Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Das übergeordnete Ziel dieses biochemischen Protokolls besteht darin, Nukleosomen mit unterschiedlich isotonmarkierten Schwesterhistonen herzustellen, um posttranslationale Modifikationen an beiden Schwesterhistonen gleichzeitig kartieren zu können. Das übergeordnete Ziel dieses biochemischen Protokolls ist die Erzeugung von Nukleosomen mit differenziell isotonmarkierten Schwesterhistonen zur gleichzeitigen Kartierung posttranslationaler Modifikationen an beiden Schwesterhistonen.

Diese Methode in Kombination mit hochauflösenden Techniken zur Kartierung posttranslationaler Modifikationen, wie beispielsweise der Massenspektrometrie, beantwortet zentrale Fragen der Chromatinbiologie, beispielsweise, welche Mechanismen zur Bildung symmetrisch modifizierter Nukleosomen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie problemlos in einem biochemischen Labor etabliert werden kann, da sie Standardprotokolle zur Nukleosomenrekonstitution mit gängigen Methoden der Proteinreinigung kombiniert. Zwei Pools von Histon H3 werden für die Rekonstitution des Histonoktamers verwendet.

Mit Stickstoff-15 markiertes H3, das einen Polyhistidin-Tag am Amino-Terminus enthält, und mit Kohlenstoff-13 markiertes H3, das einen Streptavidin-Affinitäts-Tag am Amino-Terminus enthält. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die lyophilisierten Histonaus aliquoten, einschließlich der beiden Arten von Histon H3, in Entfaltungs-Puffer auflösen. Geben Sie jedem Röhrchen, das etwa fünf Milligramm Histone enthält, ein Milliliter Entfaltungs-Puffer hinzu und mischen Sie durch Pipettieren, aber nicht durch Vortexen.

Die Röhrchen 30 Minuten auf Eis belassen, um eine vollständige Entfaltung zu ermöglichen. Anschließend die Absorption bei 280 Nanometern messen, um die genaue Konzentration jedes Histonproteins zu bestimmen. Die Kernhistone in äquimolaren Verhältnissen mischen, wobei darauf zu achten ist, jeweils 50 % der beiden Histon-H3-Pools einzuschließen.

Verwenden Sie Pufferpuffer, um die endgültige Proteinkonzentration auf etwa ein Milligramm pro Milliliter einzustellen. Überführen Sie das Gemisch in eine Dialysemembran mit einer Grenzgröße von sechs Kilodalton und dialysieren Sie gegen ein bis zwei Liter gekühlten Puffer zur Faltungsreaktion bei vier Grad Celsius.

Am folgenden Tag das dialysierte Material sammeln und eventuelle Präzipitate durch Zentrifugation in einem Mikrozentrifugenröhrchen fünf Minuten bei vier Grad Celsius und maximaler Geschwindigkeit entfernen. Nach der Bestimmung der Oktamer-Konzentration eine Zentrifugalfiltereinheit mit 10 Kilodalton-Schwellenwert verwenden, um das Oktamer auf ein Endvolumen von etwa zwei Milliliter zu konzentrieren. Es sollte eine Oktamer-Konzentration zwischen 50 und 100 Mikromolar erreicht werden.

Bereiten Sie die Gelfiltration vor, indem Sie die Gelfiltrationssäule an ein FPLC-System anschließen. Puffern Sie mit zwei Säulenvolumina (CV) des 0,22-Mikrometer-gefilterten und entgasten Puffers für die Renaturierung. Injizieren Sie das konzentrierte Material mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute und sammeln Sie Fraktionen von 1 bis 1,5 Milliliter.

Um dieses Verfahren zu beginnen, sammeln Sie die relevanten Fraktionen, die reine Octamere enthalten, und bestimmen Sie die Konzentration wie zuvor beschrieben. Schließen Sie eine Nickel-Nitrilotriessigsäure- oder Nickel-NTA-Säule mit einem Volumen von einem Milliliter an das FPLC-System an und equilibrieren Sie diese mit 10 Säulenvolumina an 0,22-Mikrometer-gefiltertem und entgastem Puffer für die Faltungsreaktion bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute.

Leiten Sie das gereinigte Octamer über die Nickel-NTA mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute. Sammeln Sie den Durchlauf. Eluieren Sie mit 10 CV Puffer zur Faltungsreaktion, der 250 Millimolar Imidazol enthält, bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute.

Sammeln Sie die Nickel-NTA-Elution. Die auf Streptavidin basierende Reinigung sollte idealerweise in einem Kühlraum durchgeführt werden. Äquilibrieren Sie eine ein Milliliter umfassende Affinitäts­säule aus kommerziellem Streptavidin mit 10 CV Puffer zur Faltungsunterstützung, der 250 Millimolar Imidazol enthält, mithilfe einer Chargen-Gravitations-Durchlaufanordnung.

