Name: Sezierung, MicroCT Scanning und morphometrische Analysen der Baculum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Erfahren Sie eine morphometrische Methode zur dreidimensionalen Analyse komplexer biologischer Strukturen ohne Landmarken. Diese Technik nutzt Präparation und MicroCT-Scanning für präzise Messungen.

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Tim Daley und Andrew Smith lieferte viele nützliche Rechen Diskussionen in den frühen Tagen; Tim Daley schrieb das Programm rotate_translate_cylindrical notwendig für das Protokoll 5. Computational Ressourcen, die von der High Performance Computing Cluster an der University of Southern California zur Verfügung gestellt wurden. Diese Arbeit wurde von NIH Zuschusses # GM098536 (MDD) unterstützt.

Alle Verfahren und Personal wurden von der University of Southern California Institute for Animal Care und Use Committee (IACUC), Protokoll # 11394 zugelassen. 1. Baculum Dissection und Vorbereitung <ol><li> Euthanize eine geschlechtsreife männliche Maus über Kohlendioxid Überbelichtung, nach Protokollen, die von der jeweiligen Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) dargelegt. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage, und verschleppen den Penis durch Druck mit den Daumen auf die Präputialöffnung lateral. </li><li> Sobald der Penis langwierig ist, das Gewebe durch die Vorhaut erstrecken so weit wie möglich. </li><li> Mit Schere, schneiden Sie den Penis Körper proximal zu der Eichel, wo die baculum befindet. </li><li> Übertragen Sie die seziert Penis zu einem 1,7 ml-Röhrchen und mit 200 &amp; mgr; l Leitungswasser. Stellen Sie sicher, dass der Penis vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist. </li><li> Inkubieren des Gewebes in Wasser bei ~ 50 ° C für 3-5 Tage. </li><li&gt; Nach der ordnungsgemäßen Inkubation entfernen baculum das umgebende Gewebe, Pinzette unter einem Präpariermikroskop mit. Sanft spritzen 70% Ethanol verbleibende Gewebe abzustoßen und den Knochen zu reinigen. </li><li> Platzieren Sie den sezierten baculum in ein neues Reaktionsgefäß mit der Kappe geöffnet. Lassen Kappe offen O / N Knochen austrocknen. </li></ol> 2. MicroCT Scanning <ol><li> Drücken Sie eine microCT Scan zylindrischen Halter in einen Ziegel von Floristen Schaum einen Zylinder von Floristen Schaum zu erzeugen. </li><li> Extrahieren Sie den Zylinder von Floristen Schaum Scheiben schneiden und ~ 2-5 cm dick. </li><li> Push getrocknet bacula in den Floristen Schaum, um den Umfang eines einzelnen Slice Störungen zu minimieren während des Scannens. Die genaue Ausrichtung der Knochen sollte 4 in Protokoll für eine angemessene Identifizierung einzelner Proben bemerkt werden. </li><li> Sanft legen Sie die Scheibe mit den eingebetteten Knochen in den microCT Halter. </li><li> Erwerben Sie microCT Scans. Im Fall der Maus 14 bacula </sup&gt; Verwendeten wir ein uCT50 Scanner (Scanco Medical AG, Brüttisellen, der Schweiz) an der USC Molecular Imaging Center unter den folgenden Einstellungen: 90 kVp, 155 &amp; mgr; A, 0,5 mm Al-Filter, 750 Projektionen pro 180 (360 Deckung), Belichtungszeit 500 ms und Voxelgröße von 15,5 mm. </li></ol> 3. MicroCT Verarbeitung: eine .dcm Stapel zu einem einheitlichen .xyz Datei konvertieren HINWEIS: Jeder microCT Scan einen Stapel von .dcm erzeugt, oder &quot;dicom&quot;, Dateien, die Bildscheiben durch das Objekt genommen repräsentieren. Alle nachgelagerten algorithmischen Geometrie erfordert flache .xyz Dateien, die einfach eine Textdatei, die vier Spalten enthält - die x-, y- und z-Koordinaten jedes Pixels und die Intensität des Pixels, von -5.000 (schwarz) bis 5000 (Weiß). Ein Pixelschwelle über 3000 funktioniert im Allgemeinen gut als Schwelle für die Definition von Knochen. <ol><li> Installieren Sie Python (www.python.org) und die Python-Module BEFEHLE, DICOM, PYLAB, SYS und numpy. </li><li> Open &quot;01_process_dicom.py &quot;{Figshare} mit einem beliebigen Texteditor. Unter dem Abschnitt Variablen, ändern Weg, Pixelschwellen und Verzeichnisnamen wie nötig. </li><li> Run &quot;Python 01_process_dicom.py&quot;. Der Fortschritt wird auf Bildschirm gedruckt werden. Innerhalb jedes Verzeichnis in Schritt namens 3.2, wird eine neue Datei gemacht benannt; zum Beispiel directory_name.PT3000.xyz, wo PT3000 die Pixelschwelle anzeigt, in Schritt 3.2 angegeben. </li></ol> 4. MicroCT Verarbeitung: Segmentieren-out Einzel Specimen .xyz Dateien <ol><li> Installieren Sie R (https://www.r-project.org/) mit der Bibliothek RGL. </li><li> Öffnen Sie die Datei &#39;02_segment_dicoms.r&#39; {Figshare} mit einem beliebigen Texteditor. Unter dem Abschnitt Variablen, ändern Sie den Pfad zur Datei .xyz in Protokoll 3 oben erstellt zu zeigen. </li><li> Innerhalb R, führen Sie den Befehl &quot;Quelle ( &#39;02_segment_dicoms.r&#39;)&quot; (ohne Anführungszeichen). </li><li> Nach dem dreidimensionalen Bild der .xyz Datei in Protokoll 3 erscheint erstellt, geben Sie das number von Proben in der Gesamt .xyz Datei. Dann beschriften und die Punkte aus jeder Probe wählen Sie die Scroll- und Zoom-Funktionen. HINWEIS: Im Hintergrund getrennt .xyz Dateien werden für jede Probe durchgeführt werden. Diese erscheinen in einem Verzeichnis mit dem Namen, zum Beispiel XYZ_FILES_PT3000, wo PT3000 gibt die Pixelschwelle verwendet. </li></ol> 5. &quot;Ausrichten&quot; Specimen .xyz Dateien auf gemeinsamen Koordinaten. <ol><li> Öffnen Sie das Python-Skript &quot;03_transform.py&quot; {Figshare}, die das Zusatzmodul mattdean_modules.py {Figshare} erfordert, sowie zwei selbststehende Anwendungen: &quot;rotate_translate_cylindrical&quot; (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) und &quot;qconvex&quot; (www.qhull.org/html/qconvex.htm), die von diesem Skript verwendet werden. </li><li> Unter dem Abschnitt Variablen identifizieren die vollständigen Pfadnamen zu mattdean_modules.py, rotate_path und qconvex_dir. Darüber hinaus erkennen Sie den vollständigen Pfad zu dem Verzeichnis, das individuelle .xy enthältz-Dateien in Schritt 4 erstellt haben. </li><li> Führen Sie 03_transform.py, die pro Probe mit dem Suffix .TRANSFORMED.xyz eine neue Datei erstellt. </li></ol> 6. &quot;Slicing&quot; Aligned Specimen .xyz Dateien Halb Sehenswürdigkeiten zu identifizieren. <ol><li> Öffnen Sie und führen Sie das Python-Skript &quot;04_identify_landmarks.py&quot; {Figshare}. Im Abschnitt Variablen identifizieren vollständigen Pfadnamen in das Verzeichnis der .TRANSFORMED.xyz Dateien enthält. Dieses Skript identifiziert 802 semi-Wahrzeichen, die verwendet werden können, Größe und Form der Struktur zu quantifizieren. </li></ol>

