System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer Mycobacterium tuberculosis

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine mehrdimensionale Bewertung der Auswirkungen von Verbindungen auf das Überleben von M. tuberculosis in menschlichen Makrophagen zu ermöglichen. Diese Methode basiert auf einem Luciferase-basierten Wirksamkeitsassay. In Kombination mit Zytotoxizität kann ein MHK-Assay nützliche Informationen über die Modifikation von HIT-Verbindungen in der TB-Arzneimittelentwicklung liefern.

Der Hauptvorteil unserer Methode besteht darin, dass sie Zeit und Arbeit spart. Es ersetzt einen KBE koloniebildenden Unit-Assay durch einen Luciferase-basierten Assay. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, mit manuellem Pipettieren anstelle von Automatisierung konsistent zu sein.

Eine konsistente Pipettiertechnik ist entscheidend. Züchten Sie THP1-Zellen in RPMI in vollständigem Medium. Bei gleichzeitiger Beibehaltung einer Zelldichte von 0,2 bis einer Million Zellen pro Milliliter Medium zwischen den Passagen.

Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die OD600 einer aktiv wachsenden Bakteriensuspension zu messen. Berechnen Sie dann die Bakteriendichte mit dem Umrechnungsfaktor von 0,1 OD600 entspricht dreimal 10 zum siebten Bakterium pro Milliliter. Pipettieren Sie genügend Bakterien für ein Trägheitsmoment von 10 zu eins in ein neues Zentrifugenröhrchen aus.

Pelletieren Sie dann die Bakterien 10 Minuten lang bei 3.000 mal G. Um die Bakterien zu opsonisieren, fügen Sie 50 Mikroliter Humanserum zu 450 Mikrolitern RPMI 1640 hinzu und verwenden Sie es, um das Bakterienpellet mit einer Dichte von eins mal 10 bis dem achten Bakterium pro 500 Mikroliter Medium zu resuspendieren. Lassen Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Als nächstes bestimmen Sie mit einem Hämozytometer und einem inversen Mikroskop die Dichte der THP1-Zellkultur. Anschließend pelletieren Sie die Zellen in sterilen Zentrifugenröhrchen bei 100-facher G bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in RPMI in vollständigem Medium bei einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter.

Geben Sie PMA bis zu einer Endkonzentration von 40 Nanogramm pro Milliliter zu. Das ist ein Differenzierungsmix. Kombinierter opsonisierter M.tuberculosis- mit THP1-Differenzierungsmix bei einem MOI von 10 zu eins.

Und aliquotieren Sie die endgültige Mischung mit 100 Mikrolitern pro Vertiefung in einer weißen 96-Well-Platte mit flachem Boden. Lassen Sie dann die Differenzierung und die Infektion bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid über Nacht inkubieren. Verwenden Sie am nächsten Tag 100 Mikroliter RPMI, um die Vertiefungen zweimal zu waschen.

Fügen Sie dann Verbindungen hinzu, die auf die gewünschten Konzentrationen und RPMI in vollem Medium verdünnt sind. Inkubieren Sie die Platten drei Tage lang. Wenn Sie Mehrkanalpipetten verwenden, denken Sie daran, den Kolben langsam und gleichmäßig zu bewegen und die Pipettenspitzen immer an der gleichen Stelle in jeder Vertiefung zu platzieren, um die Störung der THP1-Zellen zu minimieren.

Nach der Inkubation wird das Medium aus den Vertiefungen aspiriert und 50 Mikroliter Luciferase-Assay-Reagenz in jede Vertiefung gegeben. Verwenden Sie dann transparente Klebeplattenversiegelungen, um die Platten zu versiegeln. Inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 22 Grad Celsius und verwenden Sie dann ein Luminometer, um eine Anzeige von einer Sekunde pro Vertiefung zu erhalten.

Um THP1-Zellen zu differenzieren, geben Sie nach der Zubereitung der Differenzierungsmischung, wie zuvor in diesem Video gezeigt, 100 Mikroliter der Differenzierungsmischung in jede Vertiefung einer klaren 96-Well-Zellplatte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid über Nacht. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen ab und waschen Sie sie zweimal mit RPMI 1640.

Geben Sie 100 Mikroliter in RPMI verdünnte Verbindungen unvollständig in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen dann drei Tage lang. Lösen Sie 0,5 Gramm MTT in 100 Millilitern PBS auf, um eine Stammlösung von fünf Milligramm pro Milliliter herzustellen.

