Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, synthetisch hergestellte E.coli zu verwenden, um programmierbare Materialoberflächen durch die Kombination von genetischer Modifikation und Oberflächenfunktionalisierungsstrategien zu kontrollieren und zu manipulieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in Bereichen wie der molekularen Medizin und der Umweltüberwachung zu beantworten. Indem wir genetisch programmierte Zellen verwenden, um eine lokale Umgebung zu interpretieren und ein funktionalisiertes Material entsprechend zu modifizieren, stellen wir ein modulares Werkzeug für eine Vielzahl von Anwendungen zur Verfügung.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass lebende Zellen in der Lage sind, als dynamische Sensoren zu fungieren, die in der Lage sind, die Bedingungen um sie herum über funktionalisierte Schnittstellen zu lesen, zu verarbeiten und aufzuzeichnen. Nach der Herstellung von Lösungen und dem Sammeln des mit Biotin angereicherten Überstands aus Biotin produzierenden E. coli gemäß dem Textprotokoll werden 1,4 Mikroliter SPDP-Lösung zu 20 Mikrolitern Streptavidin oder SA-Lösung gegeben. Wickeln Sie das Röhrchen in Aluminiumfolie ein und inkubieren Sie es eineinhalb Stunden lang bei Raumtemperatur, damit sich der SPDP-Vernetzer über eine Aminogruppe an SA binden und ein pyridyldithio-aktiviertes SA bilden kann. Nach der Inkubation geben Sie 2,4 Mikroliter DVB-T-Lösung in das Röhrchen und inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um eine Pyridin-2-Thion-Spaltung zu ermöglichen, die zu einem Sulfhydryl-aktivierten SA führt. Fügen Sie anschließend 7,5 Mikroliter SCC-Lösung zu 72 Mikrolitern HRP-Lösung hinzu, wickeln Sie sie in Aluminiumfolie ein und inkubieren Sie sie eineinhalb Stunden lang bei Raumtemperatur.

Dies führt zu einem Maleimid-aktivierten HRP, das an eine Aminogruppe gebunden ist. Mischen Sie 17 Mikroliter LC-LC-Biotinlösung mit 200 Mikrolitern BSA-Lösung, wickeln Sie das Röhrchen in Folie ein und inkubieren Sie die Probe eineinhalb Stunden lang bei Raumtemperatur. Dieser Schritt ermöglicht es Biotin, über eine Amidbindung an BSA zu konjugieren.

Übertragen Sie die SA-SPDP-Lösung, die HRP-SMCC und die BSA-konjugierte Biotinlösung auf separate Zentrifugalkonzentratoren in Spin-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das SA-SPDP bei 10.000 g bis das Röhrchenvolumen 100 Mikroliter erreicht, oder 16 Minuten lang, füllen Sie dann das Schleuderröhrchen mit PBS-EDTA auf 500 Mikroliter, bevor Sie das Schleudern und die Zugabe von PBS-EDTA weitere fünf Mal wiederholen. Nachdem Sie die Lösung auf 100 Mikroliter heruntergeschleudert haben, lagern Sie die Brühe bei vier Grad Celsius.

Für den HRP SMCC zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 g bis zum Volumen von 25 Mikrolitern oder 16 Minuten lang. Füllen Sie das Schleuderrohr mit PBS auf 4500 Mikroliter, bevor Sie das Schleudern und die Zugabe von PBS fünf weitere Male wiederholen. Nachdem Sie die Lösung auf 100 Mikroliter heruntergeschleudert haben, lagern Sie die Brühe bei vier Grad Celsius.

Für das BSA-Biotin zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 g bis das Volumen 100 Mikroliter oder 12 Minuten lang und füllen Sie dann das Schleuderröhrchen mit PBS auf 500 Mikroliter. Nachdem Sie das Schleudern und die Zugabe von PBS noch viermal wiederholt haben, zentrifugieren Sie das Röhrchen, bis das Volumen 100 Mikroliter erreicht, oder 12 Minuten lang, geben Sie dann 100 Mikroliter PBS in das Röhrchen und lagern Sie die Brühe bei vier Grad Celsius. Kombinieren Sie als nächstes 25 Mikroliter des 10 Milligramm pro Milliliter HRP mit 25 Mikrolitern 10 Milligramm pro Milliliter SA-Lösung und lagern Sie das Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius, dann bereiten Sie zwei Aliquots BSA-Biotin in PBS vor, indem Sie 10 Mikroliter BSA-Biotin-Brühe zu 490 Mikrolitern PBS hinzufügen.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Wickeln Sie die Platte in Folie ein und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter 05%Tween 80 und BPS in die Vertiefungen.

Inkubieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei Raumtemperatur, aspirieren und dekantieren Sie die Flüssigkeit. Nachdem Sie den Waschgang dreimal wiederholt haben, geben Sie 200 Mikroliter der 0,5%igen Gehäuselösung in jede der Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach einer weiteren Waschrunde wie zuvor 12 Milliliter 05%ige Darmlösung mit 7,5 Mikrolitern 05%Tween 80 mischen und dann mit dieser Lösung die SA-HRP-Stammlösung eins auf 10.000 verdünnen.

