Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Ansatzes besteht darin, erstens Pferdeeizellen morphologisch und biochemisch zu charakterisieren und zweitens Gameten desselben Tieres zu vergleichen, die in vitro oder in vivo verarbeitet wurden. Dieser experimentelle Ansatz kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Biologie der Eizellen und der Fertilität bei monovulatorischen Spezies zu beantworten. Es könnte auch die Sicherheit von Verfahren zur Manipulation von Gameten verbessern.

Dieser Ansatz wurde entwickelt, um die eingeschränkte Probenverfügbarkeit von Eizellen, insbesondere von monovulatorischen Spezies, zu überwinden. Die OPU-Verfahren werden von Professor Stefan Deleuze von der Universität Lüttich, Cécile Douet, der Laborleiterin meines Labors, und Fabrice Reigner, dem Leiter der Pferdeabteilung am INRA Centre Val de Loire, vorgeführt. Beurteilen Sie täglich den Durchmesser der Eierstockfollikel in einer Kohorte erwachsener Stuten mit Ultraschall.

Suchen Sie nach einem großen Follikel mit einem Durchmesser von mehr als 33 Millimetern. Sobald Sie gefunden haben, bereiten Sie sich darauf vor, 1.500 Einheiten humanes Choriongonadotropin zu injizieren, um die Reifung der Eizelle zu einem dominanten Follikel zu induzieren. Lokalisieren Sie als Nächstes die Halsfurche und tupfen Sie die Injektionsstelle mit Alkohol ab.

Um die Vene ansteigen zu lassen, wenden Sie dann etwas Kraft zwei oder drei Zentimeter unterhalb der Injektionsstelle an. Führen Sie die Nadel fast parallel zum Hals ein, aspirieren Sie leicht, um sicherzustellen, dass sich die Nadel in der Vene befindet, und injizieren Sie das Hormon. Bereiten Sie eine Ultraschallsonde für den vaginalen Zugang vor.

Schließen Sie dann die Nadel an ein Absaugsystem an. 35 Stunden nach der hCG-Injektion richten Sie die Instrumentierung für OPU ein und sedieren Sie die Stute. Eine gute Analgesie ist für die Sicherheit des Tieres und des Bedieners äußerst wichtig.

Ein Tier, das keine Schmerzen oder Beschwerden verspürt, lässt eine Manipulation des Eierstocks zu, wodurch Einstiche und Rötungen leichter durchgeführt werden können. Sobald die Nadelsonde eingeführt ist, muss ein Bediener den Eierstock so manipulieren, dass er der Sonde zugewandt ist, während der andere Bediener die Nadel manipuliert. Lokalisieren Sie den dominanten Follikel im echographischen Bild.

Verwenden Sie dann die Nadel, um die Vaginalwand und die Wand des dominanten Follikels zu durchstechen. Sobald der Follikelraum erreicht ist, saugen Sie die Follikelflüssigkeit ab. Drehen Sie die Nadel, um die Follikelwand abzukratzen und den Kumulus-Eizell-Komplex zu befestigen.

Gießen Sie dann die Flüssigkeit in eine große Petrischale. Suchen Sie unter einem Stereoskop nach dem COC. In der Zwischenzeit spülen Sie den Follikel mit warmem Dulbecco's modifiziertem PBS aus, das Heparin enthält.

Es kann mehrere Spülungen dauern, um das COC zu sammeln. Nachdem das COC gefunden wurde, tauschen Sie die Nadel gegen eine doppellumige Nadel aus und sammeln Sie die unreifen COCs von allen Follikeln mit einem Durchmesser zwischen fünf und 25 Millimetern. Diese werden für die In-vitro-Reifung verwendet.

Sobald alle Follikel eines Eierstocks aspiriert sind, wiederholen Sie die gleichen Verfahren, um die unreifen KOK aus dem anderen Eierstock zu sammeln. Wählen Sie nun zwischen den COCs. Behalten Sie nur KOK mit mehreren vollständigen Schichten von Kumuluszellen und einem braunen, fein granulierten Ooplasma.

Wirf die anderen weg. Am Ende des Eingriffs injizieren Sie der Stute 15.000 Einheiten Benzyl-Penicillin, um eine Infektion zu verhindern. Halten Sie die Stute dann mindestens zwei Stunden lang in einem ruhigen, sauberen Stall, während sie sich erholt.

Bevor die OPU beginnt, erwärmen Sie eine Flasche mit ergänztem HEPES-gepuffertem TCM-199 auf 37 Grad Celsius. Bereiten Sie als Nächstes das IVM-Medium vor. Geben Sie 500 Mikroliter supplementiertes Natriumbicarbonat-gepuffertes TCM-199 in die Vertiefungen einer Vier-Well-Schale.

