Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, synthetisch modifizierte E. coli einzusetzen, um programmierbare Materialoberflächen durch Kombination genetischer Modifikation und Oberflächenfunktionalisierung zu steuern und zu manipulieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in Bereichen wie der molekularen Medizin und der Umweltüberwachung zu beantworten. Indem genetisch programmierte Zellen eine lokale Umgebung interpretieren und ein funktionalisiertes Material entsprechend modifizieren, stellen wir ein modulares Werkzeug für eine Vielzahl von Anwendungen bereit.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass lebende Zellen als dynamische Sensoren fungieren können, die über funktionalisierte Grenzflächen in der Lage sind, die sie umgebenden Bedingungen zu erfassen, zu verarbeiten und aufzuzeichnen. Nachdem die Lösungen vorbereitet und das biotinangereicherte Überstand von biotinproduzierenden E. coli gemäß dem Textprotokoll gesammelt wurde, 1,4 µL SPDP-Lösung zu 20 µL Streptavidin- oder SA-Lösung hinzufügen. Das Gefäß in Aluminiumfolie einwickeln und eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, damit der SPDP-Quervernetzer über eine Aminogruppe mit SA binden kann und so ein pyridyldithio-aktiviertes SA entsteht. Nach der Inkubation 2,4 µL DTT-Lösung zum Gefäß hinzufügen und die Probe eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um einen Pyridin-2-thion-Abspaltungsprozess zu ermöglichen, der zu einem sulfhydryl-aktivierten SA führt. Danach 7,5 µL SCC-Lösung zu 72 µL HRP-Lösung hinzufügen, das Gemisch in Aluminiumfolie einwickeln und eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Dies führt zu einem Maleimid-aktivierten HRP, das über eine Aminogruppe gebunden ist. Mischen Sie 17 Mikroliter LC-LC-Biotin-Lösung mit 200 Mikrolitern BSA-Lösung, umwickeln Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für eineinhalb Stunden. Dieser Schritt ermöglicht es Biotin, über eine Amidbindung an BSA zu konjugieren.

Überführen Sie die SA-SPDP-Lösung, das HRP-SMCC und die mit BSA konjugierte Biotin-Lösung in getrennte Zentrifalkonzentratoren in Spin-Röhrchen. Zentrifugieren Sie SA-SPDP bei 10.000 × g, bis das Röhrchenvolumen 100 Mikroliter erreicht oder für 16 Minuten, füllen Sie dann das Spin-Röhrchen mit PBS-EDTA auf 500 Mikroliter auf und wiederholen Sie den Vorgang des Zentrifugierens und der Zugabe von PBS-EDTA noch fünfmal. Nachdem die Lösung erneut auf 100 Mikroliter zentrifugiert wurde, lagern Sie den Stamm bei vier Grad Celsius.

Bei der HRP SMCC-Zentrifugation die Röhrchen bei 10.000 × g zentrifugieren, bis das Volumen 25 Mikroliter erreicht hat, oder 16 Minuten lang. Den Spin-Röhrchen vor jedem erneuten Zentrifugieren jeweils PBS bis auf ein Volumen von 4500 Mikrolitern hinzufügen und diesen Vorgang insgesamt fünfmal wiederholen. Nachdem die Lösung auf 100 Mikroliter konzentriert wurde, die Stammlösung bei vier Grad Celsius lagern.

Für das BSA-Biotin wird die Probe bei 10.000 × g zentrifugiert, bis das Volumen 100 Mikroliter beträgt oder für 12 Minuten, anschließend wird das Spin-Röhrchen mit PBS auf 500 Mikroliter aufgefüllt. Nachdem die Zentrifugation und die Zugabe von PBS insgesamt fünfmal wiederholt wurden, wird das Röhrchen erneut zentrifugiert, bis das Volumen 100 Mikroliter beträgt oder für 12 Minuten, danach werden 100 Mikroliter PBS zugegeben und der Stammansatz bei vier Grad Celsius gelagert. Als Nächstes werden 25 Mikroliter der 10 Milligramm pro Milliliter HRP-Lösung mit 25 Mikroliter der 10 Milligramm pro Milliliter SA-Lösung vermischt und die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert. Danach werden zwei Aliquots des BSA-Biotins in PBS hergestellt, indem jeweils 10 Mikroliter des BSA-Biotin-Stammansatzes zu 490 Mikroliter PBS gegeben werden.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-Platte. Wickeln Sie die Platte in Folie ein und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter 0,5 % Tween 80 und BPS zu den Löchern hinzu.

Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Minuten, anschließend saugt man die Flüssigkeit ab und gießt sie ab. Nachdem der Waschschritt dreimal wiederholt wurde, fügen Sie 200 Mikroliter der 0,5%-Verkapselungslösung in jedes der Löchchen hinzu und inkubieren die Platte dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach einer weiteren Runde der zuvor beschriebenen Waschungen mischen Sie 12 Milliliter der 0,5%-Verkapselungslösung mit 7,5 Mikrolitern 0,5% Tween 80 und verdünnen mit dieser Lösung die SA-HRP-Stammlösung im Verhältnis 1 zu 10.000.

