Messung und Modellierung Kontraktile Trocknung im Bereich Human Stratum corneum
1. März 2017
in der Ebene räumlich aufgelösten Trocknungs Verschiebungen von kreisförmigen Gewebeproben geklebt auf ein Elastomersubstrat Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur dynamischen Trocknungsverhalten und die mechanischen Eigenschaften des Stratum corneum Quantifizierung durch Messung. Diese Technik kann verwendet werden, um zu messen, wie verschiedene chemische Behandlungen Trocknen und Gewebe mechanischen Eigenschaften verändern.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die dynamisch-mechanische Steifigkeit und den Aufbau von Trocknungsspannungen in ex vivo-Proben des menschlichen Stratum corneum nach verschiedenen chemischen Behandlungen zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Biomechanik und Kosmetik zu beantworten, wie z.B. wie die Zusammensetzung des Stratum corneum oder die Behandlung des Hautgewebes mit Körperpflegeprodukten die mechanischen Eigenschaften und das dynamische Trocknungsverhalten beeinflussen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnellere Alternative zu anderen mechanischen Bewertungsmethoden bietet, deutlich weniger Hautgewebe benötigt und eine physiologisch relevantere Trocknung ermöglicht, indem sie die Verdunstung von der Probenunterseite verhindert.
Zur Herstellung von elastomerbeschichteten Deckgläsern wird zunächst das Härter Sylgard 184 mit Grundfeststoffen in einem Verhältnis von Basis zu Härter von 55 zu eins hergestellt, bis es homogen ist. Insgesamt werden sechs Gramm benötigt. Entgasen Sie anschließend die Lösung.
Verwenden Sie dann die Lösung, um die Deckgläser auf einem Schleuderlacker zu beschichten. Mit einer Pipette mit breitem Durchgang einen Milliliter der Mischung mittig auf ein Deckglas tropfen. Dann den Deckglas 60 Sekunden lang bei 2.000 U/min schleudern.
Stellen Sie auf diese Weise fünf oder sechs gestrichene Deckgläser her. Um die Deckgläser auszuhärten, bewahren Sie sie 12 Stunden lang in einem 60 Grad Celsius heißen Ofen auf. Messen Sie am nächsten Tag die Dicke der Elastomerfilme.
Heben Sie mit einer Rasierklinge eine Kante der Elastomerfolie vom Deckglas ab. Markieren Sie dann mit einem unauslöschlichen Marker die Oberseite der Elastomerfolie und markieren Sie darunter das behandelte Deckglas. Messen Sie nun mit einem inversen Mikroskop die Z-Höhe zwischen den Brennebenen der Markierungen, um die Schichtdicken zu messen.
Befolgen Sie die Standardverfahren zur Vorbereitung des SC-Gewebes. Um Proben zu machen, nehmen Sie Stempel mit einem Durchmesser von sechs Millimetern aus dem SC. Platzieren Sie auf den Proben mit einem unauslöschlichen Marker eine Markierung in der Mitte der äußersten Fläche. Als nächstes lagern Sie fluoreszierende Markerkügelchen auf der SC-Oberfläche ab, indem Sie die Proben in 15 Milliliter Wasser schwimmen lassen, das etwa 90 Mikroliter Bead-Konzentrat enthält.
Rühren Sie 30 Minuten lang sanft und passen Sie die Bead-Konzentration nach Bedarf an. Tauchen Sie nach der Behandlung jede Probe in Wasser, um sie auf das Elastomer zu montieren. Positionieren Sie ein beschichtetes Deckglas in einem flachen Winkel von 15 bis 30 Grad unter dem SC, wobei das Elastomer zur Unterseite des SC zeigt. Heben Sie dann das Deckglas mit dem oben angebrachten SC aus dem Wasser und laminieren Sie so die SC-Probe reibungslos und ohne Falten oder Lufteinschlüsse.
Anschließend trocknen Sie die montierten Proben etwa eine Stunde lang bei Umgebungsbedingungen. Nach dem Trocknen werden die Proben in eine hermetisch verschlossene Kammer mit einer Schale mit Wasser gebracht. Lassen Sie die Proben 24 Stunden lang an die Feuchtigkeit anpassen.
Am nächsten Tag legen Sie eine Probe für eine längere Bildgebung in eine Perfusionskammer. Legen Sie die Perfusionskammer über das Substrat und versiegeln Sie die Ränder der Perfusionskammer mit Vakuumfett zum Elastomer. Nehmen Sie dann Fluoreszenz- und Durchlichtbilder mit einem Sichtfeld auf, das groß genug ist, um die gesamte SC-Probe zu erfassen.
Nehmen Sie in den nächsten 16 Stunden alle 10 Minuten ein Bild auf. Befüllen Sie in einen chemischen Abzug eine kleine Plastikkappe mit einem Milliliter Silan. Übertragen Sie den Deckel in einen verschlossenen Behälter mit einem mit Elastomer ausgekleideten Deckglas, der nicht in direktem Kontakt steht.
