Name: Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie Biolumineszenz- und Nah-Infrarot-Imaging Optikusneuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose bei lebenden Mäusen visualisieren und quantifizieren.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) und der Forschungsförderungsprogramm &quot;Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) des Landes Hessen, Forschungszentrum für Translationale Medizin und Pharmakologie TMP und der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (EKFS), Graduiertenkolleg Translationale Forschung Innovation - Pharma (TRIP).

1. EAE Induktion in SJL / J-Mäuse <ol><li> Mäuse <ol><li> Verwenden Sie 11-Wochen alte weibliche SJL / J-Mäuse und es ihnen ermöglichen, für ca. 7 Tage zur experimentellen Raum zu gewöhnen. Verwenden Sie n = 10 Mäuse pro Gruppe. </li><li> Für die Beurteilung der Arzneimittelwirkungen, die Verwaltung der Drogen-und Placebo für die Kontrollgruppe kontinuierlich über das Trinkwasser oder über Futterpellets beginnend 3 oder 5 Tage nach der Immunisierung (n = 10 pro Gruppe). Während der Höhepunkt der Krankheit, Medikamente verabreichen oder Placebo mit Milch oder 3% Zucker mit Wasser getränkten Maisflocken. </li></ol></li><li> Immunization Material <ol><li> Verwenden ein EAE Induktions Kit, bestehend aus Antigen (Peptid von Proteolipidprotein, PLP 139-151, 1 mg / ml Emulsion) in einer Emulsion mit komplettem Freundschem Adjuvans (CFA, Hitze abgetötete Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) und 2 Ampullen (jeweils 5 ug) lyophilisierter Pertussistoxin (PTX). </li><li> Man löst den PTX (2 ug / ml) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; dh &lt;/ Em&gt; 1,5 ml PBS in jedes PTX Rohr, fügen Sie gut mischen, entfernen Sie mit der gleichen Pipettenspitze, und zu 1 ml PBS in einem 50-ml-Röhrchen hinzufügen); gut mischen. </li></ol></li><li> Immunisierung <ol><li> Injizieren PLP / CFA subkutan in 2 Portionen, die jeweils 100 &amp; mgr; l, die beide an der Basis des Schwanzes. Nicht in die Rückseite des Halses zu injizieren, da alle Immunreaktionen in der Haut im oberen Rücken oder Nacken-Bildgebung des Kopfes und des Rückenmarks stören. </li><li> Injizieren von 100 &amp; mgr; l PTX intraperitoneal (ip) zweimal pro Maus, wobei der erste 1 bis 2 h nach der Immunisierung und die zweite bei 24 h. </li><li> Für die Kontrollmäuse, injizieren CFA ohne PLP (2 Portionen von 100 &amp; mgr; l) und PTX ohne PLP. </li></ol></li><li> Maus - Handling nach der Immunisierung <ol><li> Wiegen Sie die Mäuse jeden zweiten Tag bis zum Tag 7, und sie dann täglich wiegen. HINWEIS: Die Mäuse verlieren etwa 1 bis 2 g Körpergewicht während der EAE. Der Rückgang markiert den Beginn der EAE. </li><li> Beurteilen der klinischen Symptome täglich von Tag 7 according zu den Standard - Scoring - Systeme (dh Ergebnis 0: keine offensichtlichen Veränderungen in der Motorik; Score 0,5: distale Lähmung des Schwanzes; erzielt 1: komplette Schwanz Lähmung; Note 1.5: leichte Parese eines oder beider Hinterbeine; Stand 2: schwere Parese der Hinterbeine; Note 2.5: vollständige Lähmung eines Hinterbein; Stand 3: vollständige Lähmung beider Hinterbeine; 3.5 punkten. völlige Lähmung der Hinterbeine und Lähmung eines Vorderbein Euthanize Mäuse mit Noten von 3,5 oder höher für &gt; 12 h. </li></ol></li><li> EAE Kurs und Zeit der Bildgebung <ol><li> Führen Sie die erste Abbildungs ​​beim Einsetzen der Krankheit, wenn die Mäuse Scores erreichen&gt; 1, die etwa 10 Tage auftreten - 12 nach der Immunisierung. </li><li> Führen Sie die zweite Bildgebung an der Spitze, die 1 oder 2 Tagen erreicht wird, nachdem die ersten Symptome entwickeln und wird für 1 dauern - 3 Tage. HINWEIS: Anschließend wird die Mäuse vollständig innerhalb von 7 bis 10 Tagen genesen. Imaging während der Intervalle können noch vaskuläre Undichtigkeiten aufweisen,aber Entzündung Indikatoren negativ sein sollte. </li></ol></li></ol> 2. Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung <ol><li> Setup des Abbildungssystems <ol><li> Führen in vivo - Bildgebung mit der Ausrüstung, die für die Analyse der Biolumineszenz und nahen infraroten Signalen ermöglicht. </li><li> Halten Mäuse unter 2-2,5% Isofluran-Narkose bei allen bildgebenden Verfahren. </li><li> Position eins oder zwei Mäuse nebeneinander in der Vorrichtung die mittleren Gasversorgung verwendet wird. Positionieren Sie den oberen Wirbelsäule in der Mitte. </li><li> Verwenden Sie zwei Mäuse gleichzeitig, eine pro Gruppe, für die Bewertung von Medikamenten Effekte Paare zu vergleichen. Dies ist wichtig für Biolumineszenz-Bildgebung. </li><li> Abschirmen Stelle der Immunisierung