1 h bei RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Oozyten wie in Schritt 2.1.4 beschrieben, und legen Sie dann 3-4 Oozyten in einen Tropfen nicht härtenden, Anti-Fade-Montagemedium, ergänzt mit 20 μM YOPRO1 auf einer Glasrutsche. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Oozyten montiert sind (3-4 Oozyten pro Folie). </li><li> Lassen Sie die Oozyten ca. 10 min im Montagemedium absetzen und decken sie dann mit einem Deckglas ab. Um das Zerkleinern der Oozyten zu vermeiden, wenden Sie zwei Streifen doppelseitigen Klebebandes an, bevor Sie das Deckglas auf den Glasschieber legen. HINWEIS: Diese Vorsichtsmaßnahme wird auch dafür sorgen, dass alle Proben gleichmäßig zwischen dem Glas sli zusammengedrückt werdenDe und das Deckglas. Glasscheiben können bei -20 ° C eingefroren und während der folgenden 2-3 Tage abgebildet werden. </li><li> Bild die Proben auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 60X-Objektiv mit den roten (centromeres) und grünen (Chromosomen) Kanälen 7 , 13 , 14 , 20 , 21 . Scannen Sie die Proben, die die gesamte metaphasische Platte auf der z-Achse überspannen, mit Stufen alle 0,35 μm. Speichern Sie die digitalisierten Bilder von jedem einzelnen Plan. </li><li> Zählen Sie die Zentromer in seriellen konfokalen Abschnitten mit der Zellenzählfunktion der NIH ImageJ Software (erhältlich unter: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). HINWEIS: Vermeiden Sie eine wiederholte Anzahl von Zentromern, die auf benachbarten Abschnitten erscheinen, indem Sie die Zentromeres identifizieren, die erscheinen, bleiben und verschwinden in sequentiellen Abschnitten mit einem numerischen Code. </li><li> Wiederholen Sie die chromosomale coUntätig in Schritt 2.1.11 mit einem unabhängigen Betreiber. HINWEIS: Die Oozyten als Euploide (32 Chromosomen), Hyperploid (&gt; 32) oder Hypoploid (&lt;32) klassifizieren. </li></ol></li><li> Spindelmorphologie und Histonacetylierung <ol><li> Nach der Entnahme aus dem dominanten Follikel oder am Ende des IVM entfernen Sie die Cumuluszellen durch Behandlung in 0,5% Hyaluronidase oder durch sanftes Pipettieren, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben. </li><li> Die Oozyten in DPBS-PVA wie in Schritt 2.1.4 waschen und in 2,5% Paraformaldehyd für 20 min bei 38 ° C fixieren. Ausgedehntes Waschen, wie in Schritt 2.1.4 beschrieben, und permeabilisieren in 0,1% Triton X-100 für 5 min bei RT. HINWEIS: Bei der Handhabung von Paraformaldehyd persönliche Schutzausrüstung tragen und kontaminierte Stoffe gemäß den Entsorgungsrichtlinien entsorgen. </li><li> Blockierung der unspezifischen Bindung durch Inkubation in DPBS, ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin (DPBS - 2% BSA), 0,05% Saponin und 10% normalem Eselserum foR 2 h bei RT HINWEIS: Die Proben können bei 4 ° C für 3 - 4 Tage in Blockierungslösung gehalten werden. </li><li> Zur Primärfärbung inkubieren die Oozyten in Maus-anti-alpha-Tubulin (1: 150) und Kaninchen anti-acH4K16 (1: 250) in DPBS-2% BSA mit 0,05% Saponin bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Die Oozyten wie in Schritt 2.1.4 waschen. Inkubieren Sie die Oozyten in einer Lösung von grünem fluoreszierendem Farbstoff-konjugiertem Esel-anti-Maus-IgG (1: 500) und TRITC-konjugiertem Esel-Anti-Kaninchen-IgG (1: 100) in DPBS-2% BSA mit 0,05% Saponin für 1 h RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Oozyten wie in Schritt 2.1.4 und legen Sie dann 3-4 Oozyten in einen Tropfen des nicht härtenden, Anti-Fade-Montagemediums, ergänzt mit 1 μg / ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Auf einer Glasrutsche </li><li> Montieren Sie die Oozyten auf Glasplättchen wie in Schritt 2.1.8 beschrieben. </li><li> Bild die Proben auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 60-fachen Objektiv unter Verwendung der roten (acH4K16), grünen (alpha-tubulin) und blauen (DNA) Kanäle. HINWEIS: Halten Sie die Lasereinstellungen für die roten und blauen Kanäle während der Erfassung aller Proben konstant. Scannen Sie die Proben, die die gesamte meiotische Spindel und die metaphasische Platte auf der z-Achse überspannen, mit Stufen alle 0,35 μm. Speichern Sie die digitalisierten Bilder (einzelne Pläne und projiziertes 3D-Bild). </li><li> Messen Sie die Pol-zu-Pol-Spindellänge und den Spindeldurchmesser bei der maximalen Breite des projizierten Bildes mit der Messfunktion der NIH ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30 .html). Wiederholen Sie alle 3 mal und berechnen Sie den Mittelwert. </li><li> Quantifizieren Sie die relative Fluoreszenz von acH4K16 mit der integrierten Dichtefunktion der NIH ImageJ Software (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Normalisieren Sie es für die integrierte Dichte der DAPI-Färbung. </li></ol></li></ol> 3. Analyse der mRNA-Expression <ol><li> Nachdem die COCs aus den 5 bis 25 mm Follikeln gewonnen wurden, sammle die Granulosazelle sUspension, die in der Petrischale blieb und zweimal in kaltem DPBS durch zweifache Zentrifugation bei 10.600 xg für 2 min waschen. Einfrieren in flüssigem Stickstoff einfrieren Die Proben bei -80 ° C für bis zu 6 Monate aufbewahren; Die Zellen dienen der Standardkurve. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig alle Cumuluszellen, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben, aus unreifen (GV), in vitro gereiften und in vivo gereiften Oozyten. </li><li> Waschen der Oozyten, wie in 2.1.4 beschrieben, in DPBS-PVA, sammeln sie einzeln in 1 μl Volumen und legen 2 μl RNALater auf die Oberseite. Snap-Freeze in flüssigem Stickstoff. Die Proben bei -80 ° C für bis zu 6 Monate aufbewahren. </li><li> Füge 2 pg Luciferase- RNA zu jeder Probe als Spike-In hinzu . Pool die Oozyten 2 x 2 und extrahiere die Gesamt-RNA unter Verwendung eines Siliciumdioxid-Membran-Filter-basierten Kits, der geeignet ist, RNA aus kleinen Proben zu gewinnen. </li><li> Reverse-transkribieren die RNA in 10 &amp; mgr; l mit 0,25 &amp; mgr; g zufälligen Hexameren und Maus Moloney Leukämie Virus Reverse Transkriptase für 1 Stunde bei 37 &amp;<html> 176; Die Proben bei -20 ° C für bis zu 6 Monate aufbewahren. </li><li> Die cDNA aus den Granulosazellen in RNAse-freiem Wasser auf 50 ng / μl verdünnen. Seriell verdünnen diese Lösung 1:10, um 5 ng / &amp; mgr; l, 0,5 ng / &amp; mgr; l, 0,05 ng / &amp; mgr; l und 0,005 ng / &amp; mgr; l Lösungen zu erhalten. </li><li> Zusammensetzen von Reaktionen in dreifacher Ausfertigung in einem Gesamtvolumen von 20 &amp; mgr; l pro Reaktion unter Verwendung von cDNA, die 0,05 Oozyten entspricht, als Substrat oder 5 &amp; mgr; l der seriellen Verdünnungen der Granulosazell-cDNA, 10 &amp; mgr; l SYBR-Grün-Supermix und 0,3 &amp; mgr; M jedes spezifischen Primers ( Tabelle 1 ). </li><li> Die Reaktion wird in einem Thermocycler unter Verwendung eines 3-stufigen Protokolls durchgeführt: 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 20 s, 40 mal wiederholt. Schließlich erwerben Sie die Schmelzkurve ab 60 ° C und erhöhen die Temperatur um 0,5 ° C alle 20 s bis 95 ° C. </li><li> Beurteilen Sie die Ausgangsmenge (SQ) der spezifischen mRNA in den Oozytenproben unter Verwendung der StandardkurveF &quot;&gt; 15, berechnet auf der Basis der Granulosazellprobe. Die Daten als das Verhältnis zwischen dem SQ des Gens von Interesse und dem SQ der Haushaltungsgene ausdrücken. </li></ol>

