Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, robust und konsistent künstlich hergestellte Blutgefäße jeder Größe zu erzeugen. Diese Technik ermöglicht eine zuverlässige und effektive Konstruktion von Blutgefäßen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Behälter jeder Größe einfach und zuverlässig hergestellt werden können.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir darüber diskutierten, wie man eine Geweberöhre konstruiert, und unsere Methode mit dem Bau von Straßentunneln verglich, ein Segment nach dem anderen. Um die 3D-gedruckten Einsätze vorzubereiten, tragen Sie zunächst eine dünne Schicht aus zwei, vier oder sechs ml ungehärtetem Silikon auf den Boden einer 35-, 60- bzw. 100-Millimeter-Petrischale auf. Um Pfosten für die 35-mm-Platten zu erstellen, gießen Sie PDMS in eine andere 100-mm-Platte mit einer Höhe von sieben mm und erhitzen Sie das PDMS auf einer Heizplatte bei 60 Grad Celsius für zwei bis drei Stunden.

Wenn das PDMS ausgehärtet ist, verwenden Sie einen Fünf-mm-Biopsiestanzer, um zylindrische Stifte zu erstellen. Verwenden Sie eine kleine Menge nicht ausgehärtetes PDMS, um die Zylinder in der Mitte jeder 35-mm-Platte zu befestigen. Platzieren Sie eine 3D-gedruckte Außenschale mit einem Durchmesser von etwa 66,7 mm in gleichem Abstand zum Pfosten in die 100-mm-Platten.

Bevor das PDMS an der Unterseite der 60- und 100-mm-Platten ausgehärtet wird, platzieren Sie 3D-gedruckte Pfosten mit einem Durchmesser von 10 und 20 mm zentral in jeweils 60- bzw. 100-mm-Platten. Lassen Sie das Geschirr zwei bis drei Stunden an der frischen Luft auf der 60 Grad Celsius heißen Platte aushärten, gefolgt von einer achtzehnstündigen Polymerentgasung. Am Ende der Entgasung die Innenseiten aller Platten mit 70 % Ethanol sterilisieren und jede Platte 30 Minuten lang abdecken.

Saugen Sie dann vorsichtig das Ethanol aus jeder Platte an, um das Trocknen an der Luft zu ermöglichen. Wenn die Platten trocken sind, bringen Sie sie in eine biologische Sicherheitswerkbank neben den entsprechenden verdeckten Deckeln. und setzen Sie die Materialien 30 Minuten lang UV-Licht aus, um die Sterilisation abzuschließen.

Zur Zubereitung des Fibrin-Hydrogels werden zunächst 0,5, 1,1 und 1,81 ml Wachstumsmedium mit Fibringel und TGF Beta 1 in 35-, 60- bzw. 100-mm-Kulturschalen gegeben. Geben Sie als Nächstes 40 88,4 und 145 Mikroliter Thrombin auf die 35-, 60- bzw. 100-mm-Platten und schwenken Sie jede Platte vorsichtig von Hand. Wenn das Thrombin gleichmäßig verteilt ist, fügen Sie 160, 354 und 580 Mikroliter Fibrinogen mit einer tropfenweisen kreisenden Bewegung zu der Thrombin-Mediummischung in den 35-, 60- bzw. 100-mm-Platten hinzu und schwenken Sie die Platten vorsichtig, um das Hydrogel gleichmäßig zu verteilen.

Lassen Sie das Hydrogel 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur aushärten. Trypsinisieren Sie dann die interessierenden Zellen der glatten Muskulatur, expandieren Sie in 150-mm-Zellkulturplatten und sammeln Sie die abgelösten Zellen durch Zentrifugalisierung. Suspendieren Sie die Pellets erneut in drei ml Differenzierungsmedium und verwenden Sie eine Zwei-ml-Pipette, um die Zellen kräftig zu zerkleinern, um eventuelle Zellklumpen aufzubrechen.

Nach der Zählung werden die Zellen in 2/10 10 bis zur 6., 1/10 10 bis zur 7. und 1,4 x 10 bis zur 7. Zellen pro ml Aliquote in konische 50-ml-Röhrchen aufgeteilt, die entsprechend den entsprechenden Kulturplatten markiert sind. Geben Sie Differenzierungsmedium in jedes Röhrchen, um ein endgültiges Aussaatvolumen von zwei, vier und fünf ml für jede 35-, 60- bzw. 100-mm-Platte zu erhalten. Geben Sie dann die Zelllösungen vorsichtig tropfenweise auf das vorbereitete Hydrogel in jeder entsprechenden Platte für die Expansion im Zellkultur-Inkubator. Nach zwei bis vier Tagen haben sich die Ringe vollständig in Richtung ihrer Pfosten zusammengezogen.

