Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine Polydimethylsiloxan-Polycarbonat-Mikrofluidikvorrichtung zur Untersuchung der Migration von Säugetierzellen unter verschiedenen Kombinationen senkrechter chemischer und Sauerstoffgradienten einzurichten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Forschung zur Migration von Säugetierzellen zu beantworten, einschließlich der Auswirkungen dieser Gradienten auf die Migration verschiedener Zelltypen oder Zellen mit anderen Genen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der gesamte experimentelle Aufbau in einem herkömmlichen Inkubator unter optimalen Zellkulturbedingungen durchgeführt werden kann, ohne aufwändige Vorbereitungen und sperrige Instrumente zu benötigen.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Diagnose der Metastasierungsfähigkeit von Krebszellen, da die Zellmotilität und die verschiedenen physiologisch relevanten Gradienten mithilfe der mikrofluidischen Vorrichtung charakterisiert werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Migration von Säugetierzellen liefern. Sie kann außerdem auf andere Zelluntersuchungen angewandt werden, beispielsweise auf zellbasierte In-vitro-Testungen von Wirkstoffkombinationen hinsichtlich Wirkstoffkonzentrationen und Sauerstoffpartialdrücken.

Übertragen Sie zwei Gramm Polydimethylsiloxan, oder PDMS-Präpolymer, auf die Form mit den Kanalmustern für die obere fluidischen Schicht, um eine dünne PDMS-Schicht zu erzeugen. Anschließend stellen Sie die Form für 60 Minuten in eine Desiccator-Anordnung, um das PDMS zu entgasen. Nach der Entgasung belassen Sie die Form über Nacht in einem Ofen bei 60 Grad Celsius, um das PDMS auszuhärten.

Stellen Sie sicher, dass sich die Form in einer horizontalen Ebene befindet. Nachdem die Form auf Raumtemperatur abgekühlt ist, gießen Sie weitere 13 Gramm PDMS-Präpolymer auf die Form und entgasen Sie das PDMS anschließend 60 Minuten lang in der Desiccator-Anordnung. Bringen Sie langsam eine einen Millimeter dicke Polycarbonatfolie (PC-Folie) als Gassperrschicht in die frische PDMS-Schicht ein.

Entfernen Sie eventuell vorhandene Blasen. Anschließend stellen Sie die Form über Nacht in den Ofen bei 60 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die Form in einer horizontalen Ebene steht.

Nachdem das gehärtete PDMS auf Raumtemperatur abgekühlt ist, schneiden Sie das Gerät mit einem Skalpell auf eine Fläche von etwa 5,5 mal fünf Quadratzentimetern zu, die alle Kanalmuster abdecken kann. Anschließend lösen Sie das PDMS-Gerät vorsichtig von der Form ab. Danach stanzen Sie mit einer zweimillimeterdurchmessigen Biopsiepunch-Lochstanzvorrichtung Öffnungen für Zulauf- und Ablauföffnungen aus.

Bewahren Sie die hergestellte obere PDMS-PC-Schicht zur späteren Montage vor Umgebungsstaub geschützt auf. Um das Gerät zusammenzubauen, legen Sie zunächst die hergestellte obere PDMS-PC-Schicht und das Wafer mit der spin-beschichteten PDMS-Membran in eine Sauerstoff-Plasma-Oberflächenbehandlungsmaschine, wobei die Verbindungsoberflächen nach oben zeigen. Behandeln Sie die PDMS-Oberflächen 40 Sekunden lang mit 90 Watt Sauerstoff-Plasma.

Verbinden Sie die Deckschicht unmittelbar nach der Oberflächenbehandlung mit Sauerstoff-Plasma mit der PDMS-Membran. Legen Sie ein Gewicht auf die verbundenen Schichten und stellen Sie diese über Nacht in einen Ofen bei 60 Grad Celsius, um die Bindung zu fördern. Sobald die verbundenen Schichten auf Raumtemperatur abgekühlt sind, schneiden Sie die mit der Deckschicht verbundene Membran mit einem Skalpell auf eine Fläche von etwa 5,5 mal fünf Quadratzentimetern zu.