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<li>Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+establishment+is+defective+in+oocytes+from+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice.</a> Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).</li>
<li>Luzzo, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induced+developmental+defects+in+the+mouse%3A+oocyte+meiotic+aneuploidy+and+fetal+growth+retardation%2Fbrain+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects.</a> PLoS One. 7 (11), e49217(2012).</li>
<li>Ma, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+2+%28HDAC2%29+regulates+chromosome+segregation+and+kinetochore+function+via+H4K16+deacetylation+during+oocyte+maturation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003377(2013).</li>
<li>Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hyperacetylation+during+meiosis+interferes+with+large-scale+chromatin+remodeling%2C+axial+chromatid+condensation+and+sister+chromatid+separation+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).</li>
<li>Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+isolated+from+dairy+cows+with+reduced+ovarian+reserve+have+a+high+frequency+of+aneuploidy+and+alterations+in+the+localization+of+progesterone+receptor+membrane+component+1+and+aurora+kinase+B%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B.</a> Biol Reprod. 88 (3), 58(2013).</li>
<li>Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+expression+and+putative+function+in+bovine+oocyte+maturation%2C+fertilization%2C+and+early+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development.</a> Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).</li>
<li>Terzaghi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGRMC1+participates+in+late+events+of+bovine+granulosa+cells+mitosis+and+oocyte+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis.</a> Cell Cycle. , 1-14 (2016).</li>
<li>Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+in+the+mammalian+oocyte+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Translation in the mammalian oocyte in space and time.</a> Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).</li>
<li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+%28Dazl%29+at+the+oocyte-to-zygote+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).</li>
<li>Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternally+recruited+DCP1A+and+DCP2+contribute+to+messenger+RNA+degradation+during+oocyte+maturation+and+genome+activation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse.</a> Biol Reprod. 88 (1), 11(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Obwohl IVM seit mehr als 20 Jahren bei Pferden aufgeführt ist, wissen wir noch nicht, ob die Oozyte der Ursprung der embryonalen Aneuploidie sein kann, wie es für den Menschen vorgeschlagen wurde. Der Grund dafür ist wahrscheinlich, dass die Vorbereitung der Oozytenaufstriche für die Chromosomenzählung zu einem erheblichen Probenverlust führt. In diesem Sinne wurde eine Übersicht über die Methoden, die für die Untersuchung von Fehlern in der Chromosomensegregation verwendet wurden, durchgeführt, um nach der am besten ge...