Fügen Sie also 10, 20 oder 35 mL TGF Beta 1 zu jedem 35-, 60- bzw. 100-mm-Ring hinzu. Um das Gefäßkonstrukt für das 35-mm-Gefäß zusammenzubauen, schneiden Sie einen zwei Zoll großen Abschnitt von der Oberseite eines 50 ml großen konischen Polycarbonat-Rohrs ab. Und PDMS kleben Sie die obere Kante in eine 35-mm-Platte, um eine hohe Platte für das Ringstapeln zu erstellen. Für die 60- und 100-mm-Behälter mit hohen Ringstapelplatten wird ein Polycarbonatrohr mit einem Durchmesser von 1,75 Zoll in 2,5-Zoll-Abschnitte längs geschnitten, die als hohe Plattenwände dienen.

Schneiden Sie für die hohen Plattenböden eine 0,125 Zoll dicke Polycarbonatplatte in Kreisstücke mit einem Durchmesser von zwei Zoll. Mit Lösemittelzement aus Acryl werden die Rohrabschnitte aus Polycarbonat mit den kreisförmig geschnittenen Stücken verbunden. 3D-Druck von Pfosten mit fünf, zehn und 20 mm Durchmesser und einer Länge von 50 mm.

Geben Sie dann 10 ml ungehärtetes Silikon in jeden Behälter und platzieren Sie jeden 3D-gedruckten Stift zentral in jedem 35-, 60- und 100-mm-Behälter, bevor das PDMS vollständig ausgehärtet ist. Und stellen Sie das Geschirr für zwei bis drei Stunden auf eine 60 Grad Celsius heiße Platte. Wenn das PDMS ausgehärtet ist, sterilisieren Sie die Platten mit 70 % Ethanol, wie gerade gezeigt, und setzen Sie die getrockneten Ethanol-sterilisierten Behälter 30 Minuten lang UV-Licht aus.

Heben Sie nun mit zwei Paaren sehr feiner Pinzetten vorsichtig zuerst die eine und dann die andere Seite eines fest gerollten Hydrogel-Rings für glatte Muskeln von seinem Pfosten an. Schieben Sie dann vorsichtig eine Seite des Rings und dann die andere Seite auf den hohen Pfosten des entsprechenden größeren Behälters. Schieben Sie den Ring in einem Umfang mit sanften, allmählichen Bewegungen langsam nach unten und stapeln Sie anschließend weitere Geweberinge, bis die gewünschte Gefäßlänge erreicht ist.

Wenn alle Ringe gestapelt sind, drehen Sie die Platten so, dass die Pfosten parallel zur Arbeitsfläche sind, und geben Sie vorsichtig 40, 80 und 160 Mikroliter Thrombin auf die Außenfläche jedes 35-, 60- bzw. 100-mm-Gefäßes, während Sie die Platten langsam drehen. Geben Sie anschließend 40, 80 und 160 Mikroliter Fibrinogen zu jedem 35-, 60- bzw. 100-mm-Konstrukt so schnell und gleichmäßig wie möglich, während Sie das Konstrukt zügig drehen. Thrombin und Fibrinogen werden beim Mischen schnell zu einem festen Gel.

Geben Sie dann 20 mL Differenzierungsmedium in jeden Konstruktbehälter und stellen Sie die Gefäße bis zur Verwendung in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Die histologische Analyse zeigt eine hohe Zellularität in allen Ringgrößen, wobei eine geringe Menge an Restfibringel an den Außenrändern der kleinen Ringe beobachtet wurde. In den größeren Ringen ist etwas Fibringel mit dem zellulären Inhalt durchsetzt, wobei sowohl in den Zwischenringen als auch in den großen Ringen Hinweise auf eine Kollagenproduktion erkennbar sind.

Die Geweberinganalyse für die Expression von Alpha-Aktin und Tropomyosin der glatten Muskulatur zeigt, dass alle Ringgrößen für beide Antikörper positiv sind, was bestätigt, dass der Phänotyp der glatten Muskulatur erhalten blieb. Zugversuche zeigen einen konsistenten Trend zunehmender Festigkeit, der mit einer zunehmenden Ring- und Gefäßgröße bei allen drei Ringgrößen korreliert. Die Zellaussaatzahlen für die Erstellung der verschiedenen Ringgrößen korrelieren auch mit der Aussaatfläche.

Diese Behälterkonstruktionen sind auch in der Lage, einem Durchfluss von bis zu fünf Minuten bei Durchflussraten von 100 bis 417 ml pro Minute standzuhalten, wobei nur geringfügige Leckagen an den Stellen beobachtet werden, an denen die Behälter mit dem Profusion-System verbunden sind. Einmal gemeistert, können die Ringe in einer Stunde hergestellt werden, wenn die Technik richtig ausgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Hydrogel-Komponenten gründlich zu mischen, um das Abbinden des Gels und die richtige Ringbildung sicherzustellen.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie die Herstellung von Ringen anderer Zelltypen, durchgeführt werden, um andere Gewebetypen zu züchten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Ringstapelmethode verwenden können, um Gefäßgewebe verschiedener Größen zu entwickeln.