Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, ein Polydimethylsiloxan-Polycarbonat-Mikrofluidikgerät für die Migration von Säugetierzellen unter verschiedenen Kombinationen von senkrechten chemischen und Sauerstoffgradienten zu etablieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in Studien zur Migration von Säugetierzellen zu beantworten, einschließlich der Auswirkungen dieser Gradienten auf die Migration verschiedener Zelltypen oder Zellen mit OTE-Genen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der gesamte Versuchsaufbau in einem herkömmlichen Inkubator durchgeführt werden kann, um optimale Zellkulturbedingungen ohne langwierigen Aufbau und sperrige Instrumente

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose der Metastasierungsfähigkeit von Krebszellen, da die Zellmotilität und die verschiedenen physiologisch bedingten Gradienten mit dem mikrofluidischen Gerät charakterisiert werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Migration von Säugetierzellen geben. Es kann auch auf andere Zellstudien angewendet werden, wie z. B. auf zellbasierte In-vitro-Wirkstofftests zu den Kombinationen von Wirkstoffkonzentrationen und Sauerstoffspannungen.

Übertragen Sie zwei Gramm Polydimethylsiloxan oder PDMS-Prepolymer auf die Form mit den fluidischen Kanalmustern der obersten Schicht, um eine dünne Schicht PDMS herzustellen. Stellen Sie dann die Form in einen Exsikkator, um das PDMS 60 Minuten lang zu entgasen. Stellen Sie die Form nach dem Entgasen über Nacht in einen 60 Grad Celsius heißen Ofen, um sie mit PDMS auszuhärten.

Achte darauf, dass sich die Form in einer horizontalen Ebene befindet. Nachdem Sie die Form auf Raumtemperatur abgekühlt haben, gießen Sie weitere 13 Gramm PDMS-Prepolymer auf die Form und entgasen Sie das PDMS dann 60 Minuten lang im Exsikkator. Betten Sie langsam eine einen Millimeter dicke Polycarbonat- oder PC-Folie als Gasdiffusionsbarriere in die frische PDMS-Schicht ein.

Stoßen Sie alle vorhandenen Blasen aus. Stellen Sie die Form dann über Nacht in den 60 Grad Celsius heißen Ofen. Achte darauf, dass sich die Form auf einer horizontalen Ebene befindet.

Nach dem Abkühlen des ausgehärteten PDMS auf Raumtemperatur schneiden Sie das Gerät mit einem Skalpell auf eine Fläche von etwa 5,5 mal fünf Quadratzentimetern, die alle Kanalmuster abdecken kann. Schälen Sie dann das PDMS-Labor aus der Form. Stanzen Sie anschließend Löcher für Ein- und Auslässe mit einem Biopsiestempel mit einem Durchmesser von zwei Millimetern.

Lagern Sie die gefertigte obere PDMS-PC-Schicht für die spätere Montage vor Umgebungsstaub geschützt. Um das Gerät zusammenzubauen, legen Sie zunächst die gefertigte PDMS-PC-Deckschicht und den Wafer mit der spinkodierten PDMS-Membran mit den Klebeflächen nach oben in eine Sauerstoff-Plasma-Oberflächenbehandlungsmaschine. Behandeln Sie die PDMS-Oberflächen 40 Sekunden lang mit 90 Watt Sauerstoffplasma.

Kleben Sie die Deckschicht unmittelbar nach der Sauerstoffplasma-Oberflächenbehandlung auf die PDMS-Membran. Legen Sie ein Gewicht auf die verklebten Schichten und legen Sie sie über Nacht in einen 60 Grad Celsius heißen Ofen, um die Verklebung zu fördern. Nachdem die Verbundschichten auf Raumtemperatur abgekühlt sind, schneiden Sie die mit der Deckschicht verklebte Membran mit einem Skalpell auf eine Fläche von etwa 5,5 mal fünf Quadratzentimetern ab.

Schälen Sie die gebundene Struktur vom Siliziumwafer und stanzen Sie mit einem Biopsiestempel von zwei Millimetern Durchmesser Löcher an den Ein- und Ausgängen des chemischen Gradientenkanals. Legen Sie dann die membrangebundene Deckschicht und die hergestellte PDMS-Unterschicht mit den Klebeflächen nach oben in die Sauerstoffplasma-Oberflächenbehandlungsmaschine. Um die PDMS-Oberflächen zu aktivieren, verwenden Sie das Plasma bei 90 Watt für 40 Sekunden.

Befestigen Sie die obere und untere Schicht für die Verklebung unmittelbar nach der Oberflächenbehandlung miteinander. Legen Sie das Gewicht auf das gesamte geklebte Gerät und lassen Sie es über Nacht in einem 60 Grad Celsius heißen Ofen. Nehmen Sie am nächsten Tag das gesamte gefertigte Gerät aus dem Ofen und kühlen Sie es auf Raumtemperatur ab.

Beginnen Sie den mikrofluidischen Zellmigrationsassay durch Präparation der Zellen im Gerät, wie im Textprotokoll beschrieben. Am zweiten Tag aspirieren Sie das Medium aus den Zellen, die seit dem Tag Null kultiviert wurden, und waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern DPBS. Aspirieren Sie das DPBS und fügen Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA hinzu, dann inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang im Inkubator, um die Zellen von der Kolbenoberfläche zu lösen.

Sobald die Zellen abgelöst und in der Lösung suspendiert sind, werden acht Milliliter serumfreies Medium in den Kolben gegeben. Füllen Sie alle Flüssigkeiten in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen um und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 140-facher G-Temperatur. Nach der Zentrifugation wird der Überstand aspiriert und eine angemessene Menge serumfreies Medium für eine endgültige Zelldichte von einer Million Zellen pro Milliliter zugegeben.