<ol><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.anthro.34.081804.120613">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li>
<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlice%2C+DE+%22Modern+morphometrics+in+physical+anthropology%22">Modern morphometrics in physical anthropology</a>. 6, Springer. (2005).</li>
<li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZelditch%2C+ML+%22Geometric+morphometrics+for+biologists%3A+a+primer%22">Geometric morphometrics for biologists: a primer</a>. , 2nd, Elsevier. (2012).</li>
<li>Bookstein, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBookstein%2C+F+%22Morphometric+tools+for+landmark+data%3A+geometry+and+biology%22">Morphometric tools for landmark data: geometry and biology</a>. , Cambridge University Press. (1991).</li>
<li>Rohlf, F. J., Marcus, L. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21236128">A Revolution in Morphometrics.</a> Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).</li>
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<li>Gunz, P., Mitteroecker, P. <a target="_blank" href="http://www.italian-journal-of-mammalogy.it/article/view/6292">Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces.</a> Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).</li>
<li>Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+bony+labyrinth+reconsidered%2C+introducing+a+comprehensive+geometric+morphometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach.</a> J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).</li>
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<li>Bookstein, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landmark+methods+for+forms+without+landmarks%3A+morphometrics+of+group+differences+in+outline+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Im.+Anal%22%5BJournal%5D)">Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape.</a> Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).</li>
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<li>Oxnard, C., O'Higgins, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1162/biot.2009.4.1.84">Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology?</a> Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).</li>
<li>Schultz, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+baculum+size+and+shape+variation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of baculum size and shape variation in mice.</a> G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).</li>
<li>Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+baculum+was+gained+and+lost+multiple+times+during+mammalian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution.</a> Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).</li>
<li>Dines, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+selection+targets+cetacean+pelvic+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Sexual selection targets cetacean pelvic bones.</a> Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).</li>
<li>Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/2041-210X.12035/abstract">geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data.</a> Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die kritischen Schritte in dem obigen Protokoll sind 1) sezieren die Bacula, 2) die microCT Bilder sammeln, 3) Umwandeln der microCT Ausgabe in eine flache Datei von XYZ-Koordinaten, 4) Segmentieren aus jeder Punkt Cloud Probe, 5) die Umwandlung jeder Probe zu ein standardisiertes System, und 6), die halb Sehenswürdigkeiten koordinieren. Diese Schritte werden leicht modifiziert, um verschiedene Objekte aufzunehmen. Diese Verfahren können wahrscheinlich auf jedes Objekt angewendet werden, das...