Eine breite Palette von assistierten Reproduktionstechniken wurde entwickelt, um Unfruchtbarkeit bei Frauen, Begleittieren und gefährdeten Arten zu behandeln. Eine der häufigsten Verfahren in der klinischen Umgebung ist die Abfrage von Metaphase II (MII) -Stufen-Oozyten aus den Ovarialfollikeln durch Ultraschall-geführte transvaginale Aspiration, Eizelle (OPU) 1 . Diese Oozyten werden dann in vitro (IVF) befruchtet, wobei der resultierende Embryo (s) in einen Empfänger-Uterus implantiert wird. Die MII-Stadium (reifen) Oozyten werden nach der Verabreichung von exogenen Gonadotropinen gewonnen. Allerdings ist diese Behandlung bei einigen Patienten mit der Entwicklung des Ovarialhyperstimulationssyndroms (OHSS) 2 assoziiert. Wenn man die intrinsische Fähigkeit von ausgewachsenen, unreifen Oozyten (GV-Stadium) ausnutzt, um die Meiose nach der Isolierung aus ihren Follikeln spontan wieder aufzunehmen, ist es möglich, reife Oozyten ohne Adminis zu erhaltenGonadotropin 3 . Dieses Verfahren wird als Oozyten- In-vitro- Reifung (IVM) bezeichnet und stellt einen weniger drogenorientierten, weniger teuren und patientenfreundlichen Ansatz für die assistierte Reproduktionstechnologie dar. Allerdings ist der Erfolg der Embryo-Entwicklung mit in vitro- reifen Oozyten im Allgemeinen niedriger als bei in vivo gereiften Oozyten 4 , 5 . Eine mögliche Erklärung ist, dass in vitro gereifte Oozyten stärker von Fehlern in der Chromosomensegregation betroffen sind und die resultierende Aneuploidie die normale embryonale Entwicklung beeinträchtigt 6 . Das Verständnis der molekularen Basis der chromosomalen Fehlsegregation während IVM würde letztlich das volle Potential dieser Technik offenlegen. In diesem Sinne wurde der experimentelle Ansatz verwendet, um die morphologischen und biochemischen Merkmale von in vitro- reifen Oozyten im Vergleich zu in vivo matur zu untersuchenEd Oozyten ist hier beschrieben 7 , 8 . Insbesondere werden die Verfahren für die OPU von unreifen und reifen Oozyten und die IVM von unreifen Oozyten unter Verwendung von erwachsenen und natürlich-radierenden Pferden als experimentelles Modell veranschaulicht. Dann werden Immunfluoreszenz und Bildanalyse verwendet, um die Chromosomensegregation, die Spindelmorphologie und das globale Muster der Histonacetylierung auf diesen Gameten zu untersuchen. Schließlich wird für die Analyse der mRNA-Expression ein Protokoll der Reverse-Transkription und der quantitativen PCR beschrieben. Im Vergleich zu Nagetier-Tiermodellen erlauben Pferde keine genetische Manipulation, sind weniger leicht zu manipulieren und erfordern teure Wartung. Allerdings gewinnt dieses Modell ein beträchtliches Interesse für die Untersuchung der Oozytenreifung 9 , 10 aufgrund der Ähnlichkeit mit der menschlichen Eierstockphysiologie 11 , 12 &lt;/ Sup&gt;. Darüber hinaus hat die Entwicklung von zuverlässigen Protokollen von IVM-IVF im Pferd ein erhebliches wirtschaftliches Interesse, da es eine Erhöhung der Anzahl der Fohlen von Stuten mit hohem genetischen Wert ermöglichen würde. Eine der Einschränkungen der Durchführung von Experimenten an Oozyten, insbesondere bei monovulatorischen Spezies, ist die eingeschränkte Probenverfügbarkeit. Diese Grenze wurde hier durch die Anpassung eines bisher in Mäusen entwickelten Ansatzes an die Pferdeozyten 13 , 14 überwunden, um eine Chromosomenzählung durchzuführen, die den Probenverlust minimiert (siehe die Diskussion um einen Vergleich mit anderen verfügbaren Techniken). Darüber hinaus wurde ein Triple-Fluoreszenz-Färbeprotokoll optimiert, um mehrere Analysen auf der gleichen Probe durchzuführen, und q-PCR-Analysen wurden nur an Pools von 2 Oozyten durchgeführt. Insgesamt beschreibt die vorliegende Studie einen experimentellen Ansatz, der auf morphologisch und biochemisch beschränkt istRacterize die Pferd-Oozyte, ein Zell-Typ, der extrem schwierig zu studieren ist aufgrund der geringen Probenverfügbarkeit. Allerdings kann es unser Wissen über die Fortpflanzungsbiologie und die Unfruchtbarkeit von monovulatorischen Spezies erweitern.