mit schwarzem Tuch und nehmen ein Foto und Ausgangsbild die richtige Positionierung der Maus / Mäuse zu bewerten. Verwenden, um die B-Fokus mit einem 6,5-cm Abstand zur Kamera für alle Bilder. </li></ol></li><li> Injektion und Bildgebung von Biolumineszenz Entzündung Sonde <ol><li> Verwenden Sie die in - vivo - Bildgebung Systemeinstellungen: Epi-BLI, Em Filter geöffnet, Ex - Filterblock, fstop 1, Binning 8, konzentrieren sich B = 6,5 cm, Anzeigenpräsenz 120 s; nehmen ein Grundbild. </li><li> Inject 100 ul ip der ready-to-use Chemilumineszenzmittellösung (40 mg / ml). Gut mischen, bevor die Spritze zu füllen. </li><li> Erfassen Biolumineszenz Bilder 5, 10 und 15 min nach der Injektion. Der Zeitverlauf der biolumineszenten peak unterscheidet zwischen Tieren. HINWEIS: Die Spitze 5 auftreten - 10 Minuten nach der Injektion; ein Rückgang bei 15 min zeigt an, dass keine weiteren Bilder erforderlich sind. Mit der Maus Paare von Kontroll- und Behandlungsgruppen geringfügige Verzerrungen zu beseitigen, wegen der unterschiedlichen Zeitkurse. </li><li> Füllen Sie Beschreibungen relevant für das Experiment. Beachten Sie ein Dialogfenster öffnet sich automatisch; es enthält Informationen, wie zum Beispiel Maus - Stamm, Geschlecht, Zeitpunkt, Zeitpunkt der Sonde Injektion, Gruppe usw. Speichern Sie die Dateien alle in one-Ordner; sie werden Zeit-Tags und alle Beschreibungen haben. </li></ol></li><li> Injektion und Bildgebung von Nah-Infrarot - Fluoreszenz - Nanopartikel für BBB - Integrität <ol><li> Verwenden Sie im nahen Infrarot Epifluoreszenz- Bildgebung in der B-Fokus (Entfernung: 6,5 cm). Die Anregung / Emissionsmaxima der pegylierten fluoreszierende Nanopartikel sind 675/690 nm. Nehmen Sie zwei Bilder mit unterschiedlichen Wellenlängen, bei Ex640 / Em700 und Ex675 / Em720; verwenden, um eine 2-s Belichtung, Binning 8 und fstop 2. ein Grundbild nehmen. </li><li> Injizieren 70 &amp; mgr; l von pegyliertem fluoreszierenden Infrarot-Nanopartikel iv durch die Schwanzvene und stellen Sie sich die Mäuse 3 h und 24 h nach der Injektion die obigen Einstellungen. Mischen Sie die Lösung gut, bevor die Spritze zu füllen. </li><li> Injizieren 0,9% Natriumchlorid in Kontrollmäusen, die benötigt wird, um die Spezifität des Signals zu bewerten. </li></ol></li><li> Injektion und Abbildung des nahen Infrarot fluoreszierende Sonde für MMP - Aktivität <ol><li> Shave oder enthaaren den Kopf und upper Rückenbereich vorsichtig einen Tag vor dem Ausgangsbild nehmen. Die Haut darf nicht verletzt werden. </li><li> Verwenden Sie im nahen Infrarot Epifluoreszenz- Bildgebung in der B-Fokus (Entfernung: 6,5 cm). Die Anregung / Emissionsmaxima der MMP aktivierbare Sonde sind 680/700 nm. Nehmen Sie zwei Bilder mit unterschiedlichen Wellenlängen, bei Ex640 / Em700 und Ex675 / Em720; verwenden, um eine 1-s Belichtung, Binning 8 und fstop 2. ein Grundbild nehmen. </li><li> Mit 200 &amp; mgr; l 1x PBS auf das 1,5-ml-Röhrchen der ready-to-use-Lösung (20 nmol / 1,5 ml in 1x PBS), so dass es für 10 Mäuse ausreichend sein wird; gut mischen, bevor die Spritze zu füllen. HINWEIS: Die bereitgestellten Volumen nimmt nicht berücksichtigt, dass einige Volumen während Spritzenfüllanlage und Injektion verloren. </li><li> Inject 150 ul der Sonde iv durch die Schwanzvene 24 h vor der Bildgebung. Injizieren PBS nur in Kontrolltieren die Spezifität des Signals zu bewerten. </li><li> Bei 24 Stunden nach der Injektion, nehmen Epi-FL Bilder zumindest bei zwei Wellenlängen, Ex640 / Em700 und Ex 675 / EM720, mit den Einstellungen oben erläutert (1-s Belichtung, Fokus B, Binning 8 und fstop 2). HINWEIS: Die Verwendung von zwei Wellenlängen ermöglicht Entmischung durch die unspezifische Signal subtrahiert wird. </li></ol></li></ol> 3. Bildanalysen <ol><li> Biolumineszenz - Analyse (BLI) <ol><li> Doppelklicken Sie auf die Software, um es zu öffnen. </li><li> In der oberen Menüleiste, klicken Sie auf den Datei - Browser - Symbol, gehen Sie in das Verzeichnis des Ordners des Experiments, und wählen Sie sie aus ; Dadurch werden alle Dateien im Ordner in einer Tabelle öffnen. </li><li> Konfigurieren Sie die Spalten die Beschreibungen relevant für das Experiment zeigt. </li><li> Für die Qualitätskontrolle, doppelklicken Sie auf eine Datei von einem Non-Responder-Maus ohne Symptome von EAE und / oder einem naiven Maus, um die Spezifität der EAE-Signale zu überprüfen. HINWEIS: Es sollte in Non-Responder-Mäuse kein Signal in naiven Mäusen und minimale Signal sein. <ol><li> Überprüfen Sie die Basislinienbild vor dem Einspritzen des Prowerden für jede Maus als weitere Kontrolle der Spezifität des Signals; es sollte negativ sein. </li></ol></li><li> Um ein Bild zu wählen, doppelklicken Sie auf die erste Datei des ersten EAE Maus und überprüfen Sie die Biolumineszenz-Intensität (LUT Bar-Bereich) und Lokalisierung. Überprüfen Sie alle Bilder nacheinander. Schließen Sie die Datei mit der niedrigsten Intensität für jede Maus (dh halten 2 von 3 Bildern pro Maus). </li><li> Bildeinstellung und Ausfuhr <ol><li> Doppelklicken Sie auf die erste Datei zu quantifizieren. Beachten Sie ein neues Fenster öffnet. Unter &quot;Optionen&quot; (oberes Menü), passen Sie die Etiketten in jedem Bild angezeigt werden soll. </li><li> In der rechten Werkzeugpalette, gehen Sie zu &quot;Bildeinstellung.