Lösen Sie die verbundene Struktur von der Siliziumwafer ab und stanzen Sie mit einem zweimillimeterdurchmessigen Biopsiestanzer Löcher an den Einlässen und Auslässen des chemischen Gradientenkanals aus. Anschließend platzieren Sie die mit der Membran verbundene Deckschicht und die hergestellte PDMS-Basisschicht in der Sauerstoff-Plasma-Oberflächenbehandlungsmaschine, wobei die Verbindungsoberflächen nach oben zeigen. Um die PDMS-Oberflächen zu aktivieren, verwenden Sie das Plasma bei 90 Watt für 40 Sekunden.

Verbinden Sie die oberen und unteren Schichten unmittelbar nach der Oberflächenbehandlung miteinander. Stellen Sie ein Gewicht auf das gesamte verbundene Bauteil und lassen Sie es über Nacht in einem Ofen bei 60 Grad Celsius. Nehmen Sie das vollständig hergestellte Bauteil am nächsten Tag aus dem Ofen und kühlen Sie es auf Raumtemperatur ab.

Beginnen Sie den mikrofluidischen Zell-Migrationsassay mit der Vorbereitung der Zellen im Gerät, wie im Textprotokoll beschrieben. Am zweiten Tag saugen Sie das Medium von den seit Tag null kultivierten Zellen ab und waschen die Zellen zweimal mit je fünf Milliliter DPBS. Saugen Sie das DPBS ab und geben Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang im Inkubator, um die Zellen von der Flaschenoberfläche zu lösen.

Nachdem die Zellen gelöst und in der Lösung suspendiert sind, fügen Sie acht Milliliter serumfreies Medium dem Kolben hinzu. Überführen Sie alle Flüssigkeiten in ein 15-Milliliter-Konizglas und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 140×g. Nach der Zentrifugation saugen Sie den Überstand ab und geben eine geeignete Menge serumfreies Medium zu, um eine endgültige Zelldichte von einer Million Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Entnehmen Sie dann das am ersten Tag gemäß der Textanleitung vorbereitete mikrofluidische Gerät. Geben Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer stumpfen 14-Gauge-Nadel das serumfreie Medium durch den Auslass des chemischen Gradientenkanals, bis das Medium an beiden Nadeln an den Eingängen austritt. Anschließend injizieren Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension über den Auslass des chemischen Gradientenkanals.

Beobachten Sie die Zellkulturkammer im Gerät unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen in den mikrofluidischen Kanal eingeführt wurden. Anschließend stellen Sie das Gerät in einen feuchten Behälter und lagern es fünf Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator, um die Adhäsion der Zellen an der Geräteoberfläche zu fördern. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die chemische Substanz in der gewünschten Konzentration in serumfreiem Medium vor.

Ziehen Sie das serumfreie Medium mit und ohne die Chemikalie in zwei separate Dreimilliliter-Spritzen, die mit der Hochreinheits-Schlauchleitung verbunden sind. Bereiten Sie anschließend die Spritzen auf einer Spritzenpumpe mit einer Flussrate von einem Mikroliter pro Minute für den späteren Gebrauch vor. Danach stellen Sie 15 Milliliter einer einmolaren Natriumhydroxidlösung und 15 Milliliter einer Pyrogallollösung mit 200 Milligramm pro Milliliter her.

Ziehen Sie die Natronlauge-Lösung in eine 15-Milliliter-Spritze, die mit einem hochreinen PFTE-Schlauch verbunden ist, und ziehen Sie die Pyrogallol-Lösung in eine 15-Milliliter-Spritze, die mit einem hochreinen Schlauch verbunden ist. Stellen Sie die Spritzen an einer Spritzenpumpe mit einer Fließgeschwindigkeit von fünf Mikrolitern pro Minute für den späteren Gebrauch bereit. Nach der fünf Stunden dauernden Inkubation nehmen Sie das gesamte Gerät heraus und stellen es auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern.