<table><tbody><tr><td>Ultraschallsonde</td><td>Aloka</td><td>UST-5820-7,5</td><td></td></tr><tr><td>humanes Choriongonadotropin-Centravet</td><td></td><td>CHO004</td><td>1.500 Einheit/Tier IV</td></tr><tr><td>Detomidin-Centravet</td><td></td><td>MED010</td><td>9 - 15 & micro; g/kg i.v</td></tr>. <tr><td>Butylscopolamin Bromur</td><td>Zentravet</td><td>EST001</td><td>0,2 mg/kg i.v</td></tr>. <tr><td>Stereomikroskop</td><td>NIKON</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td>Centravet</td><td>DOL003</td><td>10&micro; g/kg i.v</td></tr>. <tr><td>Benzyl-Penicillin-Centravet</td><td></td><td>DEP203 IM</td><td>15.000 IE/Tier</td></tr><tr><td>TCM199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3769 10X1L</td><td>Pulver für hepes-gepuffertes TCM199 Hepes-Natriumsalz</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784-100G</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Heparin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3-gepuffert TCM199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2154-500ML</td><td>Flüssigkeit für IVM mittlerer</td></tr><tr><td>epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>Serum für Neugeborene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Schalen</td><td>NUNCLON</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Heraeus</td><td>BB6060</td><td></td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>normales Eselserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Aurora B Phospho-Thr232</td><td>BioLegend</td><td>636102</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-konjugierter Esel Anti-Kaninchen IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Vecta-Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>YOPRO1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Y3603</td><td></td></tr><tr><td>konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>LSM 780</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>rsb.info. nih.gov/ij/download.html</td><td>kostenlose Ressource</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Alpha-Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8203</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-acH4K16</td><td>Upstate Biotechnologie</td><td>07-329</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-coniugated esel anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>zufällige Hexamer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Maus Moloney Leukämie Virus reverse Transkriptase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>SYBR grüner Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>spezifische Primer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>spezifische Primer wurden unter Verwendung der Primer3Plus-Software (freie Ressource)</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>MyiQ</td><td></td></tr><tr><td>Maus monoklonal anti-CENPA</td><td>Abcam</td><td>ab13939</td><td></td></tr><tr><td>Maus monoklonal anti-Aurora B</td><td>Abcam</td><td>ab3609</td><td></td></tr></tbody></table> entwickelt

