Name: Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Erfahren Sie die steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transfektion in heterologen Systemen. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Proteinexpression und reproduzierbare Ergebnisse in der Ionenkanal-Pharmakologie.

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Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation [Grants 1721/12, 1368/12 und 1444/16] (AP). AP ist mit Brettler Center und David R. Bloom Center, School of Pharmacy, The Hebrew University of Jerusalem angeschlossen.

1. Ligieren des Gens von Interesse in die Reprimierbare Site of Vector <ol><li> Erhalten Sie induzierbaren Vektors wie pcDNA5 / FRT / TO oder pcDNA4 / TO. </li><li> Analyse das Gen von Interesse für alle potentiell anfällig Restriktionsstellen in der Mitte des Gens, der auch in der multiplen Klonierungsstelle des ausgewählten Vektor 4 durch in silico DNA - Analyse - Software gezeigt werden. </li><li> Unter Verwendung von Standard Überlappungs - PCR - Techniken 4, flankieren das Gen von Interesse mit zwei ausgewählten Restriktionsenzym - Erkennungsstellen (die in dem Gen von Interesse zu finden sind), die erste vor dem Startcodon eingeführt ist , und das zweite nach dem Stopp - Codon. </li><li> Digest sowohl den Vektor und Insert mit Restriktionsenzymen (ausgewählt in Schritt 1.2) bei Arbeitstemperatur &quot;Enzyme für eine Stunde, gefolgt von der Zugabe einer Einheit Kalbsdarm-Phosphatase (CIP), um den Vektor Reaktion nur 30 Minuten, um sich selbst zu vermeiden, Ligation. </li><li>Laden die verdaute DNA auf ein 1% iges Agarosegel und trennen die abgespaltenen Segmente durch Elektrophorese 9. </li><li> Mit UV-Licht, Schnitt mit einem Messer die Stücke des Gels die gewünschten Segmente des Vektors enthält, und fügen Sie ligiert werden. </li><li> Extrahieren, um die DNA-Segmente aus dem Agarosegel Stücke (kommerziell erhältliche DNA-Extraktion Kits) und messen ihre Endkonzentration von Spektrophotometer bei 260 nm. </li><li> Ligieren des Gens von Interesse in den ausgewählten induzierbaren Vektors bei Raumtemperatur für 20 Minuten unter Verwendung von T4-Ligase-Enzym. Um die Wahrscheinlichkeit des Einsatzes Ligieren mit dem Vektor zu erhöhen, verwenden Sie einen 3: 1-Molverhältnis des Einsatzes: Vektor. Zur Kontrolle bereiten eine Ligatur Reaktion, die nur den Vektor umfasst. </li><li> Bei bakteriellen Transformation, mit 10 ng Vektor allein und Vektor + Gen in 50 &amp; mgr; l kompetente E. coli. Inkubieren der Röhrchen auf Eis für 30 Minuten, gefolgt von 45 Sekunden Inkubation bei 42 ° C. Ab sofort setzen zurückauf Eis für zwei Minuten und die transformierten Bakterien auf 500 &amp; mgr; l LB-Medium übertragen. bei 220 rpm bei 37 ° C unter Rühren eine Stunde lang inkubieren. </li><li> Zur Selektion erfolgreich transformierter Bakterien, Platte 100 ul jeder Reaktion auf einem vorbereiteten LB Agarplatte (wie in 1.9 beschrieben) , um das geeignete Antibiotikum (beispielsweise 100 &amp; mgr; g / ml Ampicillin bei Verwendung pcDNA4 / TR). </li><li> Erlauben über Nacht bei 37 ° C wachsen. Platten können sie in Kunststoffparaffinfilm durch dicht für bis zu zwei Wochen bei 4 ° C gelagert werden Umhüllen. </li><li> Heben einzelne Kolonien eine 10 ul Spitze verwenden, und ermöglichen über Nacht in 3 ml LB + Antibiotika-Medium bei 37 ° C unter Rühren bei 220 Upm wachsen. Bakterien, die mit DNA von Interesse eingefroren werden können (-20 ° C) für die kurzfristige Lagerung durch den LB und Bakterien bei 11.000 xg zentrifugiert und der Überstand abgesaugt werden. Langzeitlagerung erfordert bei -80 ° C die Bakterien als Glycerinstamm einfriert. </li><li> Extrakt DNA through mini-prep und die Endkonzentration von Spektrophotometer bei 260 nm 5 messen. </li><li> Bestätigen des erfolgreichen Einsetzen des Gens von Interesse durch Sequenzierung des gereinigten Konstrukt 4. Alternativ diagnostischer Verdau des Konstrukts durch Restriktionsenzyme Elektrophorese der Schnittsegmente und bewerten ihre Präsenz und Länge können