Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine dynamische, mikrofluidikbasierte Co-Kulturplattform zu schaffen, um die intraperitoneale Umgebung mit den zellulären und mechanischen Komponenten zu emulieren, in denen die Metastasierung von Eierstockkrebs auftritt. Durch die Verwendung dieses Mikros für diese Plattform hilft es, die Schlüsselfragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, wie z. B. die Mikroumgebung der peritonealen Dissemination. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine 3D-Co-Kultur unter präzise kontrolliertem freiem Fluss die in vivo Kommunikation zwischen Eierstockkrebszellen und Methothedienzellen, die in einer Bauchhöhle stattfindet, besser nachahmt.

Nachdem Sie das mikrofluidische Kanalmuster entworfen, gezeichnet und gemäß dem Textprotokoll hergestellt haben, wird eine Schicht SU82075 Photoresist mit einer Schleuderdrehzahl von 1800 U/min auf den Silikonwafer geschleudert. Backen Sie den Photoresist-beschichteten Wafer direkt auf einer heißen Platte bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten. Und dann 25 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um überschüssiges Lösungsmittel zu entfernen.

Schleudern Sie eine zweite Schicht SU82075 Photoresist auf den Wafer, um eine endgültige Dicke von 250 Mikrometern zu erreichen. Legen Sie den mit Photoresist beschichteten Wafer sieben Minuten lang bei 65 Grad Celsius und dann 30 Minuten lang bei 95 Grad Celsius direkt auf eine Heizplatte, bevor Sie den Wafer langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Richten Sie als Nächstes die Fotomaske aus und legen Sie sie direkt auf den Wafer.

Setzen Sie es dann 20 Sekunden lang UV-Licht aus, um das Muster quer zu verlängern. Auf einer heißen Platte den beschichteten Wafer fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius und 12 Minuten bei 95 Grad Celsius backen, um das Lösungsmittel für die Vorlimerisierung zu entfernen. Entfernen Sie den nicht quer verlängerten Fotolack, indem Sie den Wafer 25 Minuten lang in einen SU8-Entwickler eintauchen.

Spülen Sie dann den Wafer mit Isopropanal ab und trocknen Sie ihn mit Druckluft. Kombinieren Sie die Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Base und das Härter in einem Massenverhältnis von 10 zu eins und verwenden Sie den Zentrifugalmischer unter der Misch- und Entgasungsfunktion, um die Lösung zu mischen. Gießen Sie die PDMS-Mischung langsam bis zu einer Höhe von etwa fünf Millimetern auf den Wafer.

Entgasen Sie das PDMS 40 Minuten lang in einem Vakuumexsikkator. Anschließend härten Sie das PDMS im Backofen bei 65 Grad Celsius für zwei Stunden aus. Ziehen Sie die PDMS-Platte vorsichtig vom Master ab und schneiden Sie das PDMS entlang der Kanäle ab, bis es die Größe eines Objektträgers hat.

Stanzen Sie dann mit einem Ein-Millimeter-Biopsiestempel das PDMS, um die Ein- und Ausgänge des Geräts zu erstellen. Reinigen Sie die PDMS-Oberfläche mit Druckluft und entfernen Sie dann mit Klebeband den Staub und PDMS-Schmutz. Legen Sie nun die PDMS-Platte mit der Kanalseite nach oben in einen Plasmareiniger.

Positionieren Sie dann einen sauberen Glasobjektträger neben der PDMS-Platte in den Plasmareiniger. Behandeln Sie das PDMS und den Objektträger eine Minute lang unter Luftplasma bei hoher Hochfrequenz oder HF-Pegel. Nachdem Sie die Proben aus dem Plasmareiniger entnommen haben, binden Sie das PDMS an den Objektträger, um eine irreversible kovalente Bindung zu erzeugen.

Legen Sie den PDMS-Chip eine Stunde lang auf eine heiße Platte bei 150 Grad Celsius, um die Haftfestigkeit zu erhöhen und die Hydrophobie des PDMS vor der Verwendung wiederherzustellen. Um mikrofluidische Kanäle mit Fibronektin zu beschichten, verwenden Sie zunächst 30 Mikroliter 75%iges Ethanol, um die Kanäle zu sterilisieren. Entfernen Sie das Ethanol und verwenden Sie PBS, um die Kanäle zweimal zu spülen.

Saugen Sie dann das PBS gründlich aus den Kanälen an. Bereiten Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektinlösung in einem serumfreien M199MCDB105 Medium mit 30 Mikrolitern der Lösung vor, füllen Sie die Kanäle langsam und verschließen Sie sie mit Klebeband. Anschließend wird der Chip über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.