Pipettieren Sie 80 Mikroliter des verdünnten SA-HRP in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und geben Sie dann 20 Mikroliter der vorbereiteten Biotinprobe in jede Vertiefung der Platte. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Dieser Schritt ermöglicht eine kompetitive Bindung zwischen freiem Biotin und immobilisiertem BSA-Biotin für SA-HRP-Bindungsstellen.

Dann, nachdem Sie die Platte wie zuvor dreimal gewaschen haben, bereiten Sie eine 20-Milliliter-Lösung aus 50 Millimolar Natriumacetat, 1% TMB und 3% Wasserstoffperoxid in einem Verhältnis von 1.000 bis 10 zu eins vor. Geben Sie 200 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung der Platte, wickeln Sie sie in Folie ein und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie 50 Mikroliter zweimolare Schwefelsäure in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen, und verwenden Sie dann einen Plattenleser, um den OD 450 zu messen.

Nach der Herstellung der Lösungen gemäß dem Textprotokoll fügen Sie 7,5 Mikroliter LC-LC-Biotin zu 72 Mikrolitern HRP hinzu. Die Lösung wird in Folie eingewickelt und die Probe eineinhalb Stunden lang bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Dieser Schritt bewirkt, dass Biotin über eine Amidbindung an HRP konjugiert.

Übertragen Sie die Lösung in einen Zentrifugalkonzentrator in einem Spin-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 g bis das Volumen 100 Mikroliter oder 12 Minuten lang erreicht, dann verwenden Sie PBS, um das Spin-Rohr auf 500 Mikroliter zu füllen, und wiederholen Sie die Zentrifugation und die Pufferzugabe viermal. Geben Sie als Nächstes 100 Mikroliter 0,17 Mikrogramm pro Milliliter SA in PBS in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Wickeln Sie die Platte in Folie ein und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Um die Vertiefungen der Platte zu waschen, pipettieren Sie 200 Mikroliter 05 % Tween 80 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei Raumtemperatur und dekantieren Sie die Flüssigkeit. Nachdem Sie den Waschgang noch dreimal wiederholt haben, geben Sie 200 Mikroliter der 0,5%igen Gehäuselösung in die Vertiefungen.

Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Vertiefungen wie zuvor dreimal waschen. Unter Verwendung der zuvor hergestellten gewaschenen und konzentrierten Biotin HRP-Lösung verdünnen Sie die Biotin HRP-Stammlösung um eins auf 10.000 und geben Sie dann 80 Mikroliter der Lösung in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Geben Sie 20 Mikroliter der vorbereiteten Biotinprobe in jede Vertiefung der Platte und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um eine kompetitive Bindung zwischen freiem Biotin und Biotin HRP für die immobilisierten SA-Bindungsstellen zu ermöglichen.

Nachdem Sie die Vertiefungen wie zuvor dreimal gewaschen haben, bereiten Sie eine 20-Milliliter-Lösung aus 50 Millimolar Natriumacetat, 1 % TMV und 3 % Wasserstoffperoxid in einem Verhältnis von 1.000 zu 10 zu eins vor. Geben Sie 200 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung der Platte, decken Sie sie mit Folie ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, dann fügen Sie 50 Mikroliter von zwei molaren Schwefelsäuren in jede Vertiefung hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Verwenden Sie abschließend ein Plattenlesegerät, um den OD 450 zu messen.

Die künstlich hergestellten induzierbaren E.coli MG1655 Wildtyp-Zellen wurden sowohl in minimalem Medium als auch in minimalem Medium, das mit DTB und/oder IPTG ergänzt wurde, gezüchtet und überwacht. Dieses Diagramm zeigt den OD 600-Messwert, der 24 Stunden lang alle fünf Minuten gemessen wurde. In diesem Experiment wurde das fluoreszierende Protein mCherry anstelle des bioB-Gens verwendet, so dass das Induktionsprofil gemessen werden konnte, wenn gentechnisch veränderte Zellen mit IPTG induziert wurden.

Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des induzierbaren Gennetzwerks. Hier sind die optischen Signale an OD 450 als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von Biotin sowohl für die indirekten als auch für die direkten funktionalisierten Oberflächenschemata dargestellt. In diesem Experiment wurden Produkte von induziert hergestellten Zellen verwendet, um die funktionalisierte Oberfläche chemisch zu modifizieren.

Die verschiedenen Biotinkonzentrationen werden dargestellt, wie sie mit der funktionalisierten Oberfläche des indirekten Kontrollschemas für Wildtyp-Zellen, nicht induzierte Zellen, die das pKE1-lacI-bioB-Plasmid enthalten, und induzierte Zellen, die das pKE1-lacI-bioB-Plasmid enthalten, gemessen werden. Einmal gemeistert, können Zellen in zwei Tagen gentechnisch verändert werden, während die direkten und indirekten Oberflächenfunktionalisierungstechniken jeweils in fünf Stunden durchgeführt werden können, wenn sie richtig durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, eine Kontamination der bakteriellen Zellkultur zu vermeiden und die Oberflächen während der Funktionalisierung abzudecken, um Photobleichen zu vermeiden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Oberflächen sowohl für die direkte als auch für die indirekte Steuerung funktionalisiert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethidiumbromid äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen von Handschuhen.