Name: System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening zur Wirksamkeits- und Zytotoxizitätsprüfung von Inhibitoren gegen intrazelluläres Mycobacterium tuberculosis in humanen Makrophagen. Diese Luciferase-basierte Methode ersetzt zeitaufwendige CFU-Assays und beschleunigt die Tuberkulose-Arzneimittelentwicklung durch automatisierte Prozesse.

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Diese Arbeit wurde von der BC Lung Association und Mitacs unterstützt.

1. Bakterienstamm und Wachstumsmedium <ol><li> Make-Albumin-Dextrose und Salz-Stammlösung (ADS) durch Solubilisieren von 25 g Rinderserumalbumin, 10,0 g Dextrose und 4,05 g Natriumchlorid in 460 ml deionisiertem Wasser. Filter-Sterilisieren der ADS und lagere bei 4 ° C. </li><li> Make 7H9 Brühe durch Zugabe von 4,7 g 7H9 Pulver und 2 ml Glycerin zu 900 ml gereinigtem Wasser. Autoklaviert die 7H9-Bouillon bei 121 ° C für 10 min und läßt es vor dem Fortfahren auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Machen 7H9ADST durch Zugabe von 100 ml ADS und 0,5 ml Tween 80 bis 900 ml 7H9-Bouillon. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Man wiegt 50 mg Kanamycinsulfat und löst in 1 ml entionisiertem Wasser; die Endkonzentration beträgt 50 mg / mL. Filter-sterilisiert und bei -20 ° C. In 0,5 ml Kanamycin Stammlösung pro 1 l 7H9ADST. HINWEIS: Dieses Medium sollte frisch hergestellt werden, so skaliert die Volumina in geeigneter Weise entsprechend der Kultur Größe. </li><li> Wachsen M. tuberculosis in 7H9ADST mit Kanamycin in Kultur steht. Schütteln Sie die Kultur täglich und verdünnen Sie es, bevor die OD 600 1,0 erreicht Verklumpen zu vermeiden. HINWEIS: Der Stamm M. tuberculosis für die Entwicklung dieses Verfahrens verwendet H37Rv wurde mit Plasmid pJAK2.A 12 umgewandelt. pJAK2.A ist ein integratives Plasmid basiert auf dem Vektor pMV361, die aus dem hsp60 Promotor Expression auf hohem Niveau des Glühwürmchen - Luciferase - Gens ermöglicht , und kann unter Verwendung von Kanamycin selektiert werden. </li></ol> 2. THP-1 Medium und Wartung <ol><li> Fügen Sie 50 ml hitzeinaktiviertem fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml 200 mM L-Glutamin und 500 ml RPMI 1640-Medium RPMI unvollständig (ca. 10% FBS und 2 mM Glutamin) zu machen. </li><li> Pflegen einer THP-1 - Zellkultur nach Standardprotokoll 13. THP-1-Zellen in RPMI unvollständigem Medium kurz, wachsen, während eine Zelldichte von 0,2 bis 1 Million pro ml Medium zwischen pas AufrechterhaltenWeisen. </li></ol> 3. Hochdurchsatz - Screening intrazellulärer Mit Luziferase-exprimierenden M. tuberculosis H37Rv <ol><li> Die optische Dichte einer aktiv wachsende Bakteriensuspension in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm. Berechnen Sie die Bakteriendichte unter Verwendung des Umwandlungsfaktors von 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 Bakterien pro ml. </li><li> Pipette aus genügend Bakterien für eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 10: 1 in ein neues Zentrifugenröhrchen. Pelletieren bei 3.000 × g für 10 min und aspirieren die Flüssigkeit. In 50 ul Humanserum zu 450 ul RPMI1640. Skalieren Sie die Lautstärke auf die entsprechenden Werte für das Experiment. </li><li> Um die Bakterien zu opsonieren, das Pellet bei einer Dichte von 1 x 10 8 Bakterien pro 500 ul RPMI1640 , das 10% Humanserum. Lassen Sie die Mischung bei 37 ° C für 30 min inkubieren. Bestimmen Sie die THP-1-Zellkulturdichte, indem sie mit einem Hämocytometer gezählt und ein invertiertes microscope. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen in sterilen Zentrifugenröhrchen bei 100 x g und 37 ° C für 10 min. Aspirieren den Überstand und die Zellen in RPMI unvollständig in einer Dichte von 1 Million Zellen pro ml. Hinzufügen Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) zu einer 40 ng / ml Endkonzentration. Hinweis: Dies wird als Mix Differenzierung bezeichnet werden. </li><li> Kombinieren opsonisiertes M. tuberculosis mit THP-1 Differenzierungs Mischung bei einer MOI von 10: 1 und aliquotieren die Endmischung bei 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung in einer 96-Well - Flachboden - weißen Platte. Regelmäßig rühren Sie die Mischung