System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine mehrdimensionale Bewertung darüber zu ermöglichen, wie Verbindungen das Überleben von M. tuberculosis in menschlichen Makrophagen beeinflussen. Diese Methode basiert auf einem Wirksamkeitsnachweis, der auf Luciferase beruht. In Kombination mit einem Zytotoxizitäts- und einem MIC-Test kann sie nützliche Informationen für die Modifizierung von HIT-Verbindungen in der Entwicklung von Tuberkulosemedikamenten liefern.

Der Hauptvorteil unserer Methode liegt in der Zeit- und Arbeitsersparnis. Sie ersetzt einen CFU-Koloniebildenden-Einheiten-Assay durch einen auf Luciferase basierenden Assay. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten mit der Konsistenz beim manuellen Pipettieren im Vergleich zur Automatisierung.

Eine einheitliche Pipettier-Technik ist entscheidend. Kultivieren Sie THP1-Zellen in RPMI in komplettem Medium. Dabei zwischen den Passagen eine Zelldichte von 0,2 bis eine Million Zellen pro Milliliter Medium aufrechterhalten.

Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die OD600 einer aktiv wachsenden bakteriellen Suspension zu messen. Berechnen Sie anschließend die Bakteriendichte unter Verwendung des Umrechnungsfaktors, bei dem 0,1 OD600 drei mal 10 hoch sieben Bakterien pro Milliliter entsprechen. Pipettieren Sie ausreichend Bakterien für ein MOI von 10 zu 1 in ein neues Zentrifugenröhrchen.

Anschießend die Bakterien bei 3.000 × g 10 Minuten lang pelletieren. Um die Bakterien zu opsonisieren, 50 µL humanes Serum zu 450 µL RPMI 1640 hinzufügen und die Bakterienpellets darin mit einer Dichte von 1 × 10⁸ Bakterien pro 500 µL Medium resuspendieren. Die Mischung 30 Minuten bei 37 °C inkubieren lassen.

Als Nächstes bestimmen Sie mithilfe eines Hämozytometers und eines invertierten Mikroskops die Zelldichte der THP1-Zellkultur. Anschließend pelletieren Sie die Zellen in sterilen Zentrifugenröhrchen bei 100 × g und 37 °C für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in RPMI im vollständigen Medium bei einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter.

Fügen Sie PMA bis zu einer Endkonzentration von 40 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Dies ist das Differenzierungsgemisch. Kombinieren Sie opsonisiertes M. tuberculosis mit dem THP1-Differenzierungsgemisch bei einem MOI von 10 zu 1.

Und aliquotieren Sie das endgültige Gemisch mit je 100 Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-Loch-Weiß-Platte mit flachem Boden. Anschließend lassen Sie die Differenzierung und Infektion über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am nächsten Tag waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit jeweils 100 Mikroliter RPMI.

Anschießend Verbindungen in der gewünschten Konzentration verdünnt sowie RPMI in komplettem Medium hinzufügen. Die Platten drei Tage lang inkubieren. Bei Verwendung von Mehrkanalpipetten langsame und gleichmäßige Kolbenbewegungen üben und die Pipettenspitzen stets an derselben Stelle innerhalb jedes Wells absetzen, um die THP1-Zellen so wenig wie möglich zu stören.

Nach der Inkubation das Medium aus den Vertiefungen absaugen und 50 Mikroliter Luciferase-Assay-Reagenz zu jeder Vertiefung hinzufügen. Anschließend die Platten mit transparenten, selbstklebenden Plattenverschlüssen verschließen. Die Platten fünf Minuten bei 22 Grad Celsius inkubieren und dann mit einem Luminometer eine Messung von einer Sekunde pro Vertiefung durchführen.

Um THP1-Zellen zu differenzieren, nachdem das Differenzierungsgemisch wie zuvor in diesem Video gezeigt vorbereitet wurde, pipettieren Sie 100 Mikroliter des Differenzierungsgemischs in jedes gut einer klaren 96-Loch-Platte mit Zellen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Am folgenden Tag saugen Sie das Medium aus den Löchern ab und waschen Sie diese zweimal mit RPMI 1640.

Fügen Sie 100 Mikroliter der in unvollständigem RPMI verdünnten Verbindungen zu den Vertiefungen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen anschließend drei Tage lang. Lösen Sie 0,5 Gramm MTT in 100 Milliliter PBS, um eine Stammlösung mit fünf Milligramm pro Milliliter herzustellen.

