Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die biochemischen Signalwege zu erforschen, die als Reaktion auf Spannung mit Hilfe von ligandenbeschichteten magnetischen Mikrokügelchen und erzwungener Anwendung auf Adhäsionsrezeptoren aktiviert werden. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der mechanischen Transaktionen zu beantworten, z. B. wie die mechanische Spannung der Express-Helometrie sie von der Differenzierung abhält oder wie die Gewebenachgiebigkeit ihre Transformation antreibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass viele Zellen für die chemische Analyse stimuliert werden können, indem mit Hilfe von Kügelchen Spannung auf eine bestimmte Untergruppe von Adhäsionsrezeptoren ausgeübt wird.

Zu Beginn resuspendieren Sie die superparamagnetischen tosylaktivierten Kügelchen in der Originalphiole gründlich, indem Sie sie mindestens 30 Sekunden lang vortexen. Aliquotieren Sie 40 Mikroliter der resuspendierten superparamagnetischen Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter 0,1 molares Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,4 enthält. Legen Sie anschließend das Röhrchen auf einen magnetischen Trennständer, um die magnetischen Kügelchen von der Lösung zu trennen.

Entsorgen Sie den Überstand und nehmen Sie das Rohr vom magnetischen Trennständer. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter 0,1 molares Natriumphosphat, pH 7,4. Nachdem Sie die Kügelchen zweimal gewaschen haben, resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter desselben Puffers.

Kombinieren Sie dann 100 Mikrogramm Rinderfibronektin oder einen anderen Zelladhäsionsrezeptor-Liganden mit den Kügelchen und dem Wirbel. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie den Liganden durch BSA, Poly-D-Lysin oder Apotransferrin für Negativkontrollen ersetzen. Inkubieren Sie die Kügelchen mit der ligandenhaltigen Lösung für 12 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius auf einem Rotor.

Wenn nach der Reaktion Kügelchenaggregate auftreten, nicht länger als 10 bis 20 Sekunden beschallen. Isolieren Sie anschließend die Kügelchen mit einem magnetischen Trennständer und saugen Sie die restliche Lösung an. Fügen Sie dann einen Milliliter einer PBS-Lösung hinzu, die mit 0,2 % Rinderserumalbumin ergänzt ist.

Stunde lang auf einem Rotor bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Kügelchen mit einem Magneten zweimal mit einem Milliliter PBS-Lösung, die mit 0,2 % Rinderserumalbumin zugesetzt ist. Bevor sie in einem Milliliter desselben Puffers wieder suspendiert werden.

Beschallen Sie die Kügelchen, wenn Aggregate nicht länger als 20 bis 30 Sekunden auftreten. Fahren Sie mit den Zellassays fort oder lagern Sie die Kügelchen bis zu einem Monat lang bei vier Grad Celsius. Adhärente Zellen auf einer 60-Milliliter-Gewebekulturschale in geeignetem Wachstumsmedium kultivieren, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.

Nach dem Pelletieren der mit Liganden überzogenen Kügelchen wird das Pellet in einem Milliliter PBS-Lösung, die mit 0,2 % Rinderserumalbumin ergänzt wird, resuspendiert. Geben Sie 100 Mikroliter der ligandenbeschichteten Bead-Lösung zu fünf Millilitern warmem Kulturmedium und Vortex. Als nächstes aspirieren Sie das Medium in einer 60-Milliliter-Kulturschale und fügen fünf Milliliter warmes Wachstumsmedium hinzu, das mit Kügelchen ergänzt wird.

Inkubieren Sie die Suspension 20 Minuten lang unter Zellkulturbedingungen, damit die Kügelchen sedimentieren und an den Zellen haften können. Es ist wichtig, 20 Minuten nicht zu überschreiten, da die Kügelchen durch Phagozytose internalisiert werden können. Beobachten Sie anschließend die Kügelchen unter einem Lichtmikroskop mit einem 10X- oder 20X-Objektiv.

Überprüfen Sie die Raupenhaftung, indem Sie die Schale leicht schütteln, um zwischen anhaftenden und schwimmenden Perlen zu unterscheiden. Setzen Sie einen runden 38-Millimeter-Neodym-Magneten auf die Oberseite eines normalen 60-Millimeter-Kulturschalendeckels und halten Sie ihn mit zwei kleineren 13-Millimeter-Neodym-Magneten, die an der Unterseite des Deckels positioniert sind, an Ort und Stelle. Inkubieren Sie die Zellen unter Spannung für die gewünschten Zeitpunkte und Zellkulturbedingungen.

Tauschen Sie den normalen Schalendeckel gegen einen Deckel mit Magnet aus. Da die Magnete sehr stark sind, manipulieren Sie sie vorsichtig. Stellen Sie die Schale nach der Behandlung auf Eis und saugen Sie vorsichtig das gesamte Medium aus der Schale ab.

300 Mikroliter Zelllysepuffer zugeben und 10 Minuten auf Eis inkubieren. Sammeln Sie dann das Lysat mit einem Zellschaber und geben Sie es in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die magnetischen Kügelchen mit dem magnetischen Trennständer und übertragen Sie das gesamte Zelllysat in ein neues, vorgekühltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Entfernen Sie ein 15-Mikroliter-Aliquot aus dem Gesamtzelllysat, das nach der Bead-Trennung für die Western-Blot-Analyse erhalten wurde. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer. Geben Sie dann 50 Mikroliter Probenpuffer in das Bead-Pellet

Nachdem Sie die Suspension durch Vortexen gemischt haben, kochen Sie sie fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius mit einem Trockenblockheizer. Diese Fraktion enthält die isolierten Adhäsionskomplexe. Fahren Sie mit der biochemischen Analyse fort oder lagern Sie die Fraktion bei minus 20 Grad Celsius.

Diese Abbildung ist dargestellt, um die Reinigung der Adhäsionskomplexe zu demonstrieren. Das GAPDH-Immunblotting wird zur Beladungskontrolle des Gesamtzelllysats und zur Überprüfung der Reinheit der Adhäsionskomplexe eingesetzt. Eine lange Belichtung wurde verwendet, um das Fehlen eines zytoplasmatischen Signals in der gereinigten Adhäsionskomplexfraktion zu validieren.

Mit Hilfe von Fibronektin-beschichteten Kügelchen wurden die Mechano-Transduktionsprozesse untersucht, die im Laufe der Zeit an den Adhäsionskomplexen als Reaktion auf Spannung ablaufen. Nach magnetischer Trennung der Adhäsionskomplexfraktion wurden das Lysat und die Adhäsionskomplexfraktion mittels Western Blot analysiert. Die Belastungskontrolle und Kandidaten, von denen bekannt ist, dass sie als Reaktion auf mechanischen Druck an Adhäsionskomplexen rekrutiert oder phosphoryliert werden, wurden immunblottiert.

Während die Spannung die Paxillin-Rekrutierung an die Adhäsionskomplexe nicht beeinflusste, war seine Phosphorylierung an Tyrosin 31 als Reaktion auf die mechanische Spannung sowohl im Gesamtzelllysat als auch in der Adhäsionskomplexfraktion verstärkt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit magnetischen Kügelchen Zugkräfte auf Adhäsionsoberflächenproteine aufbringt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, mit den starken Magneten vorsichtig zu sein. Im Anschluss an dieses Verfahren können biochemische Untersuchungen wie Western Blots, Aktin-Polymerisationsassays oder enzymatische Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Kinaseaktivität durch Spannung reguliert wird. Diese Technik kann Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie helfen, magnetisch empfindliche Signalwege in Zellen zu erforschen.