Name: Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie, wie synthetisch modifizierte E. coli programmierbare Materialoberflächen steuern. Diese Methode kombiniert Gentechnik und Oberflächenfunktionalisierung für dynamische Sensoren in Molekularmedizin.

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Die Autoren danken Unterstützung von preis FA9550-13-1-0108 von der Air Force Office of Scientific Research der USA. Die Autoren erkennen zusätzlich Unterstützung von preis N00014-15-1-2502 vom Office of Naval Research der USA, aus dem Institut die Finanzierung für kritische Technik und angewandte Wissenschaft an der Virginia Polytechnic Institute und State University und der National Science Foundation Graduierten Fellowship-Programm, Verleihungsnummer 1607310.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben für die Anbindung entwickelt lebenden Zellen mit einem funktionalisierten Materialoberfläche eine neue Strategie vorgestellt. Dies wurde durch die Entwicklung einer Zelllinie erreicht der Lage, erhöhte Konzentrationen von Biotin zu synthetisieren, wenn sie mit IPTG induziert. Die erhöhten Mengen an Biotin kann dann verwendet werden, um die funktionalisierte Oberfläche zu modifizieren. Die Protokolle detailliert , wie die E. coli - Zelllinie zu entwickeln und , wie zwei verschiedene funktionalisierte O...

Hier berichten wir über die Verfahren für eine programmierbare Substrat zu entwickeln, das von einer konstruierten Zelllinie ein chemisches Signal reagiert. 1 Wir tun dies durch eine Biotin-Streptavidin - Schnittstelle zu schaffen, die von synthetisch engineered Escherichia coli (E. coli) Zellen erzeugt an Biotin reagiert. Zuvor programmierbare Oberflächen wurden für eine Vielzahl von Anwendungen von Toxinnachweis 2 und Point-of-Care - Diagnostik 3 Verteidigung und Sicherheit entwickelt. 4 Während programmierbare Oberflächen können nützlich als Sensoren und Aktoren sein, können sie gemacht &quot;intelligenter&quot; werden , indem sie mit der Fähigkeit zur Anpassung an verschiedene Umweltprobleme ausstatten. Im Gegensatz dazu sogar einfache Mikroorganismen, wie E. coli, weisen inhärente Anpassungsfähigkeit und sind in der Lage Challenges mit ausgeklügelter und oft unerwartete Lösungen reagieren. Diese Anpassungsfähigkeit ermöglicht hat E.coli - Populationen durch ihre komplexe Gen - Netzwerke gesteuert, kosteneffektiv Ressourcen suchen, 5 Mehrwert-Produkte erstellen, 6 und sogar Strommikromaßstab Robotik. 7 Durch die Kopplung der adaptive Vorteile von Zellen mit der Verwendung von programmierbaren Oberflächen leben, können wir ein Smart Substrat fähig der Reaktion auf unterschiedliche Umweltbedingungen zu schaffen. Synthetische Biologie hat sich die Forscher neue Fähigkeiten gegeben, das Verhalten von Lebewesen zu programmieren. Durch Zellen Engineering neue Gen regulatorische Netzwerke enthalten, können die Forscher Zellen entwickeln, die eine Reihe von programmierten Verhalten zeigen. 8, 9 Jenseits der Grundlagenforschung, diese Verhaltensweisen für Anwendungen wie Material Montage Steuern und biologisch produzierenden Mehrwert-Produkte werden können. 10 Hierin wir ausführlich , wie wir die Werkzeuge der synthetischen Biologie verwendet , um eningenieur ein E. coli - Stamm, der Biotin bei Induktion synthetisiert. Dieser Stamm wurde unter Verwendung von Restriktionsenzym-Klonierungsverfahren entwickelt ein Plasmid, pKE1-lacI-bioB zu montieren. Dieses Plasmid, wenn es in E. coli - Stamm K-12 MG1655 transformiert, ausstattet Zellen mit der Fähigkeit , erhöhte Mengen an bioB, ein essentielles Enzym für die Biotin - Synthese zu exprimieren. Wenn transformierte Zellen mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und mit einem Biotin-Vorläufer Desthiobiotin (DTB) induziert wurden, wurden erhöhte Spiegel an Biotin hergestellt. Biotin der Bindungs-Wechselwirkung mit Streptavidin ist einer der stärksten nicht-kovalenten Bindungen in der Natur gefunden. Als solches ist das Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung sowohl gut charakterisiertes und hoch in der Biotechnologie eingesetzt. 11 In diesem Manuskript, stellen wir zwei Strategien , um die Biotin-Streptavidin - Wechselwirkung unter Verwendung von zell hergestellt Biotin mit einer funktionalisierten Oberfläche zu erfassen und zu erkennen. Wirbeziehen sich auf diese kontrastierenden Oberflächen als &quot;indirekte&quot; und &quot;direkt&quot; Steuerungsschemata. Bei der indirekten Steuerschema, Zelle produzierte Biotin konkurriert mit Biotin, die für Streptavidin-Bindungsstellen auf einer Polystyroloberfläche konjugiert und immobilisiert wurde. Zusätzlich wird das Streptavidin mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert. HRP modifiziert 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-Tetramethylbenzidin (TMB), ein optisches Signal 12 zu erzeugen , die durch Quantifizierung der spektralen Extinktion (dh, optische Dichte) bei 450 nm (OD 450) überwacht werden kann. Somit erlaubt die indirekte Steuerschema Forscher durch die Überwachung der Abschwächung des OD 450 Signalzelle produzierten Biotin zu messen. Die direkte Steuerungsschema nutzt die Streptavidin-Biotin-Ereignis durch Streptavidin direkt auf eine Materialoberfläche zu immobilisieren und ermöglicht Zelle produzierten Biotin und biotinylierte HRP für Streptavidin-Bindungsstellen zu konkurrieren. Wiederum ist dasrelativen Mengen an zell erzeugt Biotin sind durch Messen einer OD 450 - Signal überwacht. Zusammengenommen sind die gentechnisch veränderten Zellen und funktionalisierten Oberflächen erlauben, die Eigenschaften eines programmierbaren Oberfläche zu steuern, indem Netzwerke in lebenden Zellen zu induzieren. Mit anderen Worten, haben wir ein System geschaffen, das gemeinsam durch die Verknüpfung dieser Systeme Vorteil der Anpassungsfähigkeit von lebenden Organismen und die Zuverlässigkeit und die Spezifikation einer engineered Materialgrenzfläche stattfindet.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Müller&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, Minimimale Salze, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Casaminosäuren&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat, wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid, Dihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glukose), wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Zelllinie</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotid Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N Synthese, DSL Aufreinigung</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Reaktionspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromid, 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskits</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaktionspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Glasbeschichtung Perlen&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl trans-4-(maleimidylmethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetaessigsäure (EDTA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidin (TMB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500 Zentrifugalkonzentratoren&nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat, wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Polystyrolplatten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

