Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die biochemischen Signalwege zu untersuchen, die als Reaktion auf mechanische Spannung aktiviert werden, indem ligandenbeschichtete magnetische Mikroperlen verwendet und zwangsweise an Adhärenzrezeptoren angeheftet werden. Diese Methode kann dazu beitragen, offene Fragen im Bereich der Mechanotransduktion zu klären, beispielsweise wie mechanische Spannung durch die exprimierten Helometriken die Differenzierung beeinflusst oder wie die Gewebekompliance ihre Umwandlung steuert. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass viele Zellen gleichzeitig für die chemische Analyse stimuliert werden können, indem mit Hilfe der Perlen gezielt mechanische Spannung auf eine bestimmte Untergruppe von Adhärenzrezeptoren ausgeübt wird.

Als Erstes die superparamagnetischen tosylaktivierten Perlen im Originalfläschchen mindestens 30 Sekunden lang durch Vortexen gründlich resuspendieren. 40 Mikroliter der resuspendierten superparamagnetischen Perlen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren, das ein Milliliter 0,1-molarer Natriumphosphatpuffer mit pH 7,4 enthält. Danach das Röhrchen auf einen Magnetseparator stellen, um die magnetischen Perlen von der Lösung zu trennen.

Entfernen Sie den Überstand und nehmen Sie das Röhrchen vom magnetischen Trennstand. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter 0,1 molarer Natriumphosphatpufferlösung mit pH 7,4. Nachdem die Kügelchen zweimal gewaschen wurden, resuspendieren Sie sie in einem Milliliter desselben Puffers.

Anschließend 100 Mikrogramm bovines Fibronectin oder einen anderen Liganden für Zelladhärenzrezeptoren zu den Kügelchen geben und vortexen. Wiederholen Sie diesen Schritt, wobei der Ligand durch BSA, Poly-D-Lysin oder Apotransferrin für negative Kontrollen ersetzt wird. Inkubieren Sie die Kügelchen mit der ligandenhaltigen Lösung 12 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator.

Wenn nach der Reaktion Aggregate aus Kügelchen entstehen, dürfen diese nicht länger als 10 bis 20 Sekunden sonifiziert werden. Danach werden die Kügelchen mithilfe eines magnetischen Trennstands isoliert und die restliche Lösung abgesaugt. Anschließend wird ein Milliliter einer PBS-Lösung, die mit 0,2 % Rinderserumalbumin angereichert ist, zugegeben.

Einmal stundenlang auf einem Rotor bei 37 Grad Celsius inkubieren. Mit einem Magneten die Kügelchen zweimal mit einem Milliliter PBS-Lösung, die mit 0,2 % Rinderserumalbumin ergänzt wurde, waschen. Vor dem erneuten Aufschwemmen in einem Milliliter desselben Puffers.

Sonifizieren Sie die Kügelchen, falls Aggregate auftreten, nicht länger als 20 bis 30 Sekunden. Fahren Sie mit den Zelltests fort oder lagern Sie die Kügelchen bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius. Kultivieren Sie adhärente Zellen in einer 60-Milliliter-Zellkulturschale in geeignetem Wachstumsmedium, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.

Nachdem die ligandenbeschichteten Kügelchen pelletiert wurden, das Pellet in einem Milliliter PBS-Lösung resuspendieren, die mit 0,2 % Rinderserumalbumin ergänzt ist. 100 Mikroliter der ligandenbeschichteten Kügelchenlösung zu fünf Millilitern warmem Kulturmedium hinzufügen und vortexen. Danach das Medium in einer 60-Milliliter-Kulturschale abpipettieren und fünf Milliliter warmes Wachstumsmedium, das mit Kügelchen ergänzt ist, hinzufügen.

Inkubieren Sie die Suspension 20 Minuten lang unter Zellkulturbedingungen, damit sich die Kügelchen absetzen und an die Zellen anheften können. Es ist entscheidend, die Inkubationszeit von 20 Minuten nicht zu überschreiten, da die Kügelchen andernfalls durch Phagozytose internalisiert werden könnten. Danach beobachten Sie die Kügelchen unter einem Lichtmikroskop mit einem 10X- oder 20X-Objektiv.