analyse der chromosomensegregation, histonacetylierung und spindelmorphologie in pferdeozyten

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Das Feld der assistierten Reproduktion wurde entwickelt, um Unfruchtbarkeit bei Frauen, Begleittieren und gefährdeten Arten zu behandeln. Im Pferd erlaubt die assistierte Reproduktion auch die Produktion von Embryonen von Hochleistungskünstlern, ohne ihre sportliche Karriere zu unterbrechen und trägt zu einer Zunahme der Anzahl von Fohlen aus Stuten mit hohem genetischen Wert bei. Das vorliegende Manuskript beschreibt die Verfahren, die zum Sammeln von unreifen und reifen Oozyten aus Pferd Eierstöcken mit Ovum Pick-up (OPU) verwendet werden. Diese Oozyten wurden dann verwendet, um die Inzidenz von Aneuploidie durch die Anpassung eines Protokolls, das zuvor in Mäusen entwickelt wurde, zu untersuchen. Speziell wurden die Chromosomen und die Zentromere der Metaphase-II (MII) -Oozyten fluoreszenzmarkiert und auf sequentielle Fokuspläne nach konfokaler Lasermikroskop-Scanning gezählt. Diese Analyse zeigte eine höhere Inzidenz in der Aneuploidie-Rate, wenn unreife Oozyten aus den Follikeln gesammelt und in vitro im Vergleich zu reifenIn vivo Immunfärbung für Tubulin und die acetylierte Form von Histon vier an spezifischen Lysinresten zeigten auch Unterschiede in der Morphologie der meiotischen Spindel und im globalen Muster der Histonacetylierung. Schließlich wurde die Expression von mRNAs, die für Histon-Deacetylasen (HDACs) und Acetyl-Transferasen (HATs) kodieren, durch reverse Transkription und quantitative-PCR (q-PCR) untersucht. Es wurden keine Unterschiede in der relativen Expression von Transkripten zwischen in vitro und in vivo reifen Oozyten beobachtet. In Übereinstimmung mit einem allgemeinen Stummschalten der Transkriptionsaktivität während der Oozytenreifung kann die Analyse der Gesamttranskriptmenge nur die mRNA-Stabilität oder den Abbau zeigen. Daher deuten diese Befunde darauf hin, dass andere translatorische und posttranslationale Regelungen betroffen sein könnten. Insgesamt beschreibt die vorliegende Studie einen experimentellen Ansatz zur morphologischen und biochemischen Charakterisierung der PferdeozytenLl Typ, das ist extrem schwierig zu studieren aufgrund der geringen Probenverfügbarkeit. Allerdings kann es unser Wissen über die Fortpflanzungsbiologie und Unfruchtbarkeit in monovulatorischen Spezies erweitern.

Die ursprünglichen Befunde dieser Experimente wurden bisher in der Tiefe 7 beschrieben und werden hier als ein Beispiel von Ergebnissen beschrieben, die unter Verwendung der beschriebenen Protokolle erhalten werden können. Reifungsrate Von den 32 COCs, die von OPU von dominanten Follikeln abgerufen wurden, waren 28 (88%) im MII-Stadium. Vierzehn...

