Die Induktion einer entzündlichen Reaktion in der Primär Hepatozyten-Kulturen von Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, funktionstüchtige murine Hepatozyten erfolgreich zu isolieren, um die Expression und Sekretion entzündlicher Zytokine wie CRP und IL6 als Reaktion auf Mediatoren der hepatischen Akutphase-Reaktion zu untersuchen. Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen zur hepatocellulären Funktion und zum Beitrag hepatischer Zytokine zu einer anhaltenden entzündlichen Umgebung, wie sie bei chronischer Nierenerkrankung vorkommt, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein robustes Werkzeug für eine einfache, schnelle und reproduzierbare Analyse der hepatischen Metabolomik und Entzündung sowie der Reaktion auf Arzneimittel bereitstellt.

Als Erstes das Leberperfusionsmedium und das Leberdigestionsmedium in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Richten Sie eine Perfusionspumpe wie hier gezeigt ein. Füllen Sie dann vorsichtig das Schlauchsystem der Pumpe mit Leberperfusionsmedium vor.

Versuchen Sie, Luftblasen im System zu vermeiden. Bereiten Sie das stereotaktische Mikroskop für den Perfusionsvorgang vor. Nachdem Sie eine Spendertau gemäß dem Textprotokoll anästhesiert haben, legen Sie das anästhesierte Tier auf ein saugfähiges Polster.

Verwenden Sie Klebeband, um die Extremitäten der Maus zu fixieren. Rasieren und desinfizieren Sie anschließend den Bauchbereich der Maus. Führen Sie dann mittels chirurgischer Schere mit scharfen stumpfen Spitzen eine ventrale Laparotomie von der Schambeinfuge bis zur kranialen Lebergrenze durch.

Schneiden Sie die Bauchdecke beidseits an einer Position kaudal zum Zwerchfell ein. Legen Sie die untere Hohlvene (IVC) frei, indem Sie den Darm mit sterilen Wattestäbchen vorsichtig nach rechts verschieben. Machen Sie mit feinen chirurgischen Scheren und scharfen Spitzen seitliche Einschnitte über das suprahäpatische Zwerchfell und öffnen Sie die Brusthöhle.

Verwenden Sie dann chirurgische Seide 5-0, um die Vena cava inferior im Thorax zu ligieren. Mit einem geschützten intravenösen Katheter die infrarenale Vena cava inferior katheterisieren. Die Perfusionspumpe anschließen und die Leber perfundieren.

Wenn der Eingriff korrekt durchgeführt wird, sollte die Leber sofort aufhellen und anschwellen. Anschließend durchtrennen Sie mit feinen chirurgischen Scheren die Pfortader, um eine geeignete Entleerung von Blut und Perfusionsmedium zu ermöglichen. Nach der Perfusion der Leber mit etwa 30 Milliliter Leberperfusionsmedium stoppen Sie die Perfusionspumpe.

Wechseln Sie zum Leber-Digest-Medium und setzen Sie die Pumpe erneut in Betrieb. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kanüle. Exponieren Sie vorsichtig den zentralen Bereich der Leber und lokalisieren Sie das verbindende Gewebe, das die Leberlappen miteinander verbindet.

Greifen Sie die zentralen Verbindungsfasern und dissezieren Sie vorsichtig alle Gewebe, die die Leber an ihrer Position halten. Entfernen Sie anschließend die Leber vorsichtig. Überführen Sie das Organ unverzüglich in ein 50-Milliliter-Polypropylen-Konischgefäß, das 15 Milliliter Leber-Digestionsmedium enthält.

Übertrag die Leber unter einer Zellkulturhaube aus dem 50-Milliliter-Polypropylen-Konischkolben in eine sterile Zellkulturschale. Zerreiß mit sterilen Pinzetten vorsichtig die vier Leberlappen. Bei korrekter Durchführung sollte das Verdauungsmedium trüb werden, da Hepatozyten aus der Leber isoliert werden.