unter verwendung der synthetischen biologie lebenden zellen zu entwickeln, die schnittstelle mit programmierbarer materialien

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Wir haben einen abiotischen-biotischen Schnittstelle entwickelt, die gentechnisch veränderten Zellen erlaubt es, die Materialeigenschaften eines funktionalisierten Oberfläche zu steuern. Eine synthetisch konstruierte Stamm von E. coli Zellen und eine funktionalisierte Materialoberfläche: Dieses System wird durch die Schaffung von zwei Modulen. Innerhalb dieses Papier wir detailliert ein Protokoll für die gentechnische Veränderung von ausgewählten Verhalten in einem Stamm von E. coli unter Verwendung von molekularem Klonierungsstrategien. Einmal entwickelt, produziert dieser Stamm erhöhte Mengen an Biotin, wenn sie einer chemischen Induktors ausgesetzt. Zusätzlich wir detaillierter Protokolle zur Schaffung von zwei unterschiedlichen funktionalisierten Oberflächen, von denen jede Lage zu Zelle synthetisierte Biotin zu reagieren. Zusammengenommen stellen wir eine Methodik ein verknüpftes, abiotische-biotische System für die Erstellung, die Zellen zu steuern, Materialzusammensetzung und die Montage auf nicht lebenden Substraten entwickelt, ermöglicht.

Repräsentative Ergebnisse sind in den beigefügten fünf Figuren dargestellt. Zunächst stellen wir die Klonprozess grafisch (Abbildung 1) , so dass der Leser visuell die entscheidenden Schritte für die Erstellung der synthetisch konstruierte E. coli - Stamm folgen kann. Um die Populationsdynamik der Zellen zu kennzeichnen, stellen wir eine Wachstumskurve (Figur 2) erzeugt , indem die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) der Population zu...

