Name: Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie, wie synthetisch modifizierte E. coli programmierbare Materialoberflächen steuern. Diese Methode kombiniert Gentechnik und Oberflächenfunktionalisierung für dynamische Sensoren in Molekularmedizin.

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Die Autoren danken Unterstützung von preis FA9550-13-1-0108 von der Air Force Office of Scientific Research der USA. Die Autoren erkennen zusätzlich Unterstützung von preis N00014-15-1-2502 vom Office of Naval Research der USA, aus dem Institut die Finanzierung für kritische Technik und angewandte Wissenschaft an der Virginia Polytechnic Institute und State University und der National Science Foundation Graduierten Fellowship-Programm, Verleihungsnummer 1607310.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben für die Anbindung entwickelt lebenden Zellen mit einem funktionalisierten Materialoberfläche eine neue Strategie vorgestellt. Dies wurde durch die Entwicklung einer Zelllinie erreicht der Lage, erhöhte Konzentrationen von Biotin zu synthetisieren, wenn sie mit IPTG induziert. Die erhöhten Mengen an Biotin kann dann verwendet werden, um die funktionalisierte Oberfläche zu modifizieren. Die Protokolle detailliert , wie die E. coli - Zelllinie zu entwickeln und , wie zwei verschiedene funktionalisierte O...

Hier berichten wir über die Verfahren für eine programmierbare Substrat zu entwickeln, das von einer konstruierten Zelllinie ein chemisches Signal reagiert. 1 Wir tun dies durch eine Biotin-Streptavidin - Schnittstelle zu schaffen, die von synthetisch engineered Escherichia coli (E. coli) Zellen erzeugt an Biotin reagiert. Zuvor programmierbare Oberflächen wurden für eine Vielzahl von Anwendungen von Toxinnachweis 2 und Point-of-Care - Diagnostik 3 Verteidigung und Sicherheit entwickelt. 4 Während programmierbare Oberflächen können nützlich als Sensoren und Aktoren sein, können sie gemacht &quot;intelligenter&quot; werden , indem sie mit der Fähigkeit zur Anpassung an verschiedene Umweltprobleme ausstatten. Im Gegensatz dazu sogar einfache Mikroorganismen, wie E. coli, weisen inhärente Anpassungsfähigkeit und sind in der Lage Challenges mit ausgeklügelter und oft unerwartete Lösungen reagieren. Diese Anpassungsfähigkeit ermöglicht hat E.coli - Populationen durch ihre komplexe Gen - Netzwerke gesteuert, kosteneffektiv Ressourcen suchen, 5 Mehrwert-Produkte erstellen, 6 und sogar Strommikromaßstab Robotik. 7 Durch die Kopplung der adaptive Vorteile von Zellen mit der Verwendung von programmierbaren Oberflächen leben, können wir ein Smart Substrat fähig der Reaktion auf unterschiedliche Umweltbedingungen zu schaffen. Synthetische Biologie hat sich die Forscher neue Fähigkeiten gegeben, das Verhalten von Lebewesen zu programmieren. Durch Zellen Engineering neue Gen regulatorische Netzwerke enthalten, können die Forscher Zellen entwickeln, die eine Reihe von programmierten Verhalten zeigen. 8, 9 Jenseits der Grundlagenforschung, diese Verhaltensweisen für Anwendungen wie Material Montage Steuern und biologisch produzierenden Mehrwert-Produkte werden können. 10 Hierin wir ausführlich , wie wir die Werkzeuge der synthetischen Biologie verwendet , um eningenieur ein E. coli - Stamm, der Biotin bei Induktion synthetisiert. Dieser Stamm wurde unter Verwendung von Restriktionsenzym-Klonierungsverfahren entwickelt ein Plasmid, pKE1-lacI-bioB zu montieren. Dieses Plasmid, wenn es in E. coli - Stamm K-12 MG1655 transformiert, ausstattet Zellen mit der Fähigkeit , erhöhte Mengen an bioB, ein essentielles Enzym für die Biotin - Synthese zu exprimieren. Wenn transformierte Zellen mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und mit einem Biotin-Vorläufer Desthiobiotin (DTB) induziert wurden, wurden erhöhte Spiegel an Biotin hergestellt. Biotin der Bindungs-Wechselwirkung mit Streptavidin ist einer der stärksten nicht-kovalenten Bindungen in der Natur gefunden. Als solches ist das Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung sowohl gut charakterisiertes und hoch in der Biotechnologie eingesetzt. 11 In diesem Manuskript, stellen wir zwei Strategien , um die Biotin-Streptavidin - Wechselwirkung unter Verwendung von zell hergestellt Biotin mit einer funktionalisierten Oberfläche zu erfassen und zu erkennen. Wirbeziehen sich auf diese kontrastierenden Oberflächen als &quot;indirekte&quot; und &quot;direkt&quot; Steuerungsschemata. Bei der indirekten Steuerschema, Zelle produzierte Biotin konkurriert mit Biotin, die für Streptavidin-Bindungsstellen auf einer Polystyroloberfläche konjugiert und immobilisiert wurde. Zusätzlich wird das Streptavidin mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert. HRP modifiziert 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-Tetramethylbenzidin (TMB), ein optisches Signal 12 zu erzeugen , die durch Quantifizierung der spektralen Extinktion (dh, optische Dichte) bei 450 nm (OD 450) überwacht werden kann. Somit erlaubt die indirekte Steuerschema Forscher durch die Überwachung der Abschwächung des OD 450 Signalzelle produzierten Biotin zu messen. Die direkte Steuerungsschema nutzt die Streptavidin-Biotin-Ereignis durch Streptavidin direkt auf eine Materialoberfläche zu immobilisieren und ermöglicht Zelle produzierten Biotin und biotinylierte HRP für Streptavidin-Bindungsstellen zu konkurrieren. Wiederum ist dasrelativen Mengen an zell erzeugt Biotin sind durch Messen einer OD 450 - Signal überwacht. Zusammengenommen sind die gentechnisch veränderten Zellen und funktionalisierten Oberflächen erlauben, die Eigenschaften eines programmierbaren Oberfläche zu steuern, indem Netzwerke in lebenden Zellen zu induzieren. Mit anderen Worten, haben wir ein System geschaffen, das gemeinsam durch die Verknüpfung dieser Systeme Vorteil der Anpassungsfähigkeit von lebenden Organismen und die Zuverlässigkeit und die Spezifikation einer engineered Materialgrenzfläche stattfindet.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Müller&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, Minimimale Salze, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Casaminosäuren&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat, wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid, Dihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glukose), wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Zelllinie</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotid Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N Synthese, DSL Aufreinigung</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Reaktionspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromid, 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskits</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaktionspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Glasbeschichtung Perlen&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl trans-4-(maleimidylmethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetaessigsäure (EDTA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidin (TMB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500 Zentrifugalkonzentratoren&nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat, wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Polystyrolplatten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