Einheitlichkeit zu gewährleisten. Ermöglicht die Differenzierung und die Infektion fortschreiten über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 100 &amp; mgr; l RPMI jeder. Fügen Verbindungen auf die gewünschten Konzentrationen in RPMI verdünnt unvollständig und inkubiere 3 Tage lang. </li><li> Aspirieren das Medium aus den Vertiefungen. Zugeben von 50 &amp; mgr; l Luciferase-Assay-Reagens in jede Vertiefung. Abdichten der Platten mit transparent Klebeplatte Versiegelungen. Sie 5 min Inkubation bei 22 ° C und dann eine Anzeige in einem Luminometer bei 1 s pro Vertiefung erhalten. </li></ol> 4. Die Zytotoxizität Analyse unter Verwendung eines 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay 14 <ol><li> Differenzieren THP-1-Zellen in RPMI unvollständig mit 40 ng / ml PMA in klaren 96-Loch-Platten, ergänzt. Achten Sie auf eine Zelldichte von 1 Million pro ml und aliquote 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung. Ermöglicht die Differenzierung über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 fortschreiten. </li><li> Aspirieren das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie sie zweimal mit RPMI 1640. Verbindungen in RPMI zu den Vertiefungen unvollständig verdünnt hinzufügen. Inkubieren für 3 Tage. </li><li> Man löst 0,5 g MTT in 100 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um eine Stammlösung von 5 mg machen / mL. Sterile Filter und Lagerung bei -20 ° C, vor Licht; ist es am besten diese Lösung frisch zu machen. </li><li> 2,5 h vor deme das Ende der Inkubationszeit 3-Tag, fügen Sie in jede Vertiefung 25 ul MTT-Lösung und die Inkubationszeit abzuschließen. </li><li> Bereiten 50% N, N-Dimethylformamid (DMF) durch Mischen von 250 ml DMF mit 250 ml deionisiertem Wasser. </li><li> Bereiten MTT-Extraktionspuffer, wie folgt: Man wiegt 100 g SDS in einer 500-ml-Flasche und 300 ml 50% DMF. Anwenden niedrige Hitze der SDS zu ermöglichen aufzulösen. 10 ml reiner Essigsäure und 12,5 ml 1 M HCl. Füllen bis zur 500 ml-Markierung mit 50% DMF; die endgültige Zusammensetzung des Extraktionspuffers beträgt 50% DMF, 20% SDS, 2,5% Essigsäure und 2,5% 1 M Salzsäure. </li><li> Am Ende der Behandlungszeit wird mit 100 &amp; mgr; l Extraktionspuffer (erwärmt auf 45 ° C keine Kristalle aufzulösen) in jede Vertiefung. Lassen Sie die Mischung über Nacht bei 37 inkubieren ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. Die Absorption bei 570 nm. HINWEIS: Der Zytotoxizitätstest wird am besten parallel durchgeführt mit einem intrazellularenular Bildschirm samt-Charge und das Alter der THP-1-Zellen. </li></ol> 5. In-Brühe Mit Aktivitätsanalyse einer Resazurin - Assay 3 <ol><li> Wächst M. tuberculosis in 7H9ADST zur mittleren log - Phase (~ 0,5 bis 0,8 OD 600). Verdünne die Kultur mit dem 7H9ADST bis 0,01 OD 600. Verdünne die Verbindungen in 7H9ADST die Testkonzentrationen und Aliquot 100 &amp; mgr; l der verdünnten Verbindung in jede Vertiefung auf 2x. </li><li> Übertragung von 100 &amp; mgr; l der verdünnten Bakteriensuspension in jede Vertiefung. Lassen Sie die Platten für 5 Tage bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Man löst 10 mg Resazurin in 100 ml deionisiertem Wasser und Sterilfilter. </li><li> In 30 ul Resazurin-Lösung und überwacht die Farbänderung nach 48 h; Bakterienwachstum wird durch eine Farbumwandlung von blau angezeigt rosa. ANMERKUNG: Eine quantitative Analyse kann auch durch das Messen entweder die Fluoreszenz bei 590 nm mit einer Anregung bei 530 durchgeführt werden - 560nm oder das Absorptionsvermögen bei 570 nm und 600 nm 15. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass es für diese Arbeit keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Verwendung eines menschlichen intrazellulären Infektionsmodell für M. tuberculosis Das Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und kostengünstiges HTS - Verfahren zu erstellen. Tuberkulose ist ein Mensch durch die Infektion von Alveolarmakrophagen gekennzeichnet Krankheit , die durch M. tuberculosis. Aufgrund Fragen der biologischen Sicherheit, Forschung sowohl biologische Modelle des Bakteriums und die Wirtszellen beteiligt hat in der Vergangenheit verwendet worden. Allerdings hat es sich gezeigt , d...

Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose (TB) ist eine führende Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit. Arzneimittelempfindlichen TB ist eine behandelbare Krankheit, die für einen Zeitraum von 6 Monaten mehr Antibiotika erfordert. Trotz einer behandelbaren Krankheit zu sein, wurde TB Sterblichkeit schätzungsweise 1 1,5 Millionen im Jahr 2015 sein. In den letzten 10 Jahren wurden dort zunehmende Besorgnis über die Verbreitung von arzneimittelresistenten Tuberkulose M.. Mehrfach arzneimittelresistenter Tuberkulose (MDR-TB) als TB definiert, die mindestens Isoniazid (INH) und Rifampicin (RMP) beständig ist, und die meisten MDR-TB-Stämme sind auch resistent second-line TB Medikamente auszuwählen, wodurch Behandlungsoptionen Zu . Die Auswirkungen von Medikamentenresistenz eine größere Herausforderung für die Behandlung von Patienten schaffen-Koinfektion mit Human Immunodeficiency Virus (HIV); 400.000 Patienten starben weltweit von HIV-assoziierten TB im Jahr 2015 1. Enttäuschend, den Vereinigten Staaten Food and Drug AdministRation hat nur eine neues TB - Medikament gegen MDR-TB, Bedaquilin, in den letzten 40 Jahren 2 genehmigt. Die Fortschritte bei der Suche nach besseren und kürzeren TB-Therapien sind dringend erforderlich, um vorne zu bleiben im Kampf gegen TB und MDR-TB. Traditionell TB Arzneimittel Bildschirme sind unter in vitro - Wachstumsbedingungen in einem Wachstumsmedium durchgeführt, wobei Verbindungen zu einer wachsenden Kultur und ihre Wirksamkeit hinzugefügt werden die Mikroorganismen bei der Beseitigung der durch Zählen koloniebildenden Einheiten (CFU) auf einem festen Medium bestimmt. Als Keimzahlen arbeitsintensiv, zeitraubend und teuer werden verschiedene indirekte Methoden, um dieses Problem zu lindern entwickelt. Solche Verfahren umfassen die Lebensfähigkeit Alamar - Blau - Assay 3, die Bestimmung der Fluoreszenz 4 von grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder Lumineszenz 5 von Luciferase-exprimierenden Bakterien, und die Schätzung der Gesamt Adenosintriphosphat (ATP) 6, 7. Typische TB wird durch eine Infektion mit M. tuberculosis der Lunge charakterisiert, in dem sich die Bakterien befinden , und im Inneren der Phagosomen von Alveolarmakrophagen 8 nachzubilden. Die einfache in-Brühe kann phänotypische Bildschirm extrazelluläre Erreger passen; jedoch in der historischen Perspektive getroffen Verbindungen gegen M. tuberculosis diese Methode oft identifiziert verwenden , nicht die Erwartungen bei der nachgeschalteten Validierungsschritten in Infektionsmodellen zu entsprechen . Wir schlagen vor, dass TB Medikament am besten in einem intrazellulären Wirtszelle Infektionsmodell durchgeführt wird. Dennoch besitzen die intrazelluläre Modelle viele technologische und biologische Barrieren für Hochdurchsatz-Screening (HTS) Entwicklung. Eine große Hürde ist die Komplexität des Infektionsprozesses, beispielhaft durch zahlreiche Schritte und die aufwendigen Entfernung von extrazellulären Bakterien, die durch in-zwischen dem Waschen. Eine zweite große Hürde ist die lange Zeit rederungen, als Wachstumserkennung erfolgt normalerweise durch Zählen CFU auf Kulturplatten, ist ein Prozess, vervollständigen über 3 Wochen dauert. Eine Lösung für CFU Zählungen ersetzt wurde durch automatisiertes Fluoreszenz-Mikroskopie in Kombination mit fluoreszierenden Bakterien bereitgestellt. Jedoch erfordert diese Lösung eine Erstausrüstung Investition, die für viele Forschungslabors außer Reichweite ist. Eine einfache, kostengünstige und krankheitsrelevanten HTS Verfahren würde die Drug Discovery-Prozess erheblich verbessern. In dieser Studie berichten wir über ein neues, modulares HTS - System , das auf der Bereitstellung eine schnelle und hochskalierbaren, noch wirtschaftlich, Assay geeignet zur Bestimmung der Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis gerichtet ist. Dieses System besteht aus drei Modulen: (i) intrazelluläre, (ii) die Zytotoxizität und (iii) in-Broth-Assays. Das kombinierte Endergebnis liefert eine umfassende Beschreibung der Verbindung Eigenschaften, mit zusätzlichen Informationen in Bezug auf die mögliche Wirkungsweise. diese screening System in mehreren Projekten mit verschiedenen Substanzbibliotheken verwendet worden ist, die Wirkungsweise zielen, einschließlich der Analyse von Arzneimittel Synergie 9, -secreted die Stimulation von autophagy 10 und die Hemmung von M. tuberculosis Virulenzfaktor (nicht veröffentlicht). Verbindungen unbekannter Wirkungsweise haben auch 11 untersucht worden. Eine modifizierte Version dieses Verfahrens wurde auch durch unsere Industriepartner als primäre Screening - Verfahren zur Identifizierung neuer Verbindungen gegen intrazelluläre M. tuberculosis 11 angenommen.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, Rind pH7</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>N,N- Dimethylformamid (DMF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hydrocholorinsäure (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>SDS Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>M. tuberculosis H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden weiß</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>95-Well-Platte mit flachem Boden Corning</td><td></td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Transparenter Plattenversiegeler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Biomate 3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Spektralphotometer</td><td>Biotek</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Applied Biosystems</td><td>Tropix TR717</td><td></td></tr></tbody></table>

