Name: Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Zelloberflächenhaftung unter mechanischer Spannung mit magnetischen Mikroperlen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung biochemischer Signalwege in der Mechanotransduktion.

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CG wird durch Zuschüsse der Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramm (Marie-Curie-Career Integration n˚8304162) und vom European Research Council (ERC) im Rahmen der Europäischen Union Horizon unterstützt 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm (ERC Starting Grant n˚639300).

1. Ligand Konjugation an Magnetic Beads Hinweis: Ligand Konjugation durchgeführt unter Verwendung von superparamagnetischen Tosyl-aktivierte Kügelchen mit einem 2,8 &amp; mgr; m Durchmesser (Konzentration der Stammlösung 10 8 Perlen / ml, 30 mg Perlen / ml). Das folgende Protokoll basiert auf Proben von ca. 2 x 10 5 Zellen, die MRC-5 - Zellen entsprechen , zu 80% Konfluenz in einer 60 mm - Gewebekulturplatte gezüchtet. Stellen Sie die Lautstärke von Perlen und Reagenzien entsprechend, wenn die Platten in verschiedenen Größen oder Zellen bei verschiedenen confluences verwenden. Verwenden Sie eine Menge an superparamagnetische Perlen um 2 Perlen pro Zelle zu haben. Daher 4 x 10 5 Perlen sind für eine 60 - mm - Platte benötigt. <ol><li> Gründlich resuspendieren die Perlen in der Originalflasche durch Verwirbelung mindestens 30 s. Aliquot wurden 40 ul der resuspendierten superparamagnetische Perlen (entsprechend 4 x 10 6 Kügelchen) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird auf einem magnetischen separatiauf dem Stand, um die magnetischen Beads von der Lösung zu trennen. Überstand verwerfen, entfernen Sie Schlauch aus dem magnetischen Trennung Stand und resuspendieren die Perlen in 1 ml 0,1 M Na-Phosphat, pH 7,4. <ol><li> Wiederholen Waschschritt zweimal mit 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7.4. </li></ol></li><li> Nach dem letzten Waschen, Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7.4. </li><li> Kombinieren von 100 &amp; mgr; g Rinder-Fibronectin (FN) oder jede andere Zelladhäsion Rezeptorliganden auf die 1 ml 0,1 M Na-Phosphat pH 7,4, der Perlen und mischen durch Pipettieren. </li><li> Wiederholen Sie vorherigen Schritte von FN oder jeder andere Ligand mit BSA, Poly-D-Lysin oder apo-Transferrin für negative Kontrollen zu ersetzen. </li><li> Optional für Gel-Analyse, nehmen Sie ein 10-ul-Aliquot der Ligandenlösung für die Analyse von Vernetzungseffizienz und mit einem geeigneten Volumen von konzentriertem Laemmli Probenpuffer mischen. </li><li> Inkubieren Kügelchen mit dem Ligand für 12-24 h bei 37 ° C an einem Rotor enthaltenden Lösung. </li><li> Wenn Wulst Aggregate erscheinen, nachdem die Reaktion stattgefunden hat, beschallen (Dauer 39 W Leistung) für nicht mehr als 10 bis 20 s. </li><li> Isolieren Sie die Perlen unter Verwendung von magnetischen Trennung Stand absaugen verbleibende Lösung und 1 mL PBS / 0,2% BSA, pH 7,6 Lösung. Inkubieren für 1 h auf den Rotor bei 37 ° C. </li><li> Waschen Perlen einen Magneten zweimal mit 1 ml PBS unter Verwendung von / 0,2% BSA, pH 7,6. Resuspendieren Kügelchen in 1 ml PBS / 0,2% BSA, pH 7,6. </li><li> Beschallen Perlen, wenn Aggregate erscheinen nicht mehr als 20 bis 30 s. </li><li> Kopplungseffizienz durch Western-Blot-Analyse (mischen mit einem geeigneten Volumen von konzentriertem Laemmli Probenpuffer) gegebenenfalls ein 10-ul-Aliquot entfernen. </li><li> Gehen Assays