Leiten Sie die Nickel-NTA-Elution durch die Streptavidin-Affinitäts-Säule. Sammeln Sie den Durchlauf. Eluieren Sie mit 10 CV Puffer zur Faltungsreaktion, der 2,5 Millimolar Desthiobiotin enthält.

Sammeln Sie die Elution. Nach der Bestimmung der Oktamerkonzentration in der Elution, geben Sie zehnmal weniger TEV-Protease hinzu und lassen die Reaktion über Nacht bei vier Grad Celsius ablaufen. Übertragen Sie am folgenden Tag das Gemisch in eine Dialysiermembran mit einer Grenzgröße von 50 Kilodalton und dialysieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius gegen Puffer zum Auffalten.

Konzentrieren Sie das gereinigte asymmetrische Oktamer mithilfe einer Zentrifugalfiltereinheit mit 10 Kilodalton-Cut-off auf ein Volumen von ein bis zwei Milliliter. Die erwartete Oktamer-Konzentration liegt bei 20 bis 50 Mikromolar. Für die Nukleosom-Rekonstitution wird DNA benötigt, die eine Nukleosom-Positionssequenz enthält.

Stellen Sie die DNA-Salzkonzentration mit einer fünf Molaren Natriumchlorid-Stammlösung auf zwei Molare Natriumchlorid ein. Mischen Sie die DNA mit Octamer und Pufffer zum Urfalten unter Verwendung des aus einem kleinskaligen Test ermittelten optimalen Verhältnisses von Octamer zu DNA. Geben Sie das Octamer zuletzt hinzu, um sicherzustellen, dass keine Vermischung von Octamer und DNA bei einer Salzkonzentration unter zwei Molaren stattfindet.

Überführen Sie das Gemisch in eine Dialysemembran mit einer Grenzgröße von sechs Kilodalton und dialysieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius gegen ein Liter Puffer für die Faltungsreaktion. Am folgenden Tag verringern Sie die Salzkonzentration des Dialysepuffers schrittweise. Belassen Sie die Probe in jedem Natriumchlorid-Puffer mindestens drei Stunden lang.

Als Nächstes überführen Sie die Dialysemembran in einen Becher mit einem Liter Assay-Puffer und führen die Dialyse über Nacht bei vier Grad Celsius fort. Am folgenden Tag sammeln Sie die dialysierte Probe ein. Entfernen Sie jeglichen gebildeten Niederschlag durch Zentrifugation in einem Mikrozentrifugengerät für fünf Minuten bei vier Grad Celsius auf maximaler Drehzahl.

Konzentrieren Sie die Probe mithilfe einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer Grenzgröße von 30 Kilodalton auf ein Endvolumen von etwa 300 Mikroliter. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration bei 260 Nanometern. Die Endkonzentration sollte im Bereich von 10 bis 20 Mikromolar liegen.

Lagern Sie die Probe bis zu mehreren Wochen bei vier Grad Celsius. Ein Elutionsprofil der umgefalteten Histonmischung mittels Gelfiltration zeigt die Elution der Histonoktamer bei etwa 70 Milliliter. Ein SDS-Page-Gel zeigt die korrekte Histonstöchiometrie.

Der rekonstituierte oktamere Pool, der die drei Typen von Oktameren enthält, wird einem zweistufigen Affinitätsreinigungsschema unterzogen. Die Isolierung asymmetrischer Spezies wird durch das Vorhandensein des Affinitätstags bestätigt. Die Affinitätstags werden anschließend mit TEV-Protease entfernt.

Eine Nukleosomenrekonstitution im kleinen Maßstab unter Verwendung unterschiedlicher molarer Verhältnisse von DNA zu Octamer zeigte, dass ein Verhältnis von eins zu eins optimal war. Eine Nukleosomenrekonstitution im großen Maßstab wurde unter Verwendung des optimierten molaren Verhältnisses von DNA zu Octamer durchgeführt, wobei die korrekte Stöchiometrie der vier Kernhistone beobachtet wurde. Die NMR-Spektroskopie differenziell isotopenmarkierter Nukleosomen bestätigte das Vorhandensein von mit Stickstoff-15 und Kohlenstoff-13 markierten Schwester-H3-Histonproteinen.

In diesem Anwendungsbeispiel wurden nukleosomale Partikel, die differentiell mit Isotopen markiert und asymmetrisch am C-Ring 10 des Histon H3 phosphoryliert waren, mit der GCN5-Acetyltransferase inkubiert. Die Acetylierung des Lysin 14 des Histon H3 an beiden H3-Kopien wurde dabei in Echtzeit mittels NMR-Spektroskopie verfolgt. Die Analyse ergab, dass die Phosphorylierung des C-Ring 10 des Histon H3 die Acetylierung des Lysin 14 des Histon H3 durch GCN5 im cis-Modus im Vergleich zum trans-Modus stimuliert.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von fünf Tagen durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nukleosomen rekonstituiert, die Schwester-Histonproteine mit unterschiedlichen Eigenschaften enthalten.