Anschließend die Lösung steril filtrieren. Zwei Stunden und dreißig Minuten vor dem Ende der dreitägigen Inkubationszeit 25 Mikroliter MTT-Lösung zu jedem Zellbrunnen hinzufügen und die Inkubation beenden. 50 %ige NN-Dimethylformamid- oder DMF-Lösung herstellen, indem 250 Milliliter DMF mit 250 Millilitern deionisiertem Wasser gemischt werden.

Stellen Sie den MTT-Extraktionspuffer wie folgt her. Geben Sie 100 Gramm SDS in eine 500-Milliliter-Flasche und fügen Sie 300 Milliliter 50%iges DMF hinzu. Erwärmen Sie vorsichtig, um das Auflösen des SDS zu ermöglichen.

Fügen Sie 10 Milliliter reine Essigsäure und 12,5 Milliliter einmolarer Salzsäure hinzu. Danach füllen Sie die Flasche mit 50 % DMF bis zur 500-Milliliter-Marke auf. Am Ende der Behandlungszeit geben Sie 100 Mikroliter Extraktionspuffer in jedes Gefäß.

Die Mischung über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am folgenden Tag die Absorption bei 570 Nanometern messen. Um einen Resazurin-Assay durchzuführen, M. tuberculosis in 7H9 ADST bis zur mittleren Wachstumsphase anziehen.

Verdünnen Sie die Kultur mit 7H9 ADST auf einen OD600 von 0,01. Verdünnen Sie die Verbindungen mit 7H9 ADST auf die doppelte Testkonzentration. Geben Sie jeweils 100 Mikroliter jeder verdünnten Verbindung in jedes Loch einer klaren 96-Loch-Platte.

Übertragen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Bakteriensuspension in jedes Loch. Inkubieren Sie die Platten fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator. Lösen Sie 10 Milligramm Resazurin in 100 Milliliter entionisiertem Wasser auf.

Und die Lösung filtrieren, um sie keimfrei zu machen. Geben Sie 30 Mikroliter Resazurin-Lösung in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 48 Stunden lang.

Das bakterielle Wachstum zeigt sich durch eine Farbumwandlung von blau nach rosa. Führen Sie die quantitative Analyse gemäß dem Textprotokoll durch. Dieses Streudiagramm zeigt die rohen Lumineszenzdaten, gemessen in relativen Lumineszenzeinheiten, für die Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Rifampicin an M.tuberculosis- und THP1-Zellen.

In dieser Darstellung ist die prozentuale Reduktion und Lumineszenz in behandelten Vertiefungen im Vergleich zu unbehandelten Vertiefungen dargestellt. Rifampicin kann 99,9 % der relativen Lichtmengen, oder RLUs, aus intrazellulärem M. tuberculosis bei einer Konzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter reduzieren. Ähnlich wie zuvor veröffentlichte Ergebnisse, die aus CFU ermittelt wurden.

In dieser Abbildung ist die Zytotoxizität dargestellt, die durch steigende Konzentrationen von G1-1H im MTT-Assay verursacht wird. Die Konzentrationen von 10 und drei Mikromolar liegen deutlich unterhalb der IC50-Schwelle. Diese Abbildung zeigt die Wirkungen verschiedener Konzentrationen des Antibiotikums Apramycin auf die Resazurin-Umwandlung durch M. tuberculosis.

Die in-Brühe-MIC90 lag zwischen 2,5 und fünf Mikrogramm pro Milliliter. Dieser Wert ist leicht höher als der zuvor veröffentlichte Wert von 1,5 Mikrogramm pro Milliliter. Er liegt jedoch immer noch gut im akzeptablen Bereich.

Wie hier gezeigt, wird die Verdunstung bei allen Experimenten mit langen Inkubationszeiten signifikant. Daher ist darauf zu achten, dass die Inkubatoren gut befeuchtet sind, um Inkonsistenzen zu vermeiden. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie zuverlässige intrazelluläre Daten bereits innerhalb von vier Tagen liefern.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sanft mit den THP1-Zellen umzugehen und konsistent im Pipettieren zu sein, falls ohne Automatisierung gearbeitet wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie das Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden, um zu bestimmen, ob Trefferverbindungen bakteriostatisch oder bakterizid wirken. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Anleitung den Forschern auf dem Gebiet der Tuberkulose-Medikamentenentwicklung den Weg, um die Wirksamkeit von Verbindungen gegen MTB innerhalb menschlicher Makrophagen schnell zu bewerten.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Microbacterium tuberculosis gefährlich ist. Verwenden Sie beim Umgang mit diesem Mikroorganismus Vorsichtsmaßnahmen und geeignete Ausrüstung.