&quot; Standardmäßig werden die minimalen und maximalen Intensitäten auf &quot;auto&quot; und in den Regenbogenpseudo angezeigt. Wählen Sie &quot;Manuell&quot;, um die Einstellungen zu ändern, falls erforderlich. HINWEIS: Zum Beispiel werden alle exportierten Bilder können gleich LUT Bars haben (identische Minima und Maxima) zu sein, leicht vergleichbar.Die Einstellung der Minima und Maxima hat keine Auswirkungen auf die quantitativen Ergebnisse. </li><li> Klicken Sie auf das Bild zu exportieren, wählen png, das Verzeichnis, und ein Bild, Namen </li></ol></li><li> Die Quantifizierung der Regions of Interest (ROI) <ol><li> Gehen Sie auf die &quot;ROI&quot; Werkzeug in der Werkzeugpalette. Wählen Sie den ROI-Methode (Kreis, Rechteck, Auto, oder frei Hand) und die Anzahl der ROIs. Beachten Sie die ROI-Fenster im Bildfenster Pop. </li><li> Mit der Maus, passen Sie die Größe und Position. Verwenden Sie identische ROI Schwellenwerte für alle Bilder, wenn die Auto-ROI-Tool verwendet wird. Verwenden Sie identische Bereiche für alle Bilder , wenn ROI Größen und Positionen manuell definiert werden (zB Kreis ROIs). </li><li> Klicken Sie auf &quot;messen RO.I. Beachten Sie ein neues Fenster öffnet. Passen Sie die Spalten (zB Dateiname, Tiernummer, Gruppe, Experiment, Fläche, insgesamt zählt, Durchschnitt zählt, SD zählt, min und max zählt, Fläche, Zeit Punkt, der Zeit der Sonde Injektion, etc.). speichern Sie die benutzerdefinierten Einstellungen. Wenn ReAdy, alle auswählen (Strg + A) und kopieren und die Tabelle in eine Tabelle einfügen. </li><li> Exportieren Sie das Bild als png mit den ROIs an Ort und Stelle. Speichern und schließen Sie die Bilddatei. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 3.1.6 - 3.1.7) für alle Bilddateien, die quantifiziert werden müssen. Kopieren Sie alle ROI Quantifizierungen in die Tabelle. HINWEIS: Hier können die Ergebnisse nach Gruppen, Zeitpunkt sortiert, usw. und statistisch ausgewertet. Verwenden Sie die Gesamtzahl der Biolumineszenz-Signale in der ROIs für statistische Auswertungen. </li></ol></li><li> Nah-Infrarot (NIR) Analyse von fluoreszierenden Nanopartikeln <ol><li> Verwenden der Bedienelemente in der Software, stellen Sie die Schwelle des Bildes. ANMERKUNG: Dies hat keinen Einfluss auf die quantitative Ergebnis. </li><li> Optisch vergleichen die bei Ex / Em aufgenommenen Bilder 675/720 und Ex / Em 640/700 die Spezifität des Signals zu bewerten. </li><li> Verwenden Sie die aufgenommenen Bilder bei Ex / Em 675/720 für die quantitative Analyse (Anregungsmaximum: 680 nm). Definieren ROIs, für die die automatische ROI Werkzeug verwendet werden kann. Stellen Sie die Auto-ROI Schwelle und verwenden Sie es für alle Bilder. Quantifizieren der Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs (siehe Schritt 3.1). </li></ol></li><li> Nah-Infrarot (NIR) Analyse von Protease-empfindliche Sonde <ol><li> Der Einsatz von Software steuert, stellen Sie die Schwelle des Bildes. ANMERKUNG: Dies hat keinen Einfluss auf die quantitative Ergebnis. Führen Entmischung der Autofluoreszenz. Die Entmischung Werkzeug in lebenden Bild umgesetzt. Die Auto-Entmischung verwendet die Ex / Em 640/700 als spezifische und 675/720 als Autofluoreszenzbild. </li><li> Wählen Sie das ungemischte Bild und definieren Sie die ROIs, wie oben beschrieben. Verwenden Sie die Gesamtstrahlungseffizienz in ROIs für quantitative und statistische Analysen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die vorliegende Video zeigt Techniken zur Biolumineszenz und Nah-Infrarot - Fluoreszenz in vivo Bildgebung von EAE in SJL / J - Mäusen. Wir zeigen, dass Biolumineszenz-Bildgebung eine entzündungs ​​empfindliche Sonde zeigt hauptsächlich optische Neuritis verwenden, und die Quantifizierung stimmt mit der klinischen Bewertung von EAE Schwere und die Auswirkungen von Medikamenten. Jedoch war die Biolumineszenz - Bildgebungsverfahren nicht in der Lage Entzündung des lumbalen Rückenmarks zu erkennen, die eine primär...