Pipettieren Sie 80 Mikroliter der verdünnten SA-HRP in jedes Loch einer 96-Loch-Platte und geben Sie anschließend 20 Mikroliter der vorbereiteten Biotinprobe in jedes Loch der Platte. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Dieser Schritt ermöglicht eine konkurrierende Bindung zwischen freiem Biotin und immobilisiertem BSA-Biotin um die SA-HRP-Bindungsstellen.

Danach, nachdem die Platte dreimal wie zuvor gewaschen wurde, bereiten Sie eine 20-Milliliter-Lösung aus 50 Millimolar Natriumacetat, 1 % TMB und 3 % Wasserstoffperoxid im Verhältnis 1.000 zu 10 zu 1 vor. Geben Sie 200 Mikroliter der Lösung in jedes Loch der Platte, umwickeln Sie diese mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie mit einer Pipette 50 Mikroliter zweimolare Schwefelsäure in jedes Loch, um die Reaktion zu stoppen, und messen Sie dann mit einem Plattenreader den OD 450.

Nach der Zubereitung der Lösungen gemäß dem Textprotokoll 7,5 µL LC-LC-Biotin zu 72 µL HRP hinzufügen. Die Lösung in Folie einwickeln und die Probe eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren. Bei diesem Schritt konjugiert Biotin über eine Amidbindung an HRP.

Überführen Sie die Lösung in einen Zentrifugal-Konzentrator innerhalb einer Spin-Säule und zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 × g, bis das Volumen 100 Mikroliter erreicht, oder für 12 Minuten. Füllen Sie die Spin-Säule anschließend mit PBS auf 500 Mikroliter auf und wiederholen Sie die Zentrifugation und die Zugabe des Puffers viermal. Geben Sie danach 100 Mikroliter von 0,17 Mikrogramm pro Milliliter SA in PBS in jedes Loch einer 96-Loch-Platte. Wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Um die Vertiefungen der Platte zu waschen, pipettieren Sie 200 Mikroliter 0,5 % Tween 80 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte zwei Minuten bei Raumtemperatur und gießen Sie die Flüssigkeit ab. Nachdem Sie den Waschschritt noch dreimal wiederholt haben, geben Sie 200 Mikroliter der 0,5 %-Hülllösung in die Vertiefungen.

Die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor die Vertiefungen dreimal wie zuvor gewaschen werden. Unter Verwendung der zuvor hergestellten gewaschenen und konzentrierten Biotin-HRP-Lösung die Biotin-HRP-Stammlösung 1:10.000 verdünnen und anschließend 80 Mikroliter der Lösung in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte geben. Danach 20 Mikroliter der vorbereiteten Biotinprobe in jede Vertiefung der Platte hinzufügen und die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, um eine konkurrierende Bindung zwischen freiem Biotin und Biotin-HRP an die immobilisierten SA-Bindungsstellen zu ermöglichen.

Nachdem die Vertiefungen dreimal wie zuvor gewaschen wurden, bereiten Sie eine 20-Milliliter-Lösung aus 50 Millimolar Natriumacetat, 1 % TMV und 3 % Wasserstoffperoxid im Verhältnis von 1.000 zu 10 zu eins vor. Geben Sie 200 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung der Platte, bedecken Sie sie mit Folie und inkubieren Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend geben Sie 50 Mikroliter zweimolarer Schwefelsäure in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen. Messen Sie abschließend den OD 450 mit einem Plattenreader.

Die modifizierten, induzierbaren E.coli MG1655-Wildtyp-Zellen wurden in minimalem Medium sowie in minimalem Medium ergänzt mit DTB und/oder IPTG kultiviert und überwacht. Diese Diagramme zeigen die alle fünf Minuten gemessenen OD 600-Werte über einen Zeitraum von 24 Stunden. In diesem Experiment wurde das fluoreszierende Protein mCherry anstelle des bioB-Gens verwendet, sodass das Induktionsprofil gemessen werden konnte, wenn die modifizierten Zellen mit IPTG induziert wurden.

Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des induzierbaren Gen-Netzwerks. Dargestellt sind hier die optischen Signale bei OD 450 als Reaktion auf unterschiedliche Biotinkonzentrationen für beide Schemata, die indirekt und direkt funktionalisierte Oberflächen verwenden. In diesem Experiment wurden Produkte induzierter, gentechnisch veränderter Zellen verwendet, um die funktionalisierte Oberfläche chemisch zu modifizieren.

Die verschiedenen Biotinkonzentrationen werden dargestellt, wie sie durch das indirekte Kontrollschema an funktionalisierter Oberfläche für Wildtyp-Zellen, nicht induzierte Zellen mit dem pKE1-lacI-bioB-Plasmid und induzierte Zellen mit dem pKE1-lacI-bioB-Plasmid gemessen wurden. Sobald die Methode beherrscht ist, können Zellen innerhalb von zwei Tagen genetisch verändert werden, während die direkten und indirekten Oberflächenfunktionalisierungstechniken jeweils innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden können, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Kontaminationen der Bakterienkultur zu vermeiden und die Oberflächen während der Funktionalisierung abzudecken, um eine Photobleiche zu verhindern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Oberflächen für direkte und indirekte Steuerungsschemata funktionalisiert werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bromidethidium äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen stets beachtet werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.