Lassen Sie sie fünf Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Wartezeit 20 Milliliter Bead-Lösung gemäß dem Textprotokoll zubereiten und dann in eine 10 Zentimeter große Schale gießen. Nach fünf Stunden legen Sie die silanierten Substrate langsam mit der Elastomerseite nach unten in die Raupenlösung.
Legen Sie zwei Substrate in jede Schale und lassen Sie die Substrate 45 Minuten lang mit den Kügelchen reagieren. Entfernen Sie später mit einer Pinzette die Substrate und spülen Sie sie in destilliertem Wasser ab, um die ungebundenen Kügelchen zu entfernen. Trocknen Sie sie dann unter einem sanften Druckluftstrahl und bewahren Sie sie in einer verschlossenen, undurchsichtigen Box auf.
Mit der zuvor beschriebenen Technik werden die SC-Proben in einem Wasserbad auf ein behandeltes Substrat übertragen. Tragen Sie unmittelbar nach der Montage des SC einen fünf Mikroliter unverdünnten Tropfen fluoreszierender Markerperlenlösung darauf auf. Dann den SC 60 Minuten trocknen lassen.
Messen Sie nun die SC-Dicke mit dem Mikroskop mit einer 40x subjektiven Linse in einer Perfusionskammer. Messen Sie die Dicke von SC im Laufe der Zeit, indem Sie ein Fernfokuszubehör verwenden, um den Unterschied in der Z-Höhe zwischen den beiden Raupenschichten aufzuzeichnen. Eine Schicht befindet sich an der SC-Substratschnittstelle und die andere auf dem SC. Unter Verwendung der beschriebenen Techniken wurde eine SC-Probe präpariert und mit fluoreszierenden Kügelchen beschichtet.
Nach 16 Stunden Trocknung bei 25 % relativer Luftfeuchtigkeit wurden die Verschiebungen gemessen. Aufgrund der zirkulären Symmetrie der Proben wurden diese Verschiebungen azimutal gemittelt. Während der gesamten Trocknung bleiben die azimutalen Verschiebungen gering.
Radiale Verschiebungsprofile nahmen jedoch monoton von der Mitte zum Rand zu und nahmen an Größe zu, bis ein Gleichgewicht erreicht war. Profile, die in 30-Minuten-Intervallen aufgezeichnet werden, zeigen die zeitliche Entwicklung von Verschiebungen in der Ebene. Die durchschnittliche SC-Dicke nahm während der Trocknung ab, vor allem in den ersten zwei Stunden.
Die Trocknungsdynamik wurde dann analysiert, indem die Verschiebungsprofile an ein lineares, elastisches Kontraktilitätsmodell angepasst wurden, wobei ein Ansatz der kleinsten Quadrate verwendet wurde. Aus dem Modell wurde die vertragliche Trocknungsspannung sowie der Elastizitätsmodul extrahiert. Beide Parameter stiegen in den ersten zwei Stunden der Trocknung rapide an.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Proben vollständig auf das Substrat zu kleben. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Lipidfärbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie bestimmte kosmetische Behandlungen die Lipidzusammensetzung des Gewebes verändern.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung der dynamischen mechanischen Steifigkeit und des Trocknungsverhaltens des menschlichen Stratum corneum beschrieben. Durch die Messung der in-ebenen Trocknungsverschiebungen von Gewebeproben auf einem Elastomer-Substrat bewertet die Technik, wie chemische Behandlungen die Gewebeeigenschaften beeinflussen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biomechanik
- Kosmetikwissenschaft
Hintergrund
- Das Verständnis der mechanischen Eigenschaften des Stratum corneum ist entscheidend für Anwendungen in der Hautbehandlung.
- Aktuelle Methoden benötigen möglicherweise mehr Gewebe oder Zeit, als wünschenswert ist.
- Das dynamische Trocknungsverhalten kann die Wirksamkeit von Körperpflegeprodukten beeinflussen.
Zweck der Studie
- Bestimmung der Trocknungsspannungen und mechanischen Steifigkeit in ex vivo Hautproben.
- Beurteilung des Einflusses verschiedener chemischer Behandlungen auf die Hauteigenschaften.
- Vorstellung einer schnellen Alternative zu bestehenden Methoden zur mechanischen Charakterisierung.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Elastomer-beschichteten Deckgläsern unter Verwendung von Sylgard 184.
- Messung räumlich aufgelöster Trocknungsverschiebungen.
- Bewertung der mechanischen Eigenschaften nach der Behandlung.
- Verhinderung der Verdunstung von der Unterseite der Probe für physiologische Relevanz.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine schnelle Beurteilung der mechanischen Eigenschaften der Haut.