Befestigen Sie das Gerät mit Haftknetmasse in der Petrischale und bringen Sie die Petrischale anschließend unter einem Live-Cell-Imaging-Mikroskop in einem Inkubator an. Schließen Sie die Schläuche der Spritzen an die Zuleitungen des chemischen Gradientenkanals an, um den chemischen Gradienten zu erzeugen. Anschließend verbinden Sie den Auslass mit dem Schlauch, der zu einem Abfallreservoir führt.

Schalten Sie die Spritzenpumpe mit den Spritzen zur Erzeugung des chemischen Gradienten ein. Anschließend verbinden Sie die Hochreinheitsschläuche von den Spritzen, die Natriumchlorid und Pyrogallol enthalten, mit den Einlässen des Sauerstoffgradientkanals. Schließen Sie den Schlauch an den Auslass an, um das Abfallprodukt zu sammeln, und schalten Sie die Spritzenpumpe mit den Spritzen zur Erzeugung des Sauerstoffgradienten ein.

Fügen Sie etwa 15 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in die Petrischale hinzu, um das Gerät feucht zu halten. Richten Sie dann das Live-Cell-Imaging-Mikroskop für die zeitraffende Bildaufnahme ein und nehmen Sie alle 15 Minuten ein Bild auf. Führen Sie die Datensammlung und -analyse sowie die Charakterisierung der Gradienten wie im Textprotokoll beschrieben durch.

Hier gezeigte repräsentative Ergebnisse chemischer Gradienten, die innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung zur Zellmigration erzeugt wurden. Das Ergebnis der numerischen Simulation stimmt gut mit der experimentellen Charakterisierung unter Verwendung einer Fluoresceinlösung als chemische Substanz überein. Auch die Gradienten anderer Chemikalien, wie beispielsweise des Chemokins SDF-1 alpha, können mithilfe der Simulation bereits im Voraus abgeschätzt werden.

Sauerstoffgradienten, die innerhalb des Geräts erzeugt werden, können experimentell mittels sauerstoffempfindlichem Fluoreszenzfarbstoff charakterisiert werden. Üblicherweise können Sauerstoffgradienten von 1 % am Eingang bis 16 % am Ausgang stabil innerhalb des Geräts etabliert werden. Hier gezeigt sind typische Zeitrafferaufnahmen, die während der Experimente mit einem Live-Cell-Imaging-Mikroskop aufgenommen wurden.

Nach der Bildanalyse können die Migrationsbahnen von A549-Zellen und ihre durchschnittlichen Bewegungen berechnet werden. Ohne Gradienten zeigen die Zellen eine zufällige Migration, und die durchschnittliche Bewegung liegt nahe bei null. Bei alleinigem Vorhandensein eines SDF-1-alpha-Chemokin-Gradienten zeigen die Zellen chemotaktisches Verhalten und wandern, wie erwartet, in Richtung des hohen Chemokin-Gradienten.

Bei alleinigem Sauerstoffgradient bewegen sich die Zellen in Richtung des niedrigen Sauerstoffgehalts, was ein aerotaktisches Verhalten zeigt, das für Säugetierzellen bisher wenig untersucht wurde. Interessanterweise bewegen sich die Zellen bei gleichzeitiger Anwesenheit von Chemokin- und Sauerstoffgradienten ebenfalls in Richtung des niedrigen Sauerstoffgehalts, was darauf hindeutet, dass der Sauerstoffgradient dominierende Effekte hat. Diese Beobachtung bedarf weiterer Untersuchungen.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, das Gerät während der Herstellung sorgfältig zu nivellieren und Luftblasen in der mikrofluidischen Vorrichtung während des Zell-Migrations-Experiments zu vermeiden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine PDMS-PC-mikrofluidische Vorrichtung herstellt und die Experimente aufbaut, um die Migration von Säugetierzellen unter Kombinationen von chemischen und Sauerstoffkonzentrationsgradienten zu untersuchen.