system zur wirksamkeit und zytotoxizität screening von inhibitoren targeting intrazellulärer<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, der Erreger von Tuberkulose (TB), ist weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Mit der zunehmenden Ausbreitung von multiresistenter TB (MDR-TB) besteht eine echte Dringlichkeit, neue therapeutische Strategien gegen M. tuberculosis-Infektionen zu entwickeln. Traditionell werden Verbindungen auf der Grundlage ihrer antibakteriellen Aktivität unter In-vitro-Wachstumsbedingungen in Brühe bewertet; Für intrazelluläre Krankheitserreger wie M. tuberculosis sind die Ergebnisse jedoch oft irreführend, da sich die phänotypischen Screening-Bedingungen in der Brühe signifikant von den tatsächlichen Krankheitsbedingungen im menschlichen Körper unterscheiden. Das Screening auf Inhibitoren, die in Makrophagen wirken, war aufgrund der Komplexität, der Variabilität der Infektion und der langsamen Replikationsrate von M. tuberculosis traditionell schwierig. In dieser Studie berichten wir über einen neuen Ansatz, um die Wirksamkeit von Verbindungen auf die Lebensfähigkeit von M. tuberculosis in einem Makrophagen-Infektionsmodell schnell zu bewerten. Mit einer Kombination aus einem Zytotoxizitätstest und einem In-Bouillon-Viabilitätsassay von M. tuberculosis konnten wir ein Screening-System erstellen, das eine umfassende Analyse der interessierenden Verbindungen ermöglicht. Dieses System ist in der Lage, quantitative Daten zu geringen Kosten zu produzieren, die für die meisten Labore erschwinglich sind und dennoch hochgradig skalierbar sind, um für große industrielle Umgebungen geeignet zu sein.

Hochdurchsatz - Screening unter Verwendung von intrazellulären M. tuberculosis exprimieren das Luciferasegen 2A und Tabelle 1 enthalten die Rohdaten von dem Luminometer gesammelt, in relativen Lumineszenz - Einheiten ausgedrückt (RLU), zeigen die Wirkung einer Erhöhung der Konzentration des Arzneimittels TB Rifampicin auf M. tuberculosis innerhalb THP-1 - Zellen. 2A</str...