unter verwendung der synthetischen biologie lebenden zellen zu entwickeln, die schnittstelle mit programmierbarer materialien

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Wir haben einen abiotischen-biotischen Schnittstelle entwickelt, die gentechnisch veränderten Zellen erlaubt es, die Materialeigenschaften eines funktionalisierten Oberfläche zu steuern. Eine synthetisch konstruierte Stamm von E. coli Zellen und eine funktionalisierte Materialoberfläche: Dieses System wird durch die Schaffung von zwei Modulen. Innerhalb dieses Papier wir detailliert ein Protokoll für die gentechnische Veränderung von ausgewählten Verhalten in einem Stamm von E. coli unter Verwendung von molekularem Klonierungsstrategien. Einmal entwickelt, produziert dieser Stamm erhöhte Mengen an Biotin, wenn sie einer chemischen Induktors ausgesetzt. Zusätzlich wir detaillierter Protokolle zur Schaffung von zwei unterschiedlichen funktionalisierten Oberflächen, von denen jede Lage zu Zelle synthetisierte Biotin zu reagieren. Zusammengenommen stellen wir eine Methodik ein verknüpftes, abiotische-biotische System für die Erstellung, die Zellen zu steuern, Materialzusammensetzung und die Montage auf nicht lebenden Substraten entwickelt, ermöglicht.

Repräsentative Ergebnisse sind in den beigefügten fünf Figuren dargestellt. Zunächst stellen wir die Klonprozess grafisch (Abbildung 1) , so dass der Leser visuell die entscheidenden Schritte für die Erstellung der synthetisch konstruierte E. coli - Stamm folgen kann. Um die Populationsdynamik der Zellen zu kennzeichnen, stellen wir eine Wachstumskurve (Figur 2) erzeugt , indem die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) der Population zu...

