Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Das übergeordnete Ziel dieses mikrofluidischen Experiments ist es, gleichzeitig die Thrombozytenablagerung in der Fibrinbildung auf einer reaktiven Oberfläche unter Strömungsbedingungen mittels Echtzeit-Videomikroskopie zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Transfusionsmedizin über die Auswirkungen der Thrombozytenkonzentratherstellung auf die gerinnungsfördernde Natur von transfundiertem Blut zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Analyse der Thrombozytenfunktion und der Gerinnung in der Strömung ermöglicht und es ermöglicht, das Zusammenspiel zwischen beiden Prozessen zu untersuchen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die durch den Kontaktweg induzierte Thrombozytenprokoagulation geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung des extrinsischen Weges angewendet werden, indem sie mit einem lipidierten Gewebefaktor beschichtet wird. Das Verfahren wird von Rosalie Devloo, einer Technikerin des Labors, vorgeführt. Beginnen Sie mit der Einrichtung der Mikrofluidik-Durchflusskammer, indem Sie 0,8 Mikroliter frisch rekonstituiertes Kollagen in fünf Sechstel der Länge jedes Kanals an einem Ende eines neuen mikrofluidischen Einweg-Biochips mit acht geraden parallelen Kanälen pipettieren und dieses Ende des Mikrochips als Auslass markieren.

Inkubieren Sie den Biochip mindestens vier Stunden lang bei vier Grad Celsius in einem befeuchteten und verschlossenen Behälter. Am Ende der Inkubation füllen Sie die codierten Kanäle in eine gleiche Anzahl von Y-förmigen Kanälen in einen Mischbiochip mit Blockierungspuffer. Legen Sie den Mikrochip für eine Stunde bei Raumtemperatur in den Behälter zurück.

Platzieren Sie dann einen Stift an einem Ende von zwei acht Zentimeter langen und ein, zwei Zentimeter langen Schlauchstücken und an beiden Enden eines 46 Zentimeter langen Schlauchstücks für jeden verwendeten Kanal. Verwenden Sie als Nächstes die Nanopump-Software, um alle Pumpenfluidik in den angeschlossenen Schläuchen mit destilliertem Wasser zu spülen, und spülen Sie eine Spritze in den Spritzenanschlussstift, um alle anderen Schläuche mit Blockierungspuffer zu füllen. Befestigen Sie dann den codierten Biochip mit einer Laborschere auf dem automatisierten Mikroskoptisch, um den Mischbiochip auf der gleichen Höhe wie der Mikroskoptisch zu befestigen.

Verwenden Sie die Stifte in den acht Zentimeter großen Röhrchen, um diese Schlauchstücke am Einlass des Mischbiochips zu befestigen, und stecken Sie das freie Ende jedes Röhrchens in ein Fläschchen mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung. Verbinden Sie nun den codierten Biochip mit dem mischenden Biochip mit dem 46 Zentimeter langen Schlauchstück in einer flexiblen, aber geraden Linie. Befestigen Sie einen Spritzensteckerstift an den Luer-kompatiblen Schlauch der Spülpumpe.

Verbinden Sie dann den Stift mit dem freien Ende des zwei Zentimeter großen Schlauchstücks und befestigen Sie das andere Ende des Schlauchs am Auslass des codierten Biochips. Spülen Sie dann alle Schläuche und Kanäle mit einem Milliliter HBS aus. Um die Perfusionspumpen vorzubereiten, öffnen Sie die Software Microfluidic Perfusion Pump Driver und doppelklicken Sie auf das Spritzensymbol, um die Pumpen zu initialisieren.

Wählen Sie den Spritzentyp aus, der verwendet werden soll, und trennen Sie die Spülpumpe und den daran angeschlossenen zwei Zentimeter langen Schlauch. Verbinden Sie den getrennten zwei Zentimeter langen Schlauch mit dem Spritzensteckerstift mit dem Luer-Lock eines dickwandigen Abfallschlauchs und füllen Sie den dickwandigen Schlauch mit einer Spritze mit Standard-Pepsinlösung. Sichern Sie dann das offene Ende des dickwandigen Schlauchs mit einer Kocher-Klemme.

Stecken Sie den Schlauch in den Ausgang des codierten Biochips. Trennen Sie die beiden Rohre zusammen von der Mischströmungskammer und entsorgen Sie die Behälter mit HBS. Nachdem Sie die Blutprobe in evakuierten Natriumcitratbehältern entnommen haben, zentrifugieren Sie die Röhrchen und überführen Sie das plättchenreiche Plasma in ein neues Zentrifugationsröhrchen.

Schleudern Sie die Behälter mit plättchenreichem Plasma wieder herunter. Übertragen Sie dann das überstehende plättchenarme Plasma in ein anderes Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie als Nächstes eine 21-Gauge-Nadel, um den Boden der Natriumcitratbehälter zu perforieren, damit die verpackten roten Blutkörperchen in ein neues konisches Röhrchen tropfen können.