Dann das Gericht mindestens zwei Stunden lang bei 38,5 Grad Celsius inkubieren. Übertragen Sie die zurückgewonnenen unreifen KOK in eine 3,5 Zentimeter große Schale, die mit zwei Millilitern des erwärmten HEPES TCM-199 gefüllt ist. Bewegen Sie die COCs durch verschiedene Bereiche der Schüssel, um den umgebenden Schmutz vorsichtig wegzuspülen.

Übertragen Sie nun die KOK auf das IVM-Medium und inkubieren Sie sie 28 Stunden lang bei 38,5 Grad Celsius. Um eine Chromosomenzählung an reifen KOKs durchzuführen, inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 38,5 Grad Celsius in 100-Mikromol-Monastrol. Als nächstes entfernen Sie die Kumuluszellen, indem Sie die KOK mit 0,5 % Hyaluronidase in HEPES-gepuffertem TCM-199 behandeln.

Überwachen Sie diese Reaktion auf einem beheizten Tisch, der auf 38 Grad Celsius eingestellt ist. Entfernen Sie innerhalb von etwa fünf Minuten alle Zellen. Verwenden Sie vorsichtiges Pipettieren, um die letzten hartnäckigen Zellen zu entfernen.

Entfernen Sie anschließend die Zona pellucida mit 0,2 % Pronase in HEPES-gepuffertem TCM-199. Überwachen Sie diese Reaktion auch auf einem beheizten Tisch. Es sollte etwa fünf Minuten dauern, bis der Vorgang abgeschlossen ist.

Fixieren Sie dann die Eizellen in 4%-Paraformaldehyd in DPBS für 15 Minuten bei 38,5 Grad Celsius, gefolgt von weiteren 45 Minuten Fixierung bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Eizellen nach der Fixierung, indem Sie sie nacheinander zwischen drei Vertiefungen mit 0,1 % Polyvinylalkohol in DPBS übertragen. Verwenden Sie etwa einen halben Milliliter Lösung pro Vertiefung.

Bringen Sie dann die Eizellen in eine Vertiefung, die mit 0,3 % Triton X-100 in PBS gefüllt ist, und lassen Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Um unspezifische Signale zu blockieren, baden Sie die Zellen in DPBS mit 1 % BSA und 10 % normalem Eselserum. Inkubieren Sie die Zellen mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach 30 Minuten wird der Primärantikörper aufgetragen und die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Waschen Sie am nächsten Tag die Eizellen und tragen Sie den Sekundärantikörper eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf, geschützt vor Lichteinwirkung. Waschen Sie die Eizellen nach dem Auftragen der Sekundärwaffe erneut.

Befestigen Sie dann vor der Montage doppelseitige Klebebandstreifen an den Objektträgern, die als Deckglasstützen dienen. Montieren Sie nun die Eizellen drei bis vier pro Objektträger in einem Tropfen nicht aushärtendem Eindeckmedium, das mit 20 Mikromolaren YO-PRO-1 ergänzt wird. Lassen Sie die Eizellen etwa 10 Minuten einwirken und kleben Sie dann die Deckgläser auf.

Von 32 KOK, die mittels OPU aus dominanten Follikeln entnommen wurden, befanden sich 28 in der Metaphase II.Durch In-vitro-Reifung wurden 37 von 44 KOK, die von nicht-dominanten Follikeln entnommen wurden, in die Metaphase II gereift.Anschließend wurden die Chromosomen beider Gruppen verglichen. Die in vitro gereiften Eizellen waren häufig von Aneuploidie, meist Hyperploidie, betroffen. Dies wurde bei den in vivo gereiften Eizellen nicht beobachtet.

Anschließend wurden sowohl die Spindellänge von Pol zu Pol als auch der Durchmesser der Spindel im Maximum gemessen. Die in vitro gereiften Eizellen waren signifikant länger und breiter als die in vivo gereiften Eizellen. In den gleichen Proben wurde der globale Acetylierungsgrad von H4K16 gemessen.

Die Ergebnisse waren wie erwartet. Die Acetylierung von H4K16 war in vitro gereiften Eizellen signifikant geringer als in in vivo gereiften Eizellen. Ein gut ausgebildetes Team kann fünf Stuten an einem OPU-Morgen mit einer Entnahmerate von 80 % für die präovulatorische Eizelle und 50 bis 60 % der Entnahme der unreifen Eizellen verarbeiten.

Überwachen Sie während der OPU immer das Wohlergehen des Tieres und seien Sie bereit, bei Bedarf eine angemessene tierärztliche Versorgung zu gewährleisten. Der experimentelle Ansatz kann auch auf Eizellen anderer Spezies angewendet werden und ist insbesondere dort anwendbar, wo die Verfügbarkeit von Proben ein Problem darstellt, wie z. B. beim Menschen. Basierend auf unseren Ergebnissen müssen Studien durchgeführt werden, um die Kulturbedingungen besser zu verstehen, die für eine korrekte Chromosomensegregation und epigenetische Veränderungen erforderlich sind.

Das übergeordnete Ziel ist es, die Effizienz der In-vitro-Reifung sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der menschlichen Fertilitätsbehandlung zu verbessern.