Dieser Beitrag stellt eine Reihe von Protokollen für die gentechnisch veränderten Zellen entwickeln und funktionalisierte Oberflächen , die synthetisch konstruierte E. coli steuern können , und programmierbare Materialoberflächen zu manipulieren.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, synthetisch modifizierte E. coli einzusetzen, um programmierbare Materialoberflächen durch Kombination genetischer Modifikation und Oberflächenfunktionalisierung zu steuern und zu manipulieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in Bereichen wie der molekularen Medizin und der Umweltüberwachung zu beantworten. Indem genetisch programmierte Zellen eine lokale Umgebung interpretieren und ein funktionalisiertes Material entsprechend modifizieren, stellen wir ein modulares Werkzeug für eine Vielzahl von Anwendungen bereit.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass lebende Zellen als dynamische Sensoren fungieren können, die über funktionalisierte Grenzflächen in der Lage sind, die sie umgebenden Bedingungen zu erfassen, zu verarbeiten und aufzuzeichnen. Nachdem die Lösungen vorbereitet und das biotinangereicherte Überstand von biotinproduzierenden E. coli gemäß dem Textprotokoll gesammelt wurde, 1,4 µL SPDP-Lösung zu 20 µL Streptavidin- oder SA-Lösung hinzufügen. Das Gefäß in Aluminiumfolie einwickeln und eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, damit der SPDP-Quervernetzer über eine Aminogruppe mit SA binden kann und so ein pyridyldithio-aktiviertes SA entsteht. Nach der Inkubation 2,4 µL DTT-Lösung zum Gefäß hinzufügen und die Probe eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um einen Pyridin-2-thion-Abspaltungsprozess zu ermöglichen, der zu einem sulfhydryl-aktivierten SA führt. Danach 7,5 µL SCC-Lösung zu 72 µL HRP-Lösung hinzufügen, das Gemisch in Aluminiumfolie einwickeln und eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Dies führt zu einem Maleimid-aktivierten HRP, das über eine Aminogruppe gebunden ist. Mischen Sie 17 Mikroliter LC-LC-Biotin-Lösung mit 200 Mikrolitern BSA-Lösung, umwickeln Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für eineinhalb Stunden. Dieser Schritt ermöglicht es Biotin, über eine Amidbindung an BSA zu konjugieren.Überführen Sie die SA-SPDP-Lösung, das HRP-SMCC und die mit BSA konjugierte Biotin-Lösung in getrennte Zentrifalkonzentratoren in Spin-Röhrchen. Zentrifugieren Sie SA-SPDP bei 10.000 × g, bis das Röhrchenvolumen 100 Mikroliter erreicht oder für 16 Minuten, füllen Sie dann das Spin-Röhrchen mit PBS-EDTA auf 500 Mikroliter auf und wiederholen Sie den Vorgang des Zentrifugierens und der Zugabe von PBS-EDTA noch fünfmal. Nachdem die Lösung erneut auf 100 Mikroliter zentrifugiert wurde, lagern Sie den Stamm bei vier Grad Celsius.Bei der HRP SMCC-Zentrifugation die Röhrchen bei 10.000 × g zentrifugieren, bis das Volumen 25 Mikroliter erreicht hat, oder 16 Minuten lang. Den Spin-Röhrchen vor jedem erneuten Zentrifugieren jeweils PBS bis auf ein Volumen von 4500 Mikrolitern hinzufügen und diesen Vorgang insgesamt fünfmal wiederholen. Nachdem die Lösung auf 100 Mikroliter konzentriert wurde, die Stammlösung bei vier Grad Celsius lagern.Für das BSA-Biotin wird die Probe bei 10.000 × g zentrifugiert, bis das Volumen 100 Mikroliter beträgt oder für 12 Minuten, anschließend wird das Spin-Röhrchen mit PBS auf 500 Mikroliter aufgefüllt. Nachdem die Zentrifugation und die Zugabe von PBS insgesamt fünfmal wiederholt wurden, wird das Röhrchen erneut zentrifugiert, bis das Volumen 100 Mikroliter beträgt oder für 12 Minuten, danach werden 100 Mikroliter PBS zugegeben und der Stammansatz bei vier Grad Celsius gelagert. Als Nächstes werden 25 Mikroliter der 10 Milligramm pro Milliliter HRP-Lösung mit 25 Mikroliter der 10 Milligramm pro Milliliter SA-Lösung vermischt und die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert. Danach werden zwei Aliquots des BSA-Biotins in PBS hergestellt, indem jeweils 10 Mikroliter des BSA-Biotin-Stammansatzes zu 490 Mikroliter PBS gegeben werden.Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-Platte. Wickeln Sie die Platte in Folie ein und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter 0,5 % Tween 80 und BPS zu den Löchern hinzu.Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Minuten, anschließend saugt man die Flüssigkeit ab und gießt sie ab. Nachdem der Waschschritt dreimal wiederholt wurde, fügen Sie 200 Mikroliter der 0,5%-Verkapselungslösung in jedes der Löchchen hinzu und inkubieren die Platte dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach einer weiteren Runde der zuvor beschriebenen Waschungen mischen Sie 12 Milliliter der 0,5%-Verkapselungslösung mit 7,5 Mikrolitern 0,5% Tween 80 und verdünnen mit dieser Lösung die SA-HRP-Stammlösung im Verhältnis 1 zu 10.000.Pipettieren Sie 80 Mikroliter der verdünnten SA-HRP in jedes Loch einer 96-Loch-Platte und geben Sie anschließend 20 Mikroliter der vorbereiteten Biotinprobe in jedes Loch der Platte. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Dieser Schritt ermöglicht eine konkurrierende Bindung zwischen freiem Biotin und immobilisiertem BSA-Biotin um die SA-HRP-Bindungsstellen.Danach, nachdem die Platte dreimal wie zuvor gewaschen wurde, bereiten Sie eine 20-Milliliter-Lösung aus 50 Millimolar Natriumacetat, 1 % TMB und 3 % Wasserstoffperoxid im Verhältnis 1.000 zu 10 zu 1 vor. Geben Sie 200 Mikroliter der Lösung in jedes Loch der Platte, umwickeln Sie diese mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie mit einer Pipette 50 Mikroliter zweimolare Schwefelsäure in jedes Loch, um die Reaktion zu stoppen, und messen Sie dann mit einem Plattenreader den OD 450.Nach der Zubereitung der Lösungen gemäß dem Textprotokoll 7,5 µL LC-LC-Biotin zu 72 µL HRP hinzufügen. Die Lösung in Folie einwickeln und die Probe eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren. Bei diesem Schritt konjugiert Biotin über eine Amidbindung an HRP.Überführen Sie die Lösung in einen Zentrifugal-Konzentrator innerhalb einer Spin-Säule und zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 × g, bis das Volumen 100 Mikroliter erreicht, oder für 12 Minuten. Füllen Sie die Spin-Säule anschließend mit PBS auf 500 Mikroliter auf und wiederholen Sie die Zentrifugation und die Zugabe des Puffers viermal. Geben Sie danach 100 Mikroliter von 0,17 Mikrogramm pro Milliliter SA in PBS in jedes Loch einer 96-Loch-Platte. Wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Um die Vertiefungen der Platte zu waschen, pipettieren Sie 200 Mikroliter 0,5 % Tween 80 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte zwei Minuten bei Raumtemperatur und gießen Sie die Flüssigkeit ab. Nachdem Sie den Waschschritt noch dreimal wiederholt haben, geben Sie 200 Mikroliter der 0,5 %-Hülllösung in die Vertiefungen.Die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor die Vertiefungen dreimal wie zuvor gewaschen werden. Unter Verwendung der zuvor hergestellten gewaschenen und konzentrierten Biotin-HRP-Lösung die Biotin-HRP-Stammlösung 1:10.000 verdünnen und anschließend 80 Mikroliter der Lösung in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte geben. Danach 20 Mikroliter der vorbereiteten Biotinprobe in jede Vertiefung der Platte hinzufügen und die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, um eine konkurrierende Bindung zwischen freiem Biotin und Biotin-HRP an die immobilisierten SA-Bindungsstellen zu ermöglichen.Nachdem die Vertiefungen dreimal wie zuvor gewaschen wurden, bereiten Sie eine 20-Milliliter-Lösung aus 50 Millimolar Natriumacetat, 1 % TMV und 3 % Wasserstoffperoxid im Verhältnis von 1.000 zu 10 zu eins vor. Geben Sie 200 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung der Platte, bedecken Sie sie mit Folie und inkubieren Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend geben Sie 50 Mikroliter zweimolarer Schwefelsäure in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen. Messen Sie abschließend den OD 450 mit einem Plattenreader.Die modifizierten, induzierbaren E.coli MG1655-Wildtyp-Zellen wurden in minimalem Medium sowie in minimalem Medium ergänzt mit DTB und/oder IPTG kultiviert und überwacht. Diese Diagramme zeigen die alle fünf Minuten gemessenen OD 600-Werte über einen Zeitraum von 24 Stunden. In diesem Experiment wurde das fluoreszierende Protein mCherry anstelle des bioB-Gens verwendet, sodass das Induktionsprofil gemessen werden konnte, wenn die modifizierten Zellen mit IPTG induziert wurden.Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit des induzierbaren Gen-Netzwerks. Dargestellt sind hier die optischen Signale bei OD 450 als Reaktion auf unterschiedliche Biotinkonzentrationen für beide Schemata, die indirekt und direkt funktionalisierte Oberflächen verwenden. In diesem Experiment wurden Produkte induzierter, gentechnisch veränderter Zellen verwendet, um die funktionalisierte Oberfläche chemisch zu modifizieren.Die verschiedenen Biotinkonzentrationen werden dargestellt, wie sie durch das indirekte Kontrollschema an funktionalisierter Oberfläche für Wildtyp-Zellen, nicht induzierte Zellen mit dem pKE1-lacI-bioB-Plasmid und induzierte Zellen mit dem pKE1-lacI-bioB-Plasmid gemessen wurden. Sobald die Methode beherrscht ist, können Zellen innerhalb von zwei Tagen genetisch verändert werden, während die direkten und indirekten Oberflächenfunktionalisierungstechniken jeweils innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden können, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Kontaminationen der Bakterienkultur zu vermeiden und die Oberflächen während der Funktionalisierung abzudecken, um eine Photobleiche zu verhindern.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Oberflächen für direkte und indirekte Steuerungsschemata funktionalisiert werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bromidethidium äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen stets beachtet werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Hier ist ein automatisierte Workflow auszuführenden modulare DNA "Gerät" Montage mit einem modularen DNA Montage Klonmethode auf Liquid-Handling-Roboter präsentiert. Das Protokoll verwendet eine intuitive Software-Werkzeug zur Erzeugung von liquid Handler Auswahllisten für kombinatorische DNA Bibliothek Gerätegeneration, die wir zeigen zwei liquid Handling-Plattformen verwenden.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Wir beschreiben ein einfaches lithographischen Verfahren für die Immobilisierung von gen-Länge DNA-Molekülen auf einer Fläche, die zur zellfreien gen Ausdruck Experimente auf Biochips durchführen können.