Wenn alle verpackten roten Blutkörperchen entnommen wurden, rekonstituieren Sie das Blut schonend, indem Sie getrennte gepackte rote Blutkörperchen mit blutplättchenarmem Plasma kombinieren und Blutbankplättchen hinzufügen, die für die Transfusion vorbereitet wurden, um Proben mit einem Hämatokrit von 40 % und einer Konzentration von 2,5 mal 10 bis den fünften Blutplättchen pro Mikroliter auf ein Endvolumen von 2,5 Millilitern zu erhalten und ein vollständiges Blutbild zu erhalten. Geben Sie als Nächstes 13 Mikroliter fluorophormarkiertes Fibrinogen in ein konisches Röhrchen aus Polystyrol. Gefolgt von einem Milliliter des rekonstituierten Blutes.

Mischen Sie einen weiteren Milliliter Blut mit zwei Mikrolitern fluoreszierendem Thrombozytenfarbstoff und fügen Sie die markierten Blutproben zusammen. Dann drehen Sie die gemischten Blutproben vorsichtig um und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Bevor Sie mit dem Perfusionsassay beginnen, fokussieren Sie die Mikroskopoptik auf die Kollagenfasern, die am Boden des ersten Kanals haften.

Definieren Sie mit der Erfassungssoftware einen Interessenbereich im ausgewählten Kanal. Laden Sie einen Milliliter vorgewärmten Gerinnungspuffer in eine Ein-Milliliter-Spritze und montieren Sie die Spritze auf die Perfusionspumpe. Nach einer zweiten sanften Inversion füllen Sie das Blut in eine Zwei-Milliliter-Spritze und montieren die Spritze auf die Perfusionspumpe.

Befestigen Sie dann beide Spritzen mit einem Spritzensteckerstift an einem Stück acht Zentimeter dickem Schlauch und entleeren Sie die Anschlüsse und Schläuche mit 400 Mikrolitern pro Minute. Wenn alle Schläuche entweder mit Gerinnungspuffer oder Blut gefüllt sind, stecken Sie das andere Ende beider Schläuche an die geteilten Schenkel des Y-förmigen Kanals im Mischbiochip. Entfernen Sie dann die Kocher-Klemme am Ausgang des Abflussrohrs und initiieren Sie die Perfusion mit 4,4 Mikrolitern pro Minute für den Gerinnungspuffer und 44 Mikrolitern pro Minute für das rekonstituierte Blut.

Nehmen Sie Bilder 30 Minuten lang alle 10 Sekunden in Echtzeit auf und beenden Sie die Pumpen und die Bildaufnahme nach 30 Minuten oder wenn das Signal gesättigt ist. Entsorgen Sie dann alle Schläuche und Spritzen als biologisch gefährlichen Abfall. Dieses Video ist ein hervorragendes Beispiel für den Aufbau von Thrombozytenthromben und Fibrinablagerungen

Zu Beginn der Perfusion hafteten die Blutplättchen an der reaktiven Oberfläche, was zu einem stetigen Anstieg der aufgezeichneten grünen Fluoreszenz führte. Während dieser Adhäsionsphase gibt es wenig violette Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass das Fibrin nur marginal gebildet wird. Bei Beginn der Gerinnung lagert sich das heftig fluoreszierende Fibrin schnell ab, wobei sich die grüne Fluoreszenz der Blutplättchen mit etwa der gleichen Geschwindigkeit ansammelt.

Ein Zeitpunkt des Einsetzens der Gerinnung kann daher als Determinante des Thrombozytenprokoagulanzienpotentials extrapoliert werden. Die Zugabe von Maistrypsin-Inhibitor zum rekonstituierten Blut hat keinen Einfluss auf die Thrombozytenadhäsion, aber die Gerinnung beginnt nicht für die gesamte Dauer des Perfusionsexperiments. Durch die Erhöhung der Anzahl der Blutplättchen in einer rekonstituierten Probe steigt die Adhäsions-, Akkumulations- und Gerinnungsrate linear an.

Der Zeitpunkt des Auftretens wird durch Erhöhung der Thrombozytenkonzentration signifikant verkürzt, was darauf hindeutet, dass eine Schwellenwertzahl an aktivierten deponierten Thrombozyten erforderlich ist, um die Gerinnung auszulösen. Des Weiteren ist in einer gepaarten Analyse von Kanälen, die nur mit Kollagen oder in Kombination mit rekombinantem lipidiertem Gewebefaktor beschichtet sind, der Gerinnungsbeginn signifikant schneller, obwohl weder die Gesamtrate der Gerinnung noch die Thrombozytenakkumulation zwischen den Bedingungen unterschiedlich ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein mikrofluidisches Durchflusskammerexperiment mit doppelt markiertem rekonstituiertem Blut zur gleichzeitigen Analyse der Thrombozytenfunktion und der Gerinnung durchführen können.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Transfusionsmedizin, um die Wechselwirkungen zwischen Blutplättchen und Gerinnung unter Fluss zu erforschen. In diesem Video haben wir uns auf die Demonstration eines standardisierten Experiments konzentriert. Aber auch Änderungen der Oberflächenbeschichtung, der Schildspannungen oder der Kalziumkonzentration können eingeführt werden, um spezifische Forschungsfragen von Interesse zu beantworten.