- Unterschiedliche chemische Behandlungen verändern das Trocknungsverhalten signifikant.
- Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wird weniger Gewebe benötigt.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik verbessert das Verständnis der Hautbiomechanik.
- Sie liefert Erkenntnisse über die Wirkung kosmetischer Produkte auf die Haut.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Produktformulierung und Wirksamkeit verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine schnelle, physiologisch relevante Beurteilung der mechanischen Eigenschaften der Stratum corneum unter Trocknungsbedingungen und unterstützt die Bewertung kosmetischer und pflegender Formulierungen in frühen Entwicklungsstadien. Durch die Quantifizierung dynamischer Veränderungen der Trocknungsspannung und des Elastizitätsmoduls liefert sie vorhersagende Erkenntnisse über die Barrierefunktion und die Gewebeelastizität und hilft so bei Entscheidungen über die Weiterentwicklung von Produkten. Der hochdurchsatzfähige Ansatz mit geringem Gewebebedarf verbessert die Effizienz von Screening-Verfahren und verringert die Abhängigkeit von traditionellen mechanischen Tests.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht, wie kosmetische Behandlungen die biomechanischen Eigenschaften des Stratum corneum verändern, und unterstützt die Überprüfung mechanistischer Hypothesen.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine schnelle Untersuchung der Formulierungseffekte auf die Gewebesteifigkeit und Trocknungsbelastung bei minimalem Probenverbrauch.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, ortsauflösende Verschiebungsprofile, die mit mechanischen Eigenschaftsänderungen während des Trocknungsprozesses korrelieren.
- Operativer Wert: Standardisiert die Probenvorbereitung und Messung mittels elastomerfixierter kreisförmiger Stanzen und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen Behandlungsgruppen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet formulierte bedingte Veränderungen im Trocknungsverhalten mit der Barriereintegrität und unterstützt so die translative Relevanz für Hautgesundheitsparameter.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine kontinuierliche Erfassung der mechanischen Entwicklung über 16-stündige Trocknungszyklen hinweg und damit die zeitlich aufgelöste Wirksamkeitsbewertung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen der Einfluss der Formulierung auf die Biomechanik der Haut vor der Optimierung des Leitwirkstoffs bewertet wird, und schafft so eine Brücke zwischen molekularem Screening und der funktionellen Gewebebewertung.
- Entdeckungsforschung: Unterstützt die Hypothesenprüfung dazu, wie Körperpflegeprodukte die Mechanik des Stratum corneum und die Ansammlung trockenheitsbedingter Spannungen beeinflussen.
- Screening: Bietet standardisierte, einsatzbereite Gewebe-Elastomer-Konstrukte für den Vergleich unter mehreren Bedingungen bei Formulierungs-Screenings.
- Analytik: Ermittelt Trocknungsspannungen und elastisches Modul aus angepassten Verschiebungsprofilen und ermöglicht so einen quantitativen Vergleich der Behandlungseffekte über die Zeit.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanische Trocknungsdynamiken mit der Barrierefunktion und liefert damit Hinweise auf die präklinische Relevanz kosmetischer Interventionen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung unterschiedlicher kosmetischer Wirkstoffe, Feuchtigkeitsmittel und Reinigungsmittel unter kontrollierten Trocknungsbedingungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuverlässigkeit hinsichtlich der Auswirkungen von Formulierungen auf die mechanische Belastbarkeit von Gewebe und das trocknungsbedingte Barrierverhalten.
- Operationaler Wert: Hohe Durchsatzrate, geringer Gewebeverbrauch und Vermeidung von Verdunstungsartefakten erhöhen die Zuverlässigkeit und Skalierbarkeit des Assays.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die frühzeitige Risikominimierung von Formulierungskandidaten, indem solche identifiziert werden, die die trocknungsbedingte mechanische Belastung verschärfen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung kosmetischer Inhaltsstoffe basierend auf ihrer biomechanischen Verträglichkeit mit dem Stratum corneum.
Durchführungsüberlegungen
- Expertise in der biomechanischen Modellierung und Bildanalyse zur Verfolgung von Verschiebungen und zum Anpassen von Modellen.
- Zugang zu Spin-Coatern, Perfusionskammern und Umweltkontrollsystemen für die feuchtegeregelt Trocknung.
- Standardisierung von Protokollen zum Stanzen von Geweben, Markieren mit Mikroperlen und Beschichten mit Elastomeren über verschiedene Anwender hinweg.
- Überlegungen zur Anpassung an unterschiedliche Gewebestärken oder Substratsteifigkeiten, wenn die Methode über die menschliche Hornschicht hinaus angewendet wird.
- Praktische Einschränkung: Die Methode setzt ein linear-elastisches Verhalten und rotationssymmetrische Geometrie voraus, was bei pathologischen oder stark veränderten Gewebeszuständen nicht zutreffen mag.
