Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Das übergeordnete Ziel dieses biochemischen Protokolls ist es, Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwesterhistonen zu erzeugen. Zur Verwendung bei der gleichzeitigen Kartierung posttranslationaler Modifikationsreaktionen auf beiden Schwesterhistonen. Das übergeordnete Ziel dieses biochemischen Protokolls ist die Generierung von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwesterhistonen für die gleichzeitige Kartierung posttranslationaler Modifikationen auf beiden Schwesterhistonen.

Diese Methode in Kombination mit hochauflösenden Techniken zur Kartierung posttranslationaler Modifikationen, wie z.B. in der Massenspektroskopie, beantwortet Schlüsselfragen der Chromatinbiologie, wie z.B. welche Mechanismen zur Bildung symmetrisch modifizierter Nukleosomen beitragen? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht in einem biochemischen Labor etabliert werden kann, da sie Standardprotokolle zur Rekonstitution von Nukleosomen mit gängigen Proteinreinigungsmethoden kombiniert. Zwei Pools mit Histon H3 werden für die Oktamerrekonstitution verwendet.

Stickstoff-15-markiertes H3, das ein Polyhistidin-Tag am Amino-Ende enthält, und Kohlenstoff-13-markiertes H3, das ein Streptavidin-Affinitäts-Tag am Amino-Ende enthält. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die lyophilisierten Histonaliquoten einschließlich der beiden Arten von Histon H3 in einem Entfaltungspuffer auflösen. Zu jedem Röhrchen, das etwa fünf Milligramm Histone enthält, einen Milliliter Entfaltungspuffer geben und durch Pipettieren mischen, aber nicht vortexen.

Lassen Sie die Röhren 30 Minuten lang auf Eis, damit sie sich vollständig entfalten können. Messen Sie anschließend die Extinktion bei 280 Nanometern, um die genaue Konzentration jedes Histons zu bestimmen. Mischen Sie die Kernhistone zu gleichen molaren Verhältnissen und denken Sie daran, dass jeweils 50 % der beiden Histon-H3-Pools enthalten sind.

Verwenden Sie einen Entfaltungspuffer, um die endgültige Proteinkonzentration auf etwa ein Milligramm pro Milliliter einzustellen. Übertragen Sie das Gemisch auf eine sechs Kilodalton abschneidende Dialysemembran. Und dialysieren gegen ein bis zwei Liter gekühlten Faltpuffer bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag wird das dialysierte Material aufgefangen und eventuelle Ausfällungen durch Zentrifugation in einer Mikrofuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius bei maximaler Geschwindigkeit entfernt. Nach der Bestimmung der Oktamerkonzentration wird das Oktamer mit einer 10-Kilodalton-Zentrifugalfiltereinheit auf ein Endvolumen von etwa zwei Millilitern konzentriert. Es sollte eine Oktamerkonzentration zwischen 50 und 100 Mikromolaren erreicht werden.

Bereiten Sie sich auf die Gelfiltration vor, indem Sie die Gelfiltrationssäule an ein FPLC-System anschließen. Äquilibrierung mit zwei Säulenvolumina oder CV von 0,22 Mikrometer gefiltertem und entgastem Rückfaltungspuffer. Das konzentrierte Material wird mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute injiziert und eine bis 1,5 Milliliterfraktion aufgefangen.

Zu Beginn dieses Verfahrens werden die relevanten Fraktionen, die reine Oktamere enthalten, in einem Pool zusammengefasst und die Konzentration wie zuvor beschrieben bestimmt. Schließen Sie eine Nickelnitrilotriacetinsäure- oder Nickel-NTA-Säule von einem Milliliter an das FPLC-System an. Und äquilibrieren Sie mit 10 CV von 0,22 Mikrometer gefiltertem und entgastem Rückfaltungspuffer bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute.

Das gereinigte Oktamer wird mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute durch das Nickel-NTA geleitet. Sammeln Sie den Durchfluss. Eluieren Sie mit 10 CV Rückfaltungspuffer mit 250 millimolaren Imidazol bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute.

Sammeln Sie die Nickel-NTA-Elution. Die Reinigung auf Streptavidin-Basis sollte idealerweise in einem Kühlraum durchgeführt werden. Äquilibrieren Sie eine Ein-Milliliter-Affinitätssäule eines kommerziellen Streptavidins mit einem 10-CV-Rückfaltungspuffer, der 250 millimolares Imidazol enthält, unter Verwendung eines Batch-Schwerkraftflussaufbaus.

Führen Sie die Nickel-NTA-Elution durch die Streptavidin-Affinitätssäule. Sammeln Sie den Durchfluss. Eluieren Sie mit 10 CV Rückfaltungspuffer, der 2,5 millimolare Desthiobiotin enthält.