Multiple Sklerose wird durch den autoimmunvermittelten Angriff und die Zerstörung der Myelinscheide im Gehirn und im Rückenmark verursacht1. Mit einer Gesamtinzidenz von etwa 3,6 Fällen pro 100.000 Menschen pro Jahr bei Frauen und etwa 2,0 bei Männern ist MS nach traumatischen Verletzungen die zweithäufigste Ursache für neurologische Behinderungen bei jungen Erwachsenen2,3. Zur Krankheitspathologie tragen genetische und umweltbedingte Faktoren bei4, ist aber noch nicht vollständig verstanden. Autoreaktive T-Lymphozyten gelangen in das zentrale Nervensystem und lösen eine Entzündungskaskade aus, die fokale Infiltrate in der weißen Substanz des Gehirns, des Rückenmarks und des Sehnervs verursacht. In den meisten Fällen sind diese Infiltrate zunächst reversibel, aber die Persistenz nimmt mit der Anzahl der Schübe zu. Es wurden eine Reihe von Nagetiermodellen entwickelt, um die Pathologie der Krankheit zu untersuchen. Die schubförmig-remittierende EAE bei SJL/J-Mäusen und die primär-progressive EAE bei C57BL6-Mäusen sind die beliebtesten Modelle.
Die klinischen EAE-Werte, die das Ausmaß der motorischen Funktionsdefizite beschreiben, und das Körpergewicht sind die Goldstandards zur Beurteilung des EAE-Schweregrades. Diese klinischen Symptome stimmen mit dem Ausmaß der Infiltration von Immunzellen und der Myelinzerstörung im Rückenmark überein und sagen die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlung beim Menschen mäßig voraus5. Diese Anzeichen spiegeln jedoch hauptsächlich die Zerstörung der ventralen Faserbahnen im Rückenmark wider. Derzeit gibt es keine einfache, nicht-invasive, zuverlässige und reproduzierbare Methode, um In-vivo-Hirninfiltration und Optikusneuritis bei lebenden Mäusen zu beurteilen. 
Die In-vivo-Bildgebung stimmt mit den 3 "R"-Prinzipien von Russel und Burch (1959) überein, die eine R-Platzierung, R-Eductionund R-Verfeinerung von Tierversuchen beanspruchen6, da die Bildgebung die Messwerte eines Tieres zu mehreren Zeitpunkten erhöht und eine Reduzierung der Gesamtzahlen ermöglicht. Derzeit wird der Entzündungs- oder Myelinstatus hauptsächlich ex vivo mittels Immunhistochemie, FACS-Analyse oder verschiedenen molekularbiologischen Methoden beurteilt 7, die alle euthanasierte Mäuse zu bestimmten Zeitpunkten erfordern. 
Eine Reihe von in vivo Bildgebungssystemsonden wurden entwickelt, um Entzündungen in der Haut, den Gelenken und im Gefäßsystem zu beurteilen. Die Techniken beruhen auf der Aktivierung von biolumineszierenden oder nahinfrarotfluoreszierenden Substraten durch Gewebeperoxidasen, einschließlich Myeloperoxidase (MPO), Matrix-Metalloproteinasen (MMPs)8 und Cathepsine9 oder Cyclooxygenase2. Diese Sonden wurden hauptsächlich in Modellen für Arthritis oder Atherosklerose validiert9,10. Eine Cathepsin-empfindliche Sonde wurde auch für die molekulare Fluoreszenztomographie von EAE11 verwendet. MMPs, insbesondere MMP2 und MMP9, tragen zur Protease-vermittelten BHS-Disruption in EAE bei und sind an Stellen der Immunzellinfiltration hochreguliert12, was darauf hindeutet, dass diese Sonden für die EAE-Bildgebung nützlich sein könnten. Gleiches gilt für Peroxidase- oder Cathepsin-basierte Sonden. Technisch gesehen ist die Bildgebung von Entzündungen im Gehirn oder Rückenmark wesentlich schwieriger, da der Schädel oder die Wirbelsäule biolumineszierende und Nahinfrarotsignale absorbieren. 
Zusätzlich zu den Entzündungsindikatoren wurden fluoreszierende Chemikalien beschrieben, die spezifisch an Myelin binden und eine Quantifizierung der Myelinisierung ermöglichen könnten13. Es wurde festgestellt, dass eine Nahinfrarot-Fluoreszenzsonde, 3,3'-Diethylthiatricarbocyaniniodid (DBT), spezifisch an myelinisierte Fasern bindet und als quantitatives Werkzeug in Mausmodellen für primäre Myelinisierungsdefekte und in der durch Cuprizzon evozierten Demyelinisierung validiert wurde14. In der EAE war das DBT-Signal eher erhöht, was die Entzündung der Myelinfasern widerspiegelt5. 
Ein zusätzliches Kennzeichen von EAE und MS ist der Abbau von BHS, was zu einer erhöhten Gefäßpermeabilität und der Extravasation von Blutzellen, extrazellulärer Flüssigkeit und Makromolekülen in das ZNS-Parenchym führt. Dies kann zu Ödemen, Entzündungen, Oligodendrozytenschäden und schließlich zur Demyelinisierung führen15,16. Daher kann die Visualisierung des BHS-Lecks mit Fluoreszenzsonden wie Fluorochrom-markiertem Rinderserumalbumin5, das sich normalerweise sehr langsam vom Blut zum Gewebe verteilt, zur Beurteilung von EAE nützlich sein.
In der vorliegenden Studie haben wir die Nützlichkeit verschiedener Sonden in EAE bewertet und zeigen das Verfahren für die zuverlässigste und robusteste Biolumineszenztechnik. Darüber hinaus diskutieren wir die Vor- und Nachteile von Nahinfrarotsonden für die MMP-Aktivität und die BHS-Integrität.

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10149</td><td>Bildgebende Sonde, pegylierte Nanopartikel, nützlich für die Bildgebung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10126</td><td>Bildgebende Sonde, aktivierbar durch Matrix-Metalloproteinasen, nützlich für die Bildgebung von Entzündungen</td></tr><tr><td>XenoLight RediJect Entzündungssonde</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>760535</td><td>Bildgebende Sonde, aktivierbar durch Oxidasen, nützlich für die Bildgebung von Entzündungen</td></tr><tr><td>PLP139-151/CFA-Emulsion&nbsp;</td><td>Hooke Labs, St. Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE-Induktionskit</td></tr><tr><td>Pertussis Toxin</td><td>Hooke Labs, St. Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE-Induktionskit</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td></td><td>Biolumineszenz- und Infrarot-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>LivingImage 4.5 Software&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>CLS136334</td><td>IVIS-Analysesoftware</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott Labs, Illinois, USA</td><td>26675-46-7</td><td>Anästhesie</td></tr></tbody></table>

biolumineszenz und nah-infrarot-imaging von neuritis und gehirnentzündung im eae-modell der multiplen sklerose in mäusen

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) in SJL / J-Mäusen ist ein Modell für rezidivierend-remittierender Multipler Sklerose (RRMS). Klinische EAE Scores Motorik Defizite beschreiben, sind Grund Auslesungen der immunvermittelte Entzündung des Rückenmarks. Allerdings Gewicht Scores und Körper nicht erlauben , für eine in vivo Beurteilung der Entzündung des Gehirns und Neuritis. Letzteres ist eine frühe und häufige Erscheinung in etwa 2/3 MS-Patienten. Hier zeigen wir Methoden für die Biolumineszenz und Nah-Infrarot - Live - Bildgebung zur Beurteilung EAE Neuritis hervorgerufen, Gehirnentzündung und Blut-Hirn - Schranke (BHS) Störung in lebenden Mäusen unter Verwendung eines in vivo - Bildgebungssystem. Ein Biolumineszenz-Substrat aktiviert durch Oxidasen zeigte in erster Linie optische Neuritis. Das Signal war spezifisch und erlaubt die Visualisierung von Arzneimittelwirkungen und Krankheitszeitkurse, die die klinischen Bewertungen einher. Pegyliertem fluoreszierende Nanopartikel, die innerhalb der vasculatur bliebe für längere Zeiträume verwendet wurden, die BBB Integrität zu beurteilen. Nah-Infrarot-Bildgebung ergab einen BBB-Leck auf dem Höhepunkt der Krankheit. Das Signal war das stärkste um die Augen. Ein Nahinfrarot-Substrat für Matrixmetalloproteinasen wurde verwendet EAE-evozierte Entzündung zu beurteilen. Auto-Fluoreszenz mischte sich mit dem Signal, erfordern Entmischung zur Quantifizierung. Insgesamt war Biolumineszenz-Bildgebung eine zuverlässige Methode EAE-assoziierte optische Neuritis und Medikamente Effekte und war besser als die Nah-Infrarot-Techniken in Bezug auf Signal Spezifität, Robustheit, einfache Quantifizierung und Kosten zu bewerten.

Zeitverlauf der Biolumineszenz von Neuritis Das Biolumineszenz-Signal der Entzündung Sonde war das stärkste um die Augen und trat ausschließlich in EAE Mäuse mit Optikusneuritis. Ein Signal, trat bei keiner der nicht-EAE Mäuse noch die Mäuse nicht mit der Entzündung Sonde injiziert. Das Signal verschwunden, wenn die Mäuse gewonnen. Daher ist das Signal für Optikusneuritis spezifisch und die Spitze des Signals ...

Wir zeigen eine Technik für die in vivo lebenden Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Enzephalitis in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell für Multiple Sklerose in SJL / J - Mäusen.

Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

Das übergeordnete Ziel dieser Bildgebungstechnik besteht darin, die optische Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der multiplen Sklerose bei lebenden Mäusen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Die Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroimmunologie zu beantworten, beispielsweise nach neuen Mechanismen, die den Verlauf der EAE und der multiplen Sklerose beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die eae-bedingte optische Neuritis und Gehirnentzündung bei lebenden Mäusen während des gesamten Krankheitsverlaufs beobachtet und quantifiziert werden können.Die Implikationen dieser Technik reichen bis in die Therapie hinein, da wir Wirkungen von Medikamenten beobachten können, die sich aus den EAE-Scores nicht ergeben. Lösen Sie in diesem Verfahren PTX bei zwei Mikrogramm pro Milliliter in 1x PBS und mischen Sie gut. Injizieren Sie dann 100 Mikroliter PLP/CFA subkutan zweimal am Schwanzansatz der Mäuse während einer kurzen Isofluran-Narkose.Nicht in den Nacken spritzen, da eventuelle Immunreaktionen in der Haut des oberen Rückens oder des Nackens die Bildgebung von Kopf und Rückenmark stören würden. Ein bis zwei Stunden nach der Immunisierung 100 Mikroliter PTX den Mäusen intraperitoneal injizieren. Danach 24 Stunden nach der Immunisierung den Mäusen erneut 100 Mikroliter PTX injizieren.Bei den Kontrollmäusen jeweils 100 Mikroliter CFA ohne PLP zweimal an der Schwanzbasis injizieren. Ab dem siebten Tag nach der Immunisierung die klinischen Symptome täglich gemäß den standardisierten Bewertungssystemen beurteilen. Wenn die Mäuse einen Wert über eins erreichen, was ungefähr am 10. bis 12. Tag nach der Immunisierung der Fall sein wird, die erste Bildgebung zum Krankheitsbeginn durchführen.Danach erfolgt die zweite Bildgebung zum Höhepunkt der Erkrankung, der etwa ein bis zwei Tage nach Auftreten der ersten Symptome liegt und ein bis drei Tage anhält. Anschließend erholen sich die Mäuse vollständig innerhalb von sieben bis zehn Tagen. Die Bildgebung während der Zwischenphasen kann weiterhin Gefäßleckagen zeigen, aber die Entzündungsmarker sollten negativ sein.Um eine In-vivo-Bildgebung durchzuführen, halten Sie die Mäuse während aller Bildgebungsverfahren unter einer 2 % bis 2,5 %igen Isofluran-Anästhesie. Positionieren Sie zwei Mäuse nebeneinander im Gerät und platzieren Sie die oberen Wirbelsäulen der Mäuse in der Mitte. Danach schirmen Sie die Stelle der Immunisierung mit schwarzem Tuch ab.Öffnen Sie die Software zur Bildaufnahme und initialisieren Sie die Kamera. Nehmen Sie anschließend ein Basisbild auf, um die korrekte Positionierung der Mäuse zu überprüfen. Verwenden Sie danach den B-Fokus mit einem Abstand von 6,5 Zentimetern zur Kamera, um alle Bilder aufzunehmen.Mischen Sie danach das gebrauchsfertige Chemilumineszenz-Reagenz auf 40 Milligramm pro Milliliter, bevor Sie die Spritze füllen. Injizieren Sie anschließend 100 Mikroliter davon intraperitoneal in die Mäuse und nehmen Sie die Biolumineszenzbilder fünf, 10 und 15 Minuten nach der Injektion auf. Öffnen Sie in diesem Verfahren die Software zur Biolumineszenz-Analyse.Klicken Sie in der oberen Menüleiste auf das Symbol Dateibrowser. Navigieren Sie zum Verzeichnis des Experimentordners, öffnen Sie die Dateien und konfigurieren Sie anschließend die Spalten, um die für das Experiment relevanten Beschreibungen anzuzeigen. Zur Qualitätskontrolle klicken Sie auf eine Datei einer nicht ansprechenden Maus ohne Symptome einer EAE oder auf eine naive Maus, um die Spezifität der EAE-Signale zu überprüfen.Als zusätzliche Kontrolle der Spezifität des Signals überprüfen Sie das Basislinienbild vor der Probinjektion für jede Maus, das negativ sein sollte. Um ein Bild auszuwählen, klicken Sie auf die erste Datei der ersten EAE-Maus und prüfen Sie die biolumineszente Intensität und Lokalisation. Überprüfen Sie alle Bilder einzeln nacheinander.Verwenden Sie für die Quantifizierung das Bild mit dem stärksten Signal für jede Maus. Doppelklicken Sie auf die erste Datei, die quantifiziert werden soll, um das Bild anzupassen und zu exportieren. Passen Sie in einem neu geöffneten Fenster über die Schaltfläche Optionen die Beschriftungen an, die auf jedem Bildschirm angezeigt werden sollen.Wählen Sie in der rechten Werkzeugpalette die Bildanpassung aus. Standardmäßig sind die minimalen und maximalen Intensitäten auf „Auto“ eingestellt und werden in Regenbogen-Pseudofarbe angezeigt. Wählen Sie „Manuell“, um die Einstellungen bei Bedarf zu ändern.Klicken Sie anschließend in „Image Export“, wählen Sie PNG, das Verzeichnis und einen Bildnamen aus. Um die Bereiche von Interesse zu quantifizieren, wechseln Sie zum ROI-Tool in der Werkzeugpalette. Wählen Sie die ROI-Methode und die Anzahl der ROIs aus.Passen Sie im ROI-Fenster innerhalb des Bildfensters Größe und Position der ROI an. Verwenden Sie bei Nutzung des automatischen ROI-Tools identische ROI-Schwellenwerte für alle Bilder. Verwenden Sie, falls die ROI-Größen und -positionen manuell festgelegt werden, für alle Bilder identische Bereiche.Klicken Sie danach auf ROI messen. Passen Sie die Spalten mit den experimentellen Angaben in einem neuen Popup-Fenster an und speichern Sie diese. Wenn Sie bereit sind, wählen Sie alles aus und kopieren Sie die Tabelle, um sie in eine Tabellenkalkulation einzufügen.Anschließend das Bild als PNG mit den ROIs an ihrer Position exportieren. Danach die Bilddatei speichern und schließen. Hier sind Beispiele von zwei SJL/J-Mäusen, die am Tag 10 und 14 nach der EAE-Induktion abgebildet wurden.Das biolumineszente Signal um die Augen war am Tag 10 am stärksten und verschwand, als die Mäuse mit der Genesung begannen. Die Balkendiagramme hier zeigen die Quantifizierung der biolumineszenten Signale am Tag 10 und 14, während die klinischen EAE-Scores hier dargestellt sind. In dieser Abbildung zeigen die biolumineszenten Aufnahmen von jeweils fünf Mäusen pro Gruppe die Wirkung des Medikaments, bei dem die optische Neuritis bei mit R-Flurbiprofen behandelten Mäusen verringert war.Die Quantifizierung der gesamten biolumineszenten Zählungen in den interessierenden Bereichen (ROIs) bestätigte die signifikante Wirksamkeit der Behandlung. Nachdem die Technik beherrscht ist, kann sie in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Mäuse, die abgebildet werden sollen. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, weiße Mäuse zu verwenden und den klinischen EAE-Verlauf genau zu beobachten.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die FACS-Analyse oder Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise zur Immunzellinfiltration des Rückenmarks. Nach dem Anschauen des Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man optische Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der multiplen Sklerose mittels bioluminescenzbasierten Imaging untersucht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Beurteilung der Störung der Blut-Hirn-Schranke in einem EAE-Mausmodell. Fluoreszierende Farbstoffe unterschiedlicher Größe werden retroorbital injiziert und zirkulieren durch die Blutgefäße des Gehirns. Der kleinere Farbstoff dringt durch Lücken in das Hirngewebe ein, während der größere Farbstoff nur dann eintritt, wenn die Störung schwerwiegend ist, was mit dem Ausmaß der Barriereschädigung korreliert.

Bestimmung der Störung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen in einem EAE-Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Quelle: Breid, S., et. al. Biolumineszenz-Bildgebung der Neuroinflammation bei transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein-Fibrillen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen und zeigt Luciferase-Luciferin-Reaktionen in aktivierten Astrozyten. Das Protokoll ermöglicht die nicht-invasive Quantifizierung der astrozytären Aktivierung und unterstützt Studien zur ZNS-Entzündung und zur therapeutischen...

Biolumineszenz-Bildgebung der Neuroinflammation bei einer transgenen Maus

&lt;p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Quelle: Schmitz, K., et al., Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Hirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose bei Mäusen. J. Vis. (2017).Dieses Video zeigt die Methode zur Visualisierung und Überwachung von experimenteller Autoimmun-Enzephalomyelitis oder EAE-induzierter Entzündung im Sehnerv mit Biolumineszenz-Bildgebung. Dazu gehören die Positionierung der Maus, die Injektion von...

Biolumineszenz-Bildgebung in einem EAE-Mausmodell

Wir beschreiben eine Methode zur Implantation und Aufrechterhaltung von Glasfenstern über dem freiliegenden Rückenmark erwachsener Mäuse zur Untersuchung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis. Diese Fenster bieten einen chronischen optischen Zugang zum Rückenmark zur Überwachung der Zelldynamik auf subzellulärer Ebene bei lebenden Tieren mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Implantation von gläsernen Rückenmarksfenstern bei erwachsenen Mäusen mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Periphere Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in das Peritoneum oder die Zunge von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, der humanen alpha-Synuclein mit der familial A53T - Mutation exprimieren und Glühwürmchen - Luciferase kann Neuropathologie, einschließlich neuroinflammation induziert in ihrem Zentralnervensystem.

Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein

Dieses Protokoll beschreibt wie hochauflösende bildgebende Verfahren wie spectral-Domain optische Kohärenztomographie und scanning Laser Ophthalmoskopie in kleine Nagetiere, mit einer ophthalmologischen Bildgebung Plattform-System, um Auskunft über genutzt werden Netzhautdicke und Microglial Zelle Verteilung, beziehungsweise.

In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell der Multiplen Sklerose. Dieser Artikel beschreibt einen Ansatz zur Bewertung von Rückenmarksentzündungen, Demyelinisierung und axonalen Verletzungen bei EAE. Darüber hinaus wird eine Methode zur Quantifizierung des löslichen Neurofilament-Lichtspiegels im Mäuseserum vorgestellt, die die Beurteilung der axonalen Schädigung in lebenden Mäusen erleichtert.

Bewertung von Entzündungen, Demyelinisierung und Axonverletzungen des Zentralnervensystems bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Erfahren Sie, wie Biolumineszenz- und Nah-Infrarot-Imaging Optikusneuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose bei lebenden Mäusen visualisieren und quantifizieren.

Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen

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