Dieser Beitrag stellt eine Reihe von Protokollen für die gentechnisch veränderten Zellen entwickeln und funktionalisierte Oberflächen , die synthetisch konstruierte E. coli steuern können , und programmierbare Materialoberflächen zu manipulieren.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, synthetisch modifizierte E. coli einzusetzen, um programmierbare Materialoberflächen durch Kombination genetischer Modifikation und Oberflächenfunktionalisierung zu steuern und zu manipulieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in Bereichen wie der molekularen Medizin und der Umweltüberwachung zu beantworten. Indem genetisch programmierte Zellen eine lokale Umgebung interpretieren und ein funktionalisiertes Material entsprechend modifizieren, stellen wir ein modulares Werkzeug für eine Vielzahl von Anwendungen bereit.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass lebende Zellen als dynamische Sensoren fungieren können, die über funktionalisierte Grenzflächen in der Lage sind, die sie umgebenden Bedingungen zu erfassen, zu verarbeiten und aufzuzeichnen. Nachdem die Lösungen vorbereitet und das biotinangereicherte Überstand von biotinproduzierenden E. coli gemäß dem Textprotokoll gesammelt wurde, 1,4 µL SPDP-Lösung zu 20 µL Streptavidin- oder SA-Lösung hinzufügen. Das Gefäß in Aluminiumfolie einwickeln und eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, damit der SPDP-Quervernetzer über eine Aminogruppe mit SA binde

using-synthetic-biology-to-engineer-living-cells-that-interface-with

Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Hier ist ein automatisierte Workflow auszuführenden modulare DNA "Gerät" Montage mit einem modularen DNA Montage Klonmethode auf Liquid-Handling-Roboter präsentiert. Das Protokoll verwendet eine intuitive Software-Werkzeug zur Erzeugung von liquid Handler Auswahllisten für kombinatorische DNA Bibliothek Gerätegeneration, die wir zeigen zwei liquid Handling-Plattformen verwenden.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Wir beschreiben ein einfaches lithographischen Verfahren für die Immobilisierung von gen-Länge DNA-Molekülen auf einer Fläche, die zur zellfreien gen Ausdruck Experimente auf Biochips durchführen können.

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Der Herstellungsprozess eines PDMS-basierten, mehrschichtigen, mikrofluidischen Geräts, das in vitro Transkription und Translation (IVTT) Reaktionen über längere Zeiträume durchführen kann, wird beschrieben. Darüber hinaus erhalten Sie einen umfassenden Überblick über die Hard- und Software, die zur Automatisierung und Aufrechterhaltung dieser Reaktionen über einen längeren Zeitraum erforderlich ist.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Gut charakterisierte genetische Teile sind für das Design neuartiger genetischer Schaltkreise notwendig. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Hochdurchsatzmethode zur schnellen Charakterisierung genetischer Teile. Unsere Methode reduziert Kosten und Zeit durch die Kombination von zellfreien Lysaten, linearer DNA zur Vermeidung von Klonen und akustischem Flüssigkeitshandling, um den Durchsatz zu erhöhen und das Reaktionsvolumen zu reduzieren.

Schnelle Charakterisierung genetischer Teile mit zellfreien Systemen

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Hier wird ein Protokoll für das Design, die Konstruktion und die Bereitstellung eines tetracyclingesteuerten induzierbaren synthetischen Schaltkreises vorgestellt. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise auf die Parasiteneliminierung und die Zytokinexpression kann durch Kanalisierung der vorgestellten Pipeline untersucht werden. Dieses Protokoll ist relevant für Forscher, die synthetische Schaltkreise bei Infektionskrankheiten untersuchen.

Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

Dieser Artikel beschreibt eine biofabrication Ansatz: Abscheidung von stimulierbaren Polysacchariden in Gegenwart des vorgespannt Elektroden, biokompatible Folien, die mit Zellen oder Proteine ​​funktionalisiert werden können, zu schaffen. Wir zeigen eine Tisch-Strategie für die Generation der Filme sowie ihre grundlegenden Verwendungen für die Erstellung interaktiver Oberflächen biofunktionalisierten für Lab-on-a-Chip-Anwendungen.

Bridging the Bio-elektronische Schnittstelle mit Biofabrication

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Erfahren Sie, wie synthetisch modifizierte E. coli programmierbare Materialoberflächen steuern. Diese Methode kombiniert Gentechnik und Oberflächenfunktionalisierung für dynamische Sensoren in Molekularmedizin.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

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