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine mehrdimensionale Bewertung darüber zu ermöglichen, wie Verbindungen das Überleben von M. tuberculosis in menschlichen Makrophagen beeinflussen. Diese Methode basiert auf einem Wirksamkeitsnachweis, der auf Luciferase beruht. In Kombination mit einem Zytotoxizitäts- und einem MIC-Test kann sie nützliche Informationen für die Modifizierung von HIT-Verbindungen in der Entwicklung von Tuberkulosemedikamenten liefern.Der Hauptvorteil unserer Methode liegt in der Zeit- und Arbeitsersparnis. Sie ersetzt einen CFU-Koloniebildenden-Einheiten-Assay durch einen auf Luciferase basierenden Assay. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten mit der Konsistenz beim manuellen Pipettieren im Vergleich zur Automatisierung.Eine einheitliche Pipettier-Technik ist entscheidend. Kultivieren Sie THP1-Zellen in RPMI in komplettem Medium. Dabei zwischen den Passagen eine Zelldichte von 0,2 bis eine Million Zellen pro Milliliter Medium aufrechterhalten.Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die OD600 einer aktiv wachsenden bakteriellen Suspension zu messen. Berechnen Sie anschließend die Bakteriendichte unter Verw

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektionen. Es wird ein in vitro Infektionsmodell mit Mtb/Makrophagen-Aggregaten erstellt, das eine in vivo Infektion nachahmt. Bei der Einführung geeigneter Antibiotika wird deren Wirksamkeit mittels Resuzarin-Assay getestet, um das Überleben von Bakterien mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen zu überwachen.

Ein Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen ein Mycobacterium tuberculosis-Infektionsmodell

Dieses Video zeigt einen In-Bouillon-Assay zur Bestimmung der Wirksamkeit von Antibiotika gegen Mycobacterium tuberculosis. Die Bakterienkultur wird mit unterschiedlichen Konzentrationen eines bakteriziden Antibiotikums inkubiert. Die bakterizide Wirksamkeit wird gemessen, indem das Vorhandensein lebensfähiger Bakterien mit einem Resazurin-Assay beurteilt wird.

Bewertung der Wirksamkeit eines Testpräparats gegen Mykobakterien in Brühe

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Das charcoal agar resazurin assay (CARA) ist eine semiquantitative Methode mit mittlerem Durchsatz zur Beurteilung der Aktivität von Testmitteln gegen Mykobakterien, die replizieren, nicht replizieren oder beides.  Der CARA ermöglicht eine schnelle Bewertung der zeit- und konzentrationsabhängigen Aktivität und identifiziert Parameter, die mit Assays für koloniebildende Einheiten (KBE) verfolgt werden sollen.

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu...

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Eine schnelle und effiziente Quantifizierung des intrazellulären M . tuberculosis-Wachstums ist entscheidend für verbesserte Therapien gegen Tuberkulose (TB). Dieses Protokoll beschreibt einen brühebasierten kolorimetrischen Detektionsassay unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkultursystems zur Quantifizierung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit Wirtstherapiekandidaten behandelt werden.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Die Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE) ist die Goldstandard-Technik zur Quantifizierung von Bakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis , die Wochen brauchen kann, um sichtbare Kolonien zu bilden. Hier beschreiben wir eine Mikrokbe für die KBE-Bestimmung mit erhöhter Zeiteffizienz, reduziertem Laborplatz und Reagenzienkosten sowie Skalierbarkeit auf Experimente mit mittlerem und hohem Durchsatz.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

In dieser Studie wurde ein Assay für das Hochdurchsatz-Screening gegen Mycobacterium abscessus mit einem kürzlich entwickelten Doppelreporterstamm entwickelt, der Fluoreszenz und Lumineszenz verwendet, um die Lebensfähigkeit von Bakterien schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll wird für Forscher relevant sein, die neue Medikamente gegen diese arzneimittelresistenten Bakterien untersuchen wollen.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung potenzieller Anti-Tuberkulose-Medikamentenkandidaten durch phänotypisches Screening vor, das die chemische Synthese einer 4-Aminochinolin-Verbindung, die Bestimmung der minimalen inhibitorischen Konzentration gegen Mycobacterium tuberculosis und die Bewertung ihrer Zytotoxizität in Säugetierzelllinien umfasst.

Identifikation potenzieller Anti-TB-Kandidaten: Ein Schritt-für-Schritt-Leitfaden zur Synthese, MIC-Bestimmung und Zytotoxizitätsbewertung in Säugetierzellen

Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening zur Wirksamkeits- und Zytotoxizitätsprüfung von Inhibitoren gegen intrazelluläres Mycobacterium tuberculosis in humanen Makrophagen. Diese Luciferase-basierte Methode ersetzt zeitaufwendige CFU-Assays und beschleunigt die Tuberkulose-Arzneimittelentwicklung durch automatisierte Prozesse.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer

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