Überprüfen Sie die Anheftung der Kügelchen, indem Sie die Schale leicht schütteln, um zwischen angehefteten und schwimmenden Kügelchen zu unterscheiden. Legen Sie einen runden 38-Millimeter-Neodym-Magneten auf die obere Fläche eines normalen 60-Millimeter-Kulturschalen-Deckels und halten Sie ihn mit zwei kleineren 13-Millimeter-Neodym-Magneten, die auf der unteren Fläche des Deckels positioniert sind, an Ort und Stelle. Inkubieren Sie die Zellen, die mechanischer Spannung ausgesetzt wurden, für die gewünschten Zeitpunkte und unter den gewünschten Zellkulturbedingungen.

Ersetzen Sie den normalen Schalenboden durch einen Deckel mit Magnet. Da die Magnete sehr stark sind, sollten sie vorsichtig gehandhabt werden. Nach der Behandlung stellen Sie die Schale auf Eis und aspirieren vorsichtig das gesamte Medium aus der Schale.

Fügen Sie 300 Mikroliter Zelllysepuffer hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis. Sammeln Sie dann das Lysat mit einem Zellabstreifer und überführen Sie es in ein vorab gekühltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die magnetischen Perlen mithilfe des magnetischen Trennstands und überführen Sie das gesamte Zelllysat in ein neues, vorab gekühltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Entnehmen Sie eine 15-Mikroliter-Aliquot aus dem gesamten Zelllysat, das nach der Bead-Separation erhalten wurde, zur Western-Blot-Analyse. Waschen Sie die Beads dreimal mit je einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer. Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter Probenpuffer zum Bead-Pellet hinzu.

Nach dem Mischen der Suspension durch Vortexen wird diese fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius unter Verwendung eines Trockenblockheizers gekocht. Dieser Bruchteil enthält die isolierten Adhärenzkomplexe. Fahren Sie mit der biochemischen Analyse fort oder lagern Sie den Bruchteil bei minus 20 Grad Celsius.

Diese Abbildung dient zur Demonstration der Reinigung der Adhärenzkomplexe. Die GAPDH-Immunblot-Analyse wird als Ladekontrolle für das gesamte Zelllysat sowie zur Überprüfung der Reinheit der Adhärenzkomplexe verwendet. Eine lange Belichtung wurde angewendet, um das Fehlen eines zytoplasmatischen Signals in der gereinigten Fraktion der Adhärenzkomplexe zu bestätigen.

Beschichtete Fibronectin-Perlen wurden verwendet, um die Mechano-Transduktionsprozesse zu untersuchen, die im Verlauf der Zeit an den Adhäsionskomplexen als Reaktion auf Zugspannung auftreten. Nach der magnetischen Trennung der Fraktion der Adhäsionskomplexe wurden das Lysat und die Fraktion der Adhäsionskomplexe mittels Western Blot analysiert. Als Ladekontrolle sowie Kandidaten, von denen bekannt ist, dass sie an Adhäsionskomplexen als Reaktion auf mechanische Spannung rekrutiert oder phosphoryliert werden, wurden immunologische Nachweise durchgeführt.

Während die mechanische Spannung die Rekrutierung von Paxillin zu den Adhäsionskomplexen nicht beeinflusste, wurde die Phosphorylierung an Tyrosin 31 sowohl im gesamten Zelllysat als auch im Fraktion der Adhäsionskomplexe durch mechanische Spannung verstärkt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Spannungskräfte auf Adhäsions-Oberflächenproteine mithilfe magnetischer Kügelchen anwendet. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, vorsichtig mit den starken Magneten umzugehen. Mithilfe dieses Verfahrens können biochemische Untersuchungen wie Western Blots, Aktinpolymerisationsassays oder enzymatische Assays durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die Kinasenaktivität durch mechanische Spannung reguliert wird. Diese Technik könnte Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie helfen, magnetisch empfindliche Signalwege in Zellen zu untersuchen.