Um primäre Peritonealmesochelzellen oder HPMCs in die mikrofluidischen Kanäle zu säen, verwenden Sie nach dem Spülen der kultivierten Zellen gemäß dem Textprotokoll zwei Milliliter 10%iges FBS-Kulturmedium, um die HPMCs wieder zu suspendieren. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Zellen und stellen Sie die Zellkonzentration auf 3,5 mal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter ein. Erwärmen Sie den mit Fibronektin beschichteten Mikrofluidik-Chip vor der Verwendung fünf Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Aspirieren Sie dann die Fibronektinlösung vollständig und pipettieren Sie langsam 30 Mikroliter HPMC-Suspension in jeden Kanal. Verschließen Sie die Kanäle mit Klebeband und stellen Sie das Gerät über Nacht in den CO2-Inkubator. Um die Bildung von Sphäroiden bei Eierstockkrebs zu induzieren, lösen Sie 0,5 % Agarose in sterilisiertem Wasser auf.

Geben Sie 50 Mikroliter der Agaroselösung in die Vertiefungen mit 96 Vertiefungsplatten. Nach dem Zählen zuvor kultivierter humaner Epithelkrebszellen werden die Zellen in 5%FBS-Kulturmedium bei einer Dichte von 5.000 Zellen pro Milliliter erneut suspendiert. Übertragen Sie 200 Mikroliter Zellsuspension in jede mit Agarose beschichtete Vertiefung.

Und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 für 48 Stunden. Übertragen Sie die Krebs-Sphäroide in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit einem Milliliter serumfreiem Medium vorbenetzt ist, und schleudern Sie die Sphäroide fünf Minuten lang bei 750-fachem G herunter. Nach der Zubereitung von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter CMFDA-Lösung in serumfreiem M199MCDB105 Medium.

Suspendieren Sie die Krebs-Sphäroide wieder in einem Milliliter der Lösung und inkubieren Sie die Sphäroide 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie dann die Sphäroidzahl und stellen Sie die Konzentration mit serumfreiem Medium auf 2.000 Sphäroide pro Milliliter ein. Injizieren Sie vor dem Aufladen der Sphäroide langsam 100 Mikroliter serumfreies M199MCDB105 Medium, um die nicht anhaftenden Mesotheliozellen in den Kanälen wegzuspülen.

Laden Sie 30 Mikroliter fluoreszenzmarkierte Sphäroidsuspension in jeden Kanal. Legen Sie dann den mikrofluidischen Chip in den CO2-Inkubator. Bauen Sie eine Profusionsplattform zusammen, indem Sie eine Spritze mit frischem serumfreiem M199MCDB105 Medium an einem einen Meter langen Schlauch befestigen.

Setzen Sie die Spritze auf die Spritzenpumpe und befestigen Sie den Kolben und den Spritzenkörper. Installieren Sie dann die Spritzenpumpe in horizontaler Position auf der gleichen Höhe wie der Mikrofluidik-Chip im Inkubator. Gießen Sie das gesamte Rohr schnell mit Medium, indem Sie die Schnellvorlauftaste gedrückt halten, bis das Medium im Schlauch überläuft.

Führen Sie dann die Injektion mit der gewünschten Durchflussmenge durch. Verbinden Sie den Schlauch gemäß dem Textprotokoll mit dem Einlass des Kanals. Verwenden Sie dann ein Rohr mit kurzem Ausgang, um den Auslass des Kanals mit einem konischen 50-Milliliter-Rohr zu verbinden, um das Ausströmmedium aufzufangen.

Verwenden Sie schließlich ein Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskop, um die HPMCs und Krebs-Sphäroide zu beobachten. Unter Verwendung der in diesem Video beschriebenen mikrofluidischen Plattform wurden Eierstockkrebs-Sphäroide mit Mesothelzellen unter hydrodynamischen Bedingungen modelliert. Wie in dieser Abbildung gezeigt, bildeten mesotheliale Zellen, die 16 Stunden lang in dem Mikrogerät kultiviert wurden, erfolgreich eine Monoschicht aus HPMCs.

In diesem Experiment wurden mehrzellige Sphäroide mit Durchmessern von etwa 100 Mikrometern, die in ihrer Größe denen in Patientengesellschaften ähneln, mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff CMFDA markiert. Die Sphäroide wurden dann in HPMC-beschichtete mikrofluidische Kanäle überführt und blieben in Suspension, und die Zellmorphologien wurden eingefangen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in mehreren Stunden über drei Tage durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei einem von 10 bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Einbringen von Luftblasen in die mikrofluidischen Kanäle zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. medikamentöse Behandlung, Adhäsionsassays und Mesothelie-Clearance-Assays, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Wirkung der introperitonealen Mikroumgebung auf das Fortschreiten der Krebserkrankung. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Krebsbiologie den Weg, die Peritonealmestase beim Menschen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Peritoneal-Mikrogerät mit fluidischem Fluss erzeugen, um das Verhalten von Eierstockkrebs in der Bauchhöhle zu starten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Schwefelen wie Aceton als Entwickler und Cylin äußerst gefährlich sein kann. MP-Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel, sollten immer getroffen werden, wenn Sie diesen Vorgang zum ersten Mal durchführen.

Alle Verfahren, die mit diesem Amt zu tun haben, sollten unter extremer Deckung durchgeführt werden.