Filtern Sie das trübe Verdauungsmedium unter Verwendung einer sterilen 25-Milliliter-Pipettenspitze durch einen 70-Mikrometer-Nylon-Zellfilter in ein neues 50-Milliliter-Polypropylen-Konischgefäß, um unverdaute Gewebepartikel und zellulären Abfall zu entfernen. Zentrifugieren Sie das vereinigte Filtrat bei 50 × g und vier Grad Celsius für zwei Minuten, anschließend wird der Überstand, der überschüssigen zellulären Abfall enthält, abgesaugt. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 25 Milliliter kaltem 1X William’s Medium E. Wiederholen Sie das Filtrieren und Waschen der Hepatozyten dreimal, anschließend wird der Überstand abgesaugt, um überschüssigen zellulären Abfall zu entfernen.

Suspendieren Sie die Zellen in 25 Milliliter warmem 1X William's Medium E, das Zusätze für das Auftauen und Aussäen von primären Hepatozyten enthält, und filtrieren Sie die Suspension durch einen neuen 70-Mikrometer-Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konischglas. Nach der Zellzählung säen Sie sie in zwei Milliliter William's Medium E, das Zusätze für das Auftauen und Aussäen von primären Hepatozyten enthält, auf ein kollagenbeschichtetes Sechs-Well-Zellkultur-Cluster aus. Nach zwei Mediumwechseln, um die Zellen schließlich zu entziehen, behandeln Sie die Zellen mit PBS als Fahrzeug, 25 Nanogramm pro Milliliter FGF23, 100 Mikrogramm pro Milliliter LPS oder 50 Nanogramm pro Milliliter IL6 in serumfreiem Medium.

Die Kulturen 24 Stunden inkubieren. Nach der Aufreinigung der RNA mithilfe eines Spin-Säulen-Kits gemäß den Herstelleranweisungen 200 Nanogramm der isolierten RNA in ein PCR-Gefäß geben. Dann 14 Mikroliter nukleasefreies Wasser und vier Mikroliter Reverse Transkriptase zum Gefäß hinzufügen.

Platzieren Sie das PCR-Röhrchen in den Thermocycler und führen Sie das folgende Programm zur reversen Transkription durch, um cDNA zu erzeugen. Um eine quantitative PCR durchzuführen, mischen Sie die folgenden Bestandteile der QPCR-Master-Mix-Lösung in einem Röhrchen auf Eis. Vortexen Sie die Master-Mix-Lösung.

Anschließend aliquotieren Sie neun Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte. Geben Sie vorsichtig ein Mikroliter cDNA in jede Vertiefung, wobei für jede Probe drei Vertiefungen vorbereitet werden. Abschließend führen Sie die Proben in einem Echtzeit-PCR-Gerät durch und analysieren die Daten gemäß dem schriftlichen Protokoll.

Hier ist ein repräsentatives Lichtmikroskopiebild primär isolierter und kultivierter Zellen dargestellt. Die immunzytochemische Analyse zeigt, dass die isolierten Hepatozyten Albumin sowie den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 4 stark exprimieren. In diesem Experiment wurden primär isolierte Hepatozyten 24 Stunden lang mit FGF23, LPS oder IL6 behandelt, und die mRNA-Spiegel von CRP und IL6 wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR analysiert.

LPS, IL6 und FGF23 erhöhten die Expression von CRP und IL6 signifikant. Wie hier gezeigt, wurden Kulturüberstände isolierter primärer Hepatozyten mittels ELISA auf CRP-Konzentrationen analysiert. Wie mittels QPCR-Analyse gezeigt wurde, erhöhten Behandlungen mit LPS, IL6 und FGF23 die CRP-Konzentrationen in den Zellüberständen signifikant im Vergleich zu mit PBS behandelten Zellen.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets ein steriles Umfeld beizubehalten. Da mit Primärkulturen gearbeitet wird, ist die Minimierung des Kontaminationsrisikos am wichtigsten, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie murine Hepatozyten erfolgreich isoliert werden können, um verschiedene hepatocelluläre Funktionen wie die Expression und Sekretion hepatischer Zytokine zu untersuchen.