Sterilisieren Sie dann die Lösung. Zweieinhalb Stunden vor Ende der dreitägigen Inkubationszeit geben Sie 25 Mikroliter MTT-Lösung in jede Zellvertiefung und beenden Sie die Inkubationszeit. Bereiten Sie 50%NN-Dimethylformamid oder DMF vor, indem Sie 250 Milliliter DMF mit 250 Millilitern deionisiertem Wasser mischen.

Bereiten Sie den MTT-Extraktionspuffer wie folgt vor. Geben Sie 100 Gramm SDS in eine 500-Milliliter-Flasche und fügen Sie 300 Milliliter 50%DMF hinzu. Wenden Sie schwache Hitze an, damit sich das Sicherheitsblatt auflösen kann.

Fügen Sie 10 Milliliter reine Essigsäure und 12,5 Milliliter einmolare Salzsäure hinzu. Verwenden Sie dann 50 % DMF, um die Flasche bis zur 500-Milliliter-Marke zu füllen. Am Ende des Behandlungszeitraums geben Sie 100 Mikroliter Extraktionspuffer in jede Vertiefung

Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid über Nacht. Am nächsten Tag lesen Sie die Extinktion bei 570 Nanometern ab. Um einen Resazurin-Assay durchzuführen, züchten Sie M. tuberculosis in 7H9 ADST bis zur Midlock-Phase.

Verdünnen Sie die Kultur mit 7H9 ADST auf einen OD600 von 0,01. Verwenden Sie 7H9 ADST, um die Verbindungen auf das Zweifache der Prüfkonzentrationen zu verdünnen. Und aliquotieren Sie 100 Mikroliter jeder verdünnten Verbindung in jede Vertiefung einer klaren 96-Well-Platte.

Übertragen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Bakteriensuspension in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator für fünf Tage. Lösen Sie 10 Milligramm Resazurin in 100 Millilitern entionisiertem Wasser auf.

Und Filter sterilisieren die Lösung. Geben Sie 30 Mikroliter Resazurinlösung in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen dann 48 Stunden lang.

Das Bakterienwachstum wird durch eine Farbumwandlung von Blau nach Rosa angezeigt. Führen Sie eine quantitative Analyse gemäß dem Textprotokoll durch. Dieses Streudiagramm zeigt die rohen Lumineszenzdaten, die in relativen Lumineszenzeinheiten für die Behandlung verschiedener Konzentrationen von Rifampicin auf M.tuberculosis- und THP1-Zellen gemessen wurden.

In diesem Diagramm ist die prozentuale Reduktion und Lumineszenz in behandelten Wells im Vergleich zu unbehandelten Wells dargestellt. Rifampicin ist in der Lage, 99,9 % der relativen Lichteinheiten (RLUs) von intrazellulärer M. tuberculosis bei einer Konzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter zu reduzieren. Ähnlich wie bei den zuvor veröffentlichten Ergebnissen, die aus KBE ermittelt wurden.

In dieser Abbildung ist die Zytotoxizität dargestellt, die durch steigende Konzentrationen von G1-1H verursacht wird, die im MTT-Assay verwendet werden. Die Konzentrationen von 10 und drei Mikromolaren liegen deutlich unter dem IC 50-Cutoff. Diese Abbildung zeigt die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen des Antibiotikums Apramycin auf die Resazurin-Umwandlung durch M. tuberculosis.

MIC90 in der Brühe lag zwischen 2,5 und fünf Mikrogramm pro Milliliter. Das liegt leicht über dem zuvor veröffentlichten Wert von 1,5 Mikrogramm pro Milliliter. Aber es liegt immer noch im akzeptablen Bereich.

Wie hier gezeigt, wird die Verdunstung für alle Experimente mit verlängerten Inkubationszeiten von Bedeutung. Es muss also darauf geachtet werden, dass die Brutschränke gut befeuchtet werden, um Inkonsistenzen zu vermeiden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in nur vier Tagen zuverlässige intrazelluläre Daten liefern.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, vorsichtig mit THP1-Zellen umzugehen und konsequent zu pipettieren, wenn Sie es ohne Automatisierung versuchen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie das High-Content-Screening verwendet werden, um festzustellen, ob die Trefferverbindungen bakteriostatisch oder bakterizid sind. Nach seiner Entwicklung ebnete dieses Protokoll den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Tuberkulose-Wirkstoffforschung, um die Wirksamkeit von Wirkstoffen gegen MTB in menschlichen Makrophagen schnell zu bewerten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Mikrobakterium tuberculosis gefährlich ist. Verwenden Sie Vorsichtsmaßnahmen und die richtige Ausrüstung, wenn Sie mit diesem Mikroorganismus umgehen.