Sammle das Elution. Nach Messung der Oktamerkonzentration in der Elution fügen Sie 10-mal weniger TEV-Protease hinzu und lassen Sie die Reaktion über Nacht bei vier Grad Celsius ablaufen. Am nächsten Tag wird das Gemisch auf eine 50 Kilodalton Cutoff-Dialysemembran überführt und über Nacht bei vier Grad Celsius gegen den Rückfaltungspuffer dialysiert.

Konzentrieren Sie das gereinigte asymmetrische Oktamer mit einer 10-Kilodalton-Zentrifugalfiltereinheit auf ein Volumen von ein bis zwei Millilitern. Die erwartete Oktamerkonzentration liegt bei 20 bis 50 Mikromolaren. Für die Rekonstitution von Nukleosomen ist DNA erforderlich, die eine Nukleosomenpositionierungssequenz enthält.

Passen Sie die DNA-Salzkonzentration mit einer fünfmolaren Natriumchlorid-Stammlösung auf zwei molare Natriumchloride an. Mischen Sie die DNA mit Octamer und Refaltungspuffer unter Verwendung des optimalen Verhältnisses von Oktamer zu DNA, das in einem kleinen Test ermittelt wurde. Fügen Sie das Oktamer zuletzt hinzu, um eine Vermischung des Oktamers und der DNA bei einer Salzkonzentration von weniger als zwei Molaren zu verhindern.

Übertragen Sie die Mischung auf eine sechs Kilodalton abgeschnittene Dialysemembran und dialysieren Sie gegen einen Liter Rückfaltungspuffer bei vier Grad Celsius. Reduzieren Sie am Folgetag die Salzkonzentration des Dialysepuffers schrittweise. Die Probe wird mindestens drei Stunden lang in jedem Natriumchloridpuffer aufbewahrt.

Übertragen Sie anschließend die Dialysemembran in ein Becherglas mit einem Liter Assay-Puffer und setzen Sie die Dialyse über Nacht bei vier Grad Celsius fort. Entnehmen Sie am folgenden Tag die dialysierte Probe. Entfernen Sie den durch Zentrifugation gebildeten Niederschlag in einer Mikrofuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius bei maximaler Geschwindigkeit.

Die Probe wird mit einer Zentrifugalfiltereinheit mit einem Cutoff-Fassungsvermögen von 30 Kilodalton auf ein Endvolumen von etwa 300 Mikrolitern konzentriert. Messen Sie die DNA-Konzentration bei 260 Nanometern. Die Endkonzentration sollte im Bereich von 10 bis 20 Mikromolaren liegen.

Lagern Sie die Probe bis zu mehreren Wochen bei vier Grad Celsius. Ein Gelfiltrationselutionsprofil des gefalteten Histongemisches zeigt, dass die Histon-Oktamere bei etwa 70 Millilitern eluieren. Ein SDS-Seitengel zeigt die korrekte Histon-Stöchiometrie.

Der rekonstituierte Oktamerpool, der die drei Arten von Oktameren enthält, wird einem Tandem-Affinitätsreinigungsschema unterzogen. Die Isolierung asymmetrischer Spezies wird durch das Vorhandensein des Affinitäts-Tags bestätigt. Die Affinitäts-Tags werden anschließend mit TEV-Protease entfernt.

Eine kleinskalige Nukleosomenrekonstitution mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen von DNA zu Oktamer zeigte, dass ein Verhältnis von eins zu eins optimal war. Eine großflächige Nukleosomenrekonstitution wurde unter Verwendung des optimierten Verhältnisses von DNA zu Oktamer durchgeführt, und die korrekte Stöchiometrie der vier Kernhistone wurde beobachtet. Die NMR-Spektroskopie von differentiell isotopenmarkierten Nukleosomen bestätigte das Vorhandensein von Stickstoff-15-markierten und Kohlenstoff-13-markierten Schwester-H3-Histonen.

In diesem Anwendungsbeispiel wurden Nukleosomen, die differentiell isotopenmarkiert und asymmetrisch am C-Ring 10 des Histons H3 phosphoryliert waren, mit GCN5-Acetyltransferase umgesetzt. Und die Acetylierung von Histon H3-Lysin 14 auf beiden H3-Kopien wurde in Echtzeit durch NMR-Spektroskopie verfolgt. Die Analyse zeigte, dass der C-Ring 10 der Histon-H3-Phosphorylierung die Histon-H3-Lysin-14-Acetylierung durch GCN5 in cis im Vergleich zu in trans stimuliert.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Nukleosomen rekonstituiert werden, die Schwesterhistone mit unterschiedlichen Merkmalen enthalten.