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Der Herstellungsprozess eines PDMS-basierten, mehrschichtigen, mikrofluidischen Geräts, das in vitro Transkription und Translation (IVTT) Reaktionen über längere Zeiträume durchführen kann, wird beschrieben. Darüber hinaus erhalten Sie einen umfassenden Überblick über die Hard- und Software, die zur Automatisierung und Aufrechterhaltung dieser Reaktionen über einen längeren Zeitraum erforderlich ist.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Gut charakterisierte genetische Teile sind für das Design neuartiger genetischer Schaltkreise notwendig. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Hochdurchsatzmethode zur schnellen Charakterisierung genetischer Teile. Unsere Methode reduziert Kosten und Zeit durch die Kombination von zellfreien Lysaten, linearer DNA zur Vermeidung von Klonen und akustischem Flüssigkeitshandling, um den Durchsatz zu erhöhen und das Reaktionsvolumen zu reduzieren.

Schnelle Charakterisierung genetischer Teile mit zellfreien Systemen

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Hier wird ein Protokoll für das Design, die Konstruktion und die Bereitstellung eines tetracyclingesteuerten induzierbaren synthetischen Schaltkreises vorgestellt. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise auf die Parasiteneliminierung und die Zytokinexpression kann durch Kanalisierung der vorgestellten Pipeline untersucht werden. Dieses Protokoll ist relevant für Forscher, die synthetische Schaltkreise bei Infektionskrankheiten untersuchen.

Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

Dieser Artikel beschreibt eine biofabrication Ansatz: Abscheidung von stimulierbaren Polysacchariden in Gegenwart des vorgespannt Elektroden, biokompatible Folien, die mit Zellen oder Proteine ​​funktionalisiert werden können, zu schaffen. Wir zeigen eine Tisch-Strategie für die Generation der Filme sowie ihre grundlegenden Verwendungen für die Erstellung interaktiver Oberflächen biofunktionalisierten für Lab-on-a-Chip-Anwendungen.

Bridging the Bio-elektronische Schnittstelle mit Biofabrication

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Erfahren Sie, wie synthetisch modifizierte E. coli programmierbare Materialoberflächen steuern. Diese Methode kombiniert Gentechnik und Oberflächenfunktionalisierung für dynamische Sensoren in Molekularmedizin.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

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