Das Feld der morphometrics umfasst eine Vielfalt von Methoden , um die Größe und Form der biologischen Form, einen entscheidenden Schritt in der wissenschaftlichen Forschung 1, 2, 3, 4, 5, 6 , zu quantifizieren. Herkömmlicherweise beginnt die statistische Analyse der Größe und Form von Landmarken auf einer biologischen Struktur, und dann Messen linearen Abstände, Winkel und Verhältnisse zu identifizieren, die in einer multivariaten Rahmen analysiert werden konnte. Landmark-basierte Geometrische Morphometrie ist ein Ansatz, der die räumliche Lage von Sehenswürdigkeiten behält, geometrische Informationen von der Datenerfassung durch die Analyse zu erhalten und Visualisierung 5. Generalized Prokrustes-Analyse (GPA) kann Variation in Position, Skalierung und Drehung von Sehenswürdigkeiten entfernt werden angewendet, um eine Ausrichtung zwischen Proben zu erzeugen, die minimizes ihre quadrierten Differenzen - was bleibt Form Unähnlichkeit 7. Ein wichtiges Konzept jeder morphometrische Analyse ist Homologie, oder die Idee, dass man Ziele zuverlässig identifizieren können biologisch sinnvolle und diskrete Merkmale darstellt, die zwischen Proben oder Strukturen entsprechen. Zum Beispiel haben menschliche Schädel homologe Prozesse, Foramen, Nähte und Kanäle, die morphometrischen Analysen ermöglichen können. Leider ist die Identifizierung der entsprechenden Ziele schwierig in vielen biologischen Strukturen, insbesondere solche mit glatten Oberflächen oder Kurven 8, 9, 10. Wir nähern uns, dieses Problem unter Verwendung von algorithmischen Geometrie. Der allgemeine Arbeitsablauf ist eine dreidimensionale Abtastung des Objekts zu erzeugen, die als Punktwolke dargestellt werden kann, und dann drehen und dass die Punktwolke verwandeln, so dass alle specimens sind auf einem gemeinsamen Koordinatensystem orientiert. Dann definieren wir mathematisch semi-Grenzsteine ​​aus bestimmten Regionen des Objekts. Diskrete Halb Sehenswürdigkeiten auf solche Regionen platziert sind biologisch willkürlich 11. Durchführung von GPA und die anschließende statistische Analysen können unerwünschte Artefakte 8, 12 produzieren , weil willkürlich platziert Sehenswürdigkeiten biologisch nicht homolog sein kann. Deshalb lassen wir diese Halb Sehenswürdigkeiten mathematisch &quot;gleiten&quot;. Dieses Verfahren minimiert die Potentialdifferenz zwischen den Strukturen. Wie an anderer Stelle der Schiebe Algorithmus ist hier geeignet , verwendet argumentiert ähnliche anatomische Bereiche zu quantifizieren ohne Anhaltspunkte leicht identifiziert entsprechende 3, 6, 8, 10, 11, 12. Diese Verfahren haben ihre limitations 13, sollte aber auf Gegenstände unterschiedlicher Größe und Form anpassungsfähig sein. Hier veranschaulichen wir , wie diese Methode in einer neueren Studie der Maus baculum 14 angelegt wurde, ein Knochen in den Penis, der gewonnen wurde und verlor mehrere unabhängige Zeiten während Säuger evolution 15. Wir diskutieren die Präparation und Herstellung einer bestimmten Knochen, die baculum (Protokoll 1), die Erzeugung von microCT Bilder (Protokoll 2), und die Umwandlung dieser Bilder in ein Format, das alle nachgelagerten algorithmischen Geometrie (Protokolle 3 und 4) ermöglicht. Nach diesen Schritten wird jede Probe dargestellt durch ~ 100K xyz-Koordinaten. Wir gehen dann durch eine Reihe von Transformationen, die alle Proben in eine gemeinsame Ausrichtung (Protokoll 5) effektiv ausrichten, dann definieren halb Sehenswürdigkeiten aus ausgerichteten Proben (Protokoll 6). Protokolle 1-4 sollte unabhängig davon, wobei das Objekt analysiert ähnlich sein. Protokoll 5 und das Protokoll 6 sind speziell für einen baculum entworfen, aber es ist unsere Hoffnung, dass diese Schritte durch Detaillierung, können die Ermittler Änderungen vorstellen, die für ihr Objekt von Interesse relevant wäre. So wurden beispielsweise Modifikationen dieser Methoden Beckenknochen und Rippenknochen 16 zu studieren Wal angewendet.

<table><tbody><tr><td>Präparierschere</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>Die meisten Größen sollten funktionieren</td></tr><tr><td>Präparierzange, feine Spitze, gebogen</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>Zum Sezieren auf 70% verdünnen</td></tr><tr><td>Blumenschaum</td><td>Großhandel</td> <td>Blumen6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>uCT50 Scanner</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, Schweiz</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sezierung, microct scanning und morphometrische analysen der baculum

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Moderne morphometrics bietet leistungsfähige Methoden Größe und Formvariation zu quantifizieren. Eine Grundvoraussetzung ist eine Liste von Koordinaten, die Sehenswürdigkeiten zu definieren; aber solche Koordinaten müssen homologe Strukturen in Proben repräsentieren. Während viele biologische Objekte leicht identifiziert Sehenswürdigkeiten bestehen die Annahme der Homologie zu erfüllen, fehlen viele solcher Strukturen. Eine mögliche Lösung ist mathematisch Platz halb Sehenswürdigkeiten auf ein Objekt, das den gleichen morphologischen Region über Proben repräsentieren. Hier zeigen wir eine kürzlich entwickelte Pipeline mathematisch halb Sehenswürdigkeiten aus der Maus baculum (Penisknochen) definieren. Unsere Methoden sollten auf eine breite Palette von Objekten anwendbar sein.

Die XYZ - Koordinaten der Halb Sehenswürdigkeiten in Protokoll erzeugt 6 kann direkt in jeder Grenzstein-basierte Analyse geometrische Morphometrie 17 importiert werden. Die rechnerische Pipeline oben angewendet wurde 16 Maus bacula 14 sowie Wal Becken- und Rippenknochen zu studieren. Weitere Einzelheiten über die rechnerische Definition von Halb Sehenswürdigkeiten werden hier vorgestellt, in einem Versuch, die Forsc...

Viele biologische Strukturen fehlen leicht definierbaren Sehenswürdigkeiten, was es schwierig macht moderne morphometrische Methoden anzuwenden. Hier zeigen wir Methoden, um die Maus baculum (ein Knochen im Penis) zu studieren, einschließlich Dissektion und microCT Scannen, gefolgt von Rechenmethoden halb Sehenswürdigkeiten zu definieren, die verwendet werden, eine Größe zu quantifizieren und Variation zu gestalten.

Sezierung, MicroCT Scanning und morphometrische Analysen der Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Das übergeordnete Ziel dieser Dissektion und morphometrischen Analyse besteht darin, die Robustheit unserer morphometrischen Methodik zur Untersuchung von Strukturen mit komplexen Formen – wie dem Penisbein der Maus – zu veranschaulichen. Die Idee zu dieser Studie entstand, als uns bewusst wurde, dass bestehende Methoden zur Erfassung von Variationen des Baculums, beispielsweise durch die Messung von Länge und Breite, sämtliche Informationen über Krümmung und Formkomplexität verlieren. Daher entwickelten wir diese Methode, um Größen- und Formvariationen beliebiger Knochen oder Strukturen dreidimensional zu quantifizieren. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie moderne Morphometrie auf Strukturen anwendet, die keine anatomischen Landmarken aufweisen.Dies sollte das Forschungsgebiet voranbringen, indem verbesserte, reproduzierbare Messungen komplexer Strukturen bereitgestellt werden. Legen Sie eine getötete, geschlechtsreife männliche Maus in Rückenlage und strecken Sie den Penis durch Anlegen von Dauckdruck lateral zur Vorhautöffnung. Sobald der Penis hervortritt, strecken Sie das Gewebe so weit wie möglich durch die Vorhaut hindurch.Danach mit einer Schere d

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Biotechnik

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A Novel Microdissection Ansatz zur Wiederherstellung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Spezifische Transkripte aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Lung Granulome

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