oder lagern Perlen für bis zu 1 Monat bei 4 ° C zu Zelle. </li><li> Optional eine SDS-PAGE-Gel und Flecken mit Coomassie-Blau laufen FN Vernetzungs an die magnetischen Kügelchen zu analysieren. </li></ol> 2. Anwendung von Zugkräften auf den Liganden-beschichteten Kügelchen gebunden zu Adhäsionsrezeptoren auf der dorsalenOberfläche von Zellen <ol><li> Kultur adhärenter Zellen auf 60 mm-Gewebekulturschale in geeigneten Wachstumsmedium (DMEM üblicherweise 4,5 g / L D-Glucose mit 10% FCS ergänzt), bis 80% Konfluenz zu erreichen. </li><li> Bereiten Sie nicht denaturierenden nichtionischen Lysepuffer (20 mM Tris - HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 0,1% NP-40) und Chill - Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pellet die Liganden-beschichteten Kügelchen aus dem Abschnitt 1.10 und Resuspendieren in 1 mL PBS / 0,2% BSA, pH 7,6. Füge 100 &amp; mgr; l des Liganden-beschichteten Kügelchen Lösung auf 5 ml warmem Kulturmedium und vortexen. </li><li> Absaugen Medium in 60 mm Kulturschale und mit 5 ml warmem Wachstumsmedium mit Perlen ergänzt. </li><li> Inkubieren für 20 min unter Zellkulturbedingungen (37 ° C und 5% CO 2) die Kügelchen zu ermöglichen , an die Zellen zu sedimentieren und anhaften. Es ist von entscheidender Bedeutung, um nicht mehr als 20 min nicht überschreiten, da Kügelchen können durch Phagozytose internalisiert werden. </li><li> Optional beachten Sie die Perlen unter einem Lichtmikroskop eine 10X oder 20X obje mitctive und überprüfen Sie die Perle Haftung durch leichtes Schütteln der Schale zwischen befestigt und schwimmenden Perlen zu unterscheiden. </li><li> Während der Kulturschale in den Inkubator zu halten, tauschen die normale Schalendeckel für einen Deckel mit einem runden 38 mm Neodym-Magnet auf der Oberseite angebracht. Der Magnet wird an Ort und Stelle durch zwei kleinere 13 mm Neodym-Magneten auf der Unterseite des Deckels positioniert gehalten. Da die Magnete sehr mächtig sind, manipulieren sie sorgfältig. </li><li> Inkubieren , um Spannung für die gewünschten Zeitpunkten an Zellkulturbedingungen unterworfen Zellen (37 &amp; deg ; C und 5% CO 2). </li><li> Nach der Behandlung legen Schüssel auf Eis und sorgfältig das gesamte Medium aus der Schale absaugen. </li><li> Hinzufügen 300 ul Zelllyse-Puffer und Inkubation für 10 min auf Eis. Sammeln Sie das Lysat einem Zellschaber und in ein vorgekühltes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit. </li><li> Pellet die magnetischen Kügelchen, die magnetische Trennung Stand und übertragen die gesamte Zelllysat auf eine neue Pre-Chill mited 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie diese Fraktion, die bei -20 ° C für die weitere Analyse. </li><li> Waschen der Kügelchen 3-mal mit 1 ml eiskaltem Lysepuffer. In 50 ul Laemmli Probenpuffer zu dem Wulst Pellet, mischen durch Pipettieren und kochen bei 95 ° C für 5 Minuten mit einem trockenen Blockheizung verwendet wird. Diese Fraktion enthält die isolierten Haftkomplexe. Gehen Sie zur biochemischen Analyse oder bei -20 ° C. </li><li> Von den insgesamt nach Perlen Trennung erhaltene Zelllysat (etwa 300 &amp; mgr; l), entfernen Sie ein 50-ul-Aliquot für Western-Blot-Analyse. HINWEIS: Die 250 &amp; mgr; l für weitere biochemische Untersuchungen eingesetzt werden gelassen wie Protein-Protein-Interaktionsstudien (Immunpräzipitation, GST-Pull-down-Assays) oder GTPase-Aktivität Experimente (Lysepuffer kann eine Umschaltung in Abhängigkeit von der GTPase von Interesse erforderlich sein). </li></ol>