Dieses Manuskript beschreibt einen experimentellen Ansatz zur morphologischen und biochemischen Charakterisierung von Pferdostozyten. Speziell veranschaulicht die vorliegende Arbeit, wie man unreife und reife Pferdoozyten durch Ultraschall-geführte Ovum-Pick-up (OPU) sammelt und wie man Chromosomensegregation, Spindelmorphologie, globale Histonacetylierung und mRNA-Expression untersucht.

Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Die allgemeinen Ziele dieses experimentellen Ansatzes bestehen erstens darin, equine Oozyten morphologisch und biochemisch zu charakterisieren, und zweitens, Gameten desselben Tieres zu vergleichen, die entweder in vitro oder in vivo verarbeitet wurden. Dieser experimentelle Ansatz kann helfen, zentrale Fragen der Oozytenbiologie und Fruchtbarkeit bei monovulatorischen Arten zu beantworten. Er könnte außerdem die Sicherheit von Verfahren zur Gametenmanipulation verbessern.Dieser Ansatz wurde entwickelt, um die eingeschränkte Verfügbarkeit von Oozyten zu überwinden, insbesondere von monoovulatorischen Arten. Die OPU-Verfahren werden von Professor Stefan Deleuze von der Universität Lüttich, Cecile Douet, der Laborleiterin meines Labors, und Fabrice Reigner, dem Leiter der Pferdeeinheit am INRA-Zentrum Val de Loire, demonstriert. Beurteilen Sie täglich den Durchmesser der Eierstockfollikel bei einer Gruppe erwachsener Stuten mittels Ultraschall. Suchen Sie nach einem großen Follikel mit einem Durchmesser von mehr als 33 Millimetern. Sobald es gefunden ist, bereiten Sie die Injektion von 1.500 Einheiten humanem Choriongonadotropin vor, um die Reifung des Oozyten zu einem dominierenden

analysis-chromosome-segregation-histone-acetylation-spindle

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eizellen sind anfällig für Aneuploidie aufgrund von Fehlern in Chromosomensegregation während meiotischen Reifung. Aneuploiden Eier können zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Hier beschreiben wir Methoden, um Material der Wahl in Oozyten und Methoden zur meiotischen Reifung zu studieren und zu bewerten Ploidie einzuführen.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Charakterisierung von Maus antralen Oozyten basierend auf nucleolar Organisation.

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet  Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

Wie die genetischen Varianten, verbunden mit der menschlichen Krankheit beginnen, aufgedeckt zu werden, ist es immer wichtiger, Systeme, um schnell die biologische Bedeutung dieser identifizierten Varianten bewerten zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der menschlichen Genfunktion während weibliche Meiose ich benutze Maus Eizellen.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Wir geben einen Überblick über das klinische Protokoll zur nicht-invasiven Bewertung der menschlichen Eireife mittels polarisierter Lichtmikroskopie.

Human Egg Maturity Assessment und seine klinische Anwendung

Es wird ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das die Depletion zytoplasmatischer Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen während der Metaphase I mit einem Nahinfrarot-Femtosekundenlaser ermöglicht.

Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

Fehler in der Chromosomentrennung sind ein häufiges Merkmal bei Eizellen. Daher gibt die Untersuchung des Spindelanordnungs-Checkpoints wichtige Hinweise auf die Mechanismen, die zur Produktion gesunder Eier erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt drei komplementäre Assays zur Beurteilung der Integrität des Spindelaufbau-Checkpoints in Maus-Oozyten.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Meiotische Fehler in Synapsen und Rekombination sind bei Säugetier-Eizellen üblich. Eine rigorose Analyse der Proteine, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist unerlässlich, um zu verstehen, wie und warum die Oogenese oft schief geht. Die hier vorgestellten Techniken ermöglichen ein umfassendes Monitoring von Rekombination und Synapsen, um die Eizellqualität bei Mäusen zu bewerten.

Präparation meiotischer Chromosomenspreizungen aus Maus-Eizellen zur Beurteilung von Synapse und Rekombination

Erfahren Sie die morphologische und biochemische Charakterisierung von Pferdeozyten mittels ultraschallgesteuerter OPU. Diese Methode untersucht Chromosomensegregation, Spindelmorphologie und Histonacetylierung bei monovularen Arten.

Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten

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