Nehmen Sie dann das mikrofluidische Gerät heraus, das am ersten Tag vorbereitet wurde, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer stumpfen 14-Gauge-Nadel, um das serumfreie Medium durch den Auslass des chemischen Gradientenkanals zu injizieren, bis das Medium aus beiden Nadeln an den Einlässen austritt. Injizieren Sie dann 200 Mikroliter der Zellsuspension aus dem Auslass des chemischen Gradientenkanals.

Beobachten Sie die Zellkulturkammer im Gerät unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen in den mikrofluidischen Kanal eingeführt wurden. Stellen Sie das Gerät dann in einen feuchten Behälter und bewahren Sie es fünf Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator auf, um die Adhäsion der Zellen auf der Geräteoberfläche zu fördern. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Chemikalie in der gewünschten Konzentration in einem serumfreien Medium vor.

Ziehen Sie das serumfreie Medium mit und ohne Chemikalie in zwei separate Drei-Milliliter-Spritzen, die mit dem hochreinen Schlauch verbunden sind. Richten Sie dann die Spritzen für den späteren Gebrauch auf einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussmenge von einem Mikroliter pro Minute ein. Stellen Sie als nächstes 15 Milliliter einer einmolaren Natriumhydroxidlösung und 15 Milliliter 200 Milligramm pro Milliliter Pyrogallollösung her.

Ziehen Sie die Natronlauge in eine 15-Milliliter-Spritze, die mit einem hochreinen PFTE-Schlauch verbunden ist, und ziehen Sie die Pyrogallol-Lösung in eine 15-Milliliter-Spritze, die mit einem hochreinen Schlauch verbunden ist. Setzen Sie die Spritzen für den späteren Gebrauch auf eine Spritzenpumpe mit einer Durchflussmenge von fünf Mikrolitern pro Minute. Nehmen Sie nach der fünfstündigen Inkubation das gesamte Gerät heraus und legen Sie es auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern.

Befestigen Sie das Gerät mit Klebekitt in der Petrischale und übertragen Sie die Petrischale dann in ein Mikroskop für lebende Zellen in einem Inkubator. Verbinden Sie den Schlauch von den Spritzen mit den Einlässen des chemischen Gradientenkanals, um den chemischen Gradienten zu erzeugen. Verbinden Sie dann den Auslass mit dem Schlauch, der zu einem Abfallbehälter führt.

Schalten Sie die Spritzenpumpe mit den Spritzen ein, um den chemischen Gradienten zu erzeugen. Verbinden Sie als Nächstes den hochreinen Schlauch aus den Spritzen, die Natriumchlorid und Pyrogallol enthalten, mit den Einlässen des Sauerstoffgradientenkanals. Schließen Sie den Schlauch an den Auslass an, um den Abfall aufzufangen, und schalten Sie die Spritzenpumpe mit den Spritzen ein, um einen Sauerstoffgradienten zu erzeugen.

Geben Sie etwa 15 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in die Petrischale, um das Gerät mit Feuchtigkeit zu versorgen. Richten Sie dann das Mikroskop für die Bildgebung lebender Zellen für die Zeitrafferaufnahme ein und nehmen Sie alle 15 Minuten ein Bild auf. Führen Sie die Datenerfassung und -analyse sowie die Charakterisierung von Gradienten durch, wie im Textprotokoll beschrieben.

Hier sind repräsentative Ergebnisse von chemischen Gradienten dargestellt, die innerhalb des mikrofluidischen Geräts für die Zellmigration erzeugt wurden. Das numerische Simulationsergebnis stimmt gut mit der experimentellen Charakterisierung mit Fluoreszeinlösung als Chemikalie überein. Auch die Gradienten anderer Chemikalie wie Chemokin SDF-1 alpha können mit der Simulation vorab abgeschätzt werden.

Sauerstoffgradienten, die innerhalb des Geräts erzeugt werden, können mit sauerstoffempfindlichem Fluoreszenzfarbstoff experimentell charakterisiert werden. Typischerweise können Sauerstoffgradienten von 1 % stromaufwärts bis 16 % stromabwärts innerhalb des Geräts stabil hergestellt werden. Hier sind typische Zeitrafferbilder, die während der Experimente mit einem Lebendzellmikroskop aufgenommen wurden.

Nach der Bildanalyse können die Migrationstrajektorien von A549-Zellen und ihre durchschnittlichen Bewegungen berechnet werden. Wenn keine Gradienten vorhanden sind, zeigen Zellen eine zufällige Migration, und die durchschnittliche Bewegung liegt nahe Null. Mit nur einem SDF-1-alpha-Chemokin-Gradienten zeigen die Zellen chemotaktisches Verhalten und wandern wie erwartet in Richtung des hohen Chemokin-Gradienten.

Mit nur einem Sauerstoffgradienten bewegen sich die Zellen in die sauerstoffarme Richtung und zeigen ein aerotaktisches Verhalten, das für Säugetierzellen bisher nicht gut untersucht wurde. Interessanterweise bewegen sich die Zellen sowohl mit dem Chemokin- als auch mit dem Sauerstoffgradienten in Richtung des sauerstoffarmen Gradienten, was zeigt, dass der Sauerstoffgradient dominante Effekte hat. Diese Beobachtung bedarf weiterer Studien.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Gerät während der Herstellung gut zu nivellieren und Luftblasen innerhalb des mikrofluidischen Geräteaufbaus während des Zellmigrationsexperiments zu beseitigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein mikrofluidisches PDMS-PC-Gerät vorbereitet und die Experimente zur Untersuchung der Migration von Säugetierzellen unter Kombinationen von chemischen und Sauerstoffgradienten einrichtet.