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Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Das hier beschriebene Verfahren stellt einen einfachen Ansatz Spannung an Zelloberflächen Adhäsionsrezeptoren aufzutragen und ihre nachfolgende Reinigung ermöglichen. Jedoch sind einige Schritte kritische effiziente Haftung Reinigung und mögliche Optimierung ausführen kann in Abhängigkeit von den angestrebten Adhäsionsrezeptoren erfolgen. Wir präsentieren potenzielle Probleme der Benutzer unten auftreten können. Wir verwendeten 2,8 um Durchmesser magnetische Kügelchen, aber größere Kügelchen...

In Metazoen leitet mechanische Spannung Gewebeentwicklung und Homöostase durch die Regulierung einer Vielzahl von zellulären Prozessen, wie Proliferation, Differenzierung und das Überleben 1, 2. Mechanische Spannung kann von der extrazellulären Matrix entstehen oder durch anhaftenden Zellen erzeugt werden, die Probe ihre extrazelluläre Umgebung durch die Aktomyosin Kontraktions Maschinen, die auf extrazelluläre Matrix zieht und Sonden ihre Steifigkeit durch spannungsempfindliche Moleküle. Als Reaktion auf die Spannung, durchlaufen mechanosensitive Adhäsionsproteine ​​Konformationsänderungen, die komplexe Signalkaskaden auslösen. Wiederum orchestriert diese Signalwege eine mechanoresponse umfasst Proliferation, Differenzierung und das Überleben, die das Zellverhalten in die extrazelluläre Umgebung anpasst. Solche Verfahren können in einem kurzfristigen Zeitraum (Sekunden bis Minuten), um schnell füttern zurück auf die Schleife von Mecha abgerechnet<html> notransduction durch die mechanosensitive Strukturen zu verändern. Zum Beispiel verstärken Integrin-basierte Adhäsionen in Reaktion auf Spannung durch Rho - GTPase-vermittelten Zytoskelett - Remodeling 3, 4, 5. Parallel dazu werden andere Signalwege über Stunden und Tage aktiviert , um genetische Programme steuern , die schließlich Zellschicksal 6 auswirken. Während haben viele Studien die Wirkung der Matrix Steifigkeit auf Zelle Determinismus und die Entwicklung der Krankheit 1 hervorgehoben, 2, die genauen molekularen Mechanismen der Adhäsion vermittelten Mechanotransduktion bleiben immer noch schwer zu fassen. Verschiedene Ansätze wurden die Wirkungen von zell erzeugten Kräfte oder externe Kräfte , die auf das Zellverhalten, einschließlich Strömungssysteme zu untersuchen entwickelt, Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) -tension Sensoren 7,lass = &quot;xref&quot;&gt; 8 kompatible Substrate 9, magnetische Pinzette, optische Pinzette 10 und Rasterkraftmikroskopie (AFM) 11. Hier präsentieren wir ein Protokoll superparamagnetische Perlen mit auf Mechanotransduktion Wege in Reaktion auf Zugkräften Rezeptoren angewendet spezifische Adhäsion zu charakterisieren. Superparamagnetische Perlen sind Teilchen, die reversibel, wenn sie in ein Magnetfeld gebracht magnetisieren. Einmal beschichtet mit einem Liganden für einen spezifischen Rezeptor liefern diese Kügelchen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Effekte von extrazellulärem Kraftbeaufschlagung zu studieren. Diese Methode wurde von mehreren Studien validiert 3, 5, 12 - 17 und den Vorteil präsentieren weitgehend biochemische Analyse auf adhärente Zellen erleichtern. Unter Verwendung ähnlicher Kollagen-beschichteten magnetischen Kügelchen gefolgt von biochemischen Analyse, berichtet frühen Arbeiten eine Erhöhung derProtein - Tyrosin - Phosphorylierung und Aktivierung RhoA in Antwort auf Zug 5, 18, 19. Das nachfolgend beschriebene Verfahren wurde auch mit Fibronectin (FN) -beschichteten Kügelchen verwendet worden , um die Signalwege zu charakterisieren nachgeordnet Spannung angelegt an Integrine 3. In dieser Studie Guilluy et al. RhoA durch die Einstellung der beiden Guaninnucleotid- Austauschfaktoren (GEF), LARG und GEF-H1, an Integrin Adhäsionskomplexe zeigten, dass Spannung aktiviert. Da dass, haben andere Studien gezeigt , dass GEF-H1 zu Adhäsionskomplexe in Reaktion auf zell erzeugte Spannung eingestellt wird unter Verwendung von verschiedenen Verfahren 20, 21, demonstriert die Robustheit der Methodik beschrieben. Als Ergebnis wurde aktiviert RhoA gezeigt Haftverstärkung, durch Zytoskelett Remodellierung zu fördern. Dieses System wurde auch Spannung angelegt t verwendet, um zu erkundeno Zell / Zell-Adhäsion Rezeptoren. Anwendung von Kräften auf die magnetischen Kügelchen , beschichtet mit der extrazellulären Domäne von E-Cadherin einen Anstieg in Vinculin Einstellungs ähnlich Integrin assoziiert Adhäsionskomplexe induzierten 12. Collins und Kollegen beobachteten , dass die Anwendung von Spannung auf PECAM-1 fördert Integrin und RhoA Aktivierung 13. Ein weiterer experimenteller Ansatz unter Verwendung von magnetischen Kügelchen ist die Untersuchung der Spannung an isolierten Kernen angewendet. Mit Perlen , beschichtet mit Antikörpern gegen das Atom-Hüllprotein Nesprin-1 wurden Kernhülle Komplexe gereinigt zu zeigen , dass sie in Reaktion auf die mechanische Spannung 22 dynamisch geregelt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Mächtigkeit dieser Methode in der Studie von Mechanotransduktion Wege. Darüber hinaus, während eine Strömung oder Zugkraftsysteme allgemeine zelluläre Prozesse zu stimulieren, magnetische Kügelchen spezifisch eine Zelladhäsion Rezeptor gezielt entweder durch Rezeptor-Liganden 13, 15. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist die Isolierung von Haftkomplexen durch eine einfache Ligandenaffinitätsreinigungsverfahren. Es ist bekannt , dass die Zugabe von Liganden-beschichteten Kügelchen an Zellen Adhäsionsrezeptoren und induziert die Rekrutierung von verschiedenen Adhäsionsproteinen 23 bindet. Weitere Anwendung von Kräften auf Ligand-beschichteten magnetischen Kügelchen verwandelt sich diese Adhäsionskomplexe in molekularen Plattformen , die verschiedene Spannungs abhängige Signalwege 4, 24 vermittelt. Zellyse durch bead Konzentration gefolgt unter Verwendung eines Magneten erlaubt die Isolierung der Adhäsion Plattformen. Andere Verfahren verwendet Adhäsionskomplexe zu reinigen sind bereits in adhärenten Zellen verwendet. Sie kombinieren die chemische Vernetzung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zu konservierenund eine Zelllyse Schritt Waschmittel- und Scherströmung oder Beschallung 20, 21, 25, 26, 27, 28. Der letzte Schritt ist das Sammeln der resultierenden ventral Plasmamembranen, die Haftkomplexe enthält. Im Gegensatz zu diesen Verfahren lassen magnetische Kügelchen eine größere Reinigungsgrad der Zelladhäsion Komplexe durch gezielt eine bestimmte Familie von Adhäsion Rezeptoren abzielen. Die Magnetkügelchen wurden bereits verwendet worden Adhäsionskomplexe in nicht anhaftenden Zellen zu Ligand-beschichteten Mikrokügelchen 29, 30 angebracht zu reinigen. Das Verfahren unter ahmt biologische Situationen beschrieben, in denen Kraft für einen kurzen längeren Zeitraum (Sekunden bis Minuten) angewendet wird. Daher stellt sie ein leistungsfähiges Werkzeug für die molekulare Zusammensetzung von gereinigtem Adhäsionskomplexe Untersuchung unddie nachgeschalteten mechanosensitive-Signalwege. Hier präsentieren wir eine detaillierte experimentelle Protokoll für magnetische Kügelchen unter Verwendung von Zugkräften auf die Haftung Oberflächenproteine ​​anzuwenden. Ein Permanent Neodym-Magnet ist auf der Oberseite der Kulturschale Oberfläche gelegt. Die Polfläche des Magneten in einer Höhe von 6 mm angeordnet , so dass die Kraft , die auf einem einzelnen 2,8 um magnetische Perle konstant ist (etwa 30-40 pN) 31. Die Dauer der Stimulationsspannung wird durch den Bediener in Abhängigkeit von dem Molekül von Interesse und ihre Zeitskala der Aktivierung bestimmt. Die Zellen werden schließlich lysiert, Adhäsion Komplexe werden durch Sicken Trennung gereinigt unter Verwendung eines Magneten und biochemische Analysen verarbeitet. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von Ligand-beschichtete superparamagnetische Perlen, und die Anwendung von Spannung durch Magnet durch biochemische Analysen gefolgt. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, dass die Spannung an Integrin-basierte adh angewendet demonstrierenesions induziert Adhäsion Umbau und verändert Proteintyrosinphosphorylierung.

<table><tbody><tr><td>Neodym-Magnete (auf der Oberseite der 60-mm-Schüssel)</td><td>K& J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>Klasse N52 Abmessung: 1 1/2" Durchmesser x 1/2" dicke</td></tr><tr><td>Neodym-Magnete (auf der Unterseite der 60 mm Schüssel)</td><td>K& J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>Klasse N42 Abmessung: 1/2" Durchmesser x 1/4" dick Schwarzer Kunststoff beschichtet&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>superparamagnetische Kügelchen&nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>Fibronektin aus Rinderplasma</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>Rinder-Apo-Transferrin</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt, GlutaMAX-Ergänzung, Pyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>60*15 mm Kulturschale</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse zelloberflächenhaftung remodeling in reaktion auf mechanische spannung mit magnetic beads

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitiven Zelloberfläche Adhäsionskomplexe erlauben Zellen die mechanischen Eigenschaften ihrer Umgebung zu erfassen. Jüngste Studien haben beide Kraftmess Moleküle an Haftstellen und kraftabhängige Transkriptionsfaktoren identifiziert, die linienspezifische Genexpression regulieren und phänotypische Ausgänge gilt. Allerdings haben die Signalisierungsnetze Umwandlung mechanischer Spannung in biochemischen Wege blieb schwer zu fassen. Um die Signalwege erkunden bei einer mechanischen Spannung in Eingriff angewendet Zelloberflächenrezeptor, können superparamagnetische Mikrokügelchen verwendet werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für magnetische Kügelchen mit Kräften an Zelloberflächen Adhäsionsproteine ​​anzuwenden. Mit diesem Ansatz ist es möglich, nicht nur kraftabhängige Wege cytoplasmatischen Signal zu untersuchen, indem verschiedene biochemische Ansätze, sondern auch Remodeling Adhäsion durch magnetische Trennung von Haftkomplexen gebunden an den Liganden-beschichteten Kügelchen. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung von Ligand-coATED superparamagnetische Perlen, und die Anwendung von Zugkräften durch biochemische Analysen gefolgt definieren. Darüber hinaus bieten wir eine repräsentative Stichprobe von Daten, dass die Spannung an Integrin-basierte Haftung Haftung Umbau angewendet demonstriert löst und verändert Proteintyrosinphosphorylierung.

Die schematische Darstellung der Technik ist in 1a veranschaulicht. Folgende Liganden Konjugation werden magnetische Perlen für 20 min mit Zellen inkubiert, und dann wird ein Permanentmagnet verwendet, um Zugkräfte von etwa 30-40 pN für verschiedene Zeitdauer anzuwenden. Abbildung 1b zeigt 2,8 um FN-beschichteten magnetischen Kügelchen gebunden zu MRC5- Zelladhäsionsrezeptoren. Die Waschschritte der superparamagnetischen Perlen nach der Zelllyse sind entsche...

Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die biochemischen Signalwege zu untersuchen, die als Reaktion auf mechanische Spannung aktiviert werden, indem ligandenbeschichtete magnetische Mikroperlen verwendet und zwangsweise an Adhärenzrezeptoren angeheftet werden. Diese Methode kann dazu beitragen, offene Fragen im Bereich der Mechanotransduktion zu klären, beispielsweise wie mechanische Spannung durch die exprimierten Helometriken die Differenzierung beeinflusst oder wie die Gewebekompliance ihre Umwandlung steuert. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass viele Zellen gleichzeitig für die chemische Analyse stimuliert werden können, indem mit Hilfe der Perlen gezielt mechanische Spannung auf eine bestimmte Untergruppe von Adhärenzrezeptoren ausgeübt wird.Als Erstes die superparamagnetischen tosylaktivierten Perlen im Originalfläschchen mindestens 30 Sekunden lang durch Vortexen gründlich resuspendieren. 40 Mikroliter der resuspendierten superparamagnetischen Perlen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren, das ein Milliliter 0,1-molarer Natriumphosphatpuffer mit pH 7,4 enthält. Danach das Röhrchen auf einen Magnetseparator stellen

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Forschung

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Biologie

In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von magnetischen Pinzette, um die Wirkung von Gewalt auf enzymatische Proteolyse auf der Ebene einzelner Moleküle in einem hoch parallelisierbaren Weise zu studieren.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

Die mechanischen Eigenschaften von Endothelzellen Glykokalyx wurden durch Einrückung mit Mikrometer große Kugeln auf AFM Cantilever gemessen. Endothelzellen wurden in einem benutzerdefinierten Kammer unter physiologischen Bedingungen kultiviert, um die Strömung Glykocalix Expression zu induzieren. Daten wurden unter Verwendung eines Dünnfilm-Modell, um die Dicke und Elastizitätsmodul Glykocalix bestimmen.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Magnetische Pinzette, ein leistungsfähiges Einzelmolekül-Manipulation Technik kann für die direkte Messung der Verdrehung angepasst werden (unter Verwendung einer Konfiguration mit der Bezeichnung frei umlaufenden magnetischen Pinzette) und Drehmoment (mit einer Konfigurations bezeichnet magnetischen Drehmoment Pinzette) in biologischen Makromolekülen. Richtlinien zur Durchführung solcher Messungen gegeben sind, einschließlich Anwendungen auf die Untersuchung von DNA und zugehörige...

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Hier präsentieren wir eine einfache, schnelle Methode zur Charakterisierung der intrinsischen Adhäsionseigenschaften von mutmaßlichen Zelladhäsionsmolekülen.  Die sezernierte, mit Epitopen markierte Ektodomäne eines Zelladhäsionsmoleküls wird aus dem Kulturmedium auf kleinen, einheitlich funktionalisierten Kügelchen eingefangen.  Diese Kügelchen können dann sofort in einfachen Bead-Aggregations-Assays verwendet werden.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Traditionelle Techniken zur Herstellung Polyacrylamid (PA)-Gelen, die fluoreszierenden Sonden beinhalten, zwischen denen ein Gel zwischen einem haftenden Oberfläche und einem Glasträger. Hier zeigen wir, dass die Beschichtung diese Folie mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierende Sonden lokalisiert die Sonden innerhalb von 1,6 um von der Geloberfläche.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

TGT surface ist eine innovative Plattform zur Untersuchung von Wachstumsfaktor-Integrin-Crosstalk. Das flexible Sondendesign, die Spezifität des Adhäsionsliganden und die präzise Modulation der Stimulationsbedingungen ermöglichen robuste quantitative Bewertungen des EGFR-Integrin-Zusammenspiels. Die Ergebnisse unterstreichen EGFR als "Mechano-Organizer", der die Integrin-Mechanik abstimmt und die fokale Adhäsionsmontage und Zellausbreitung beeinflusst.

Zugspannungsmessstreifen zur Quantifizierung von Wachstumsfaktor-vermittelter Integrinmechanik und Adhäsion

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Erfahren Sie die Analyse von Zelloberflächenhaftung unter mechanischer Spannung mit magnetischen Mikroperlen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung biochemischer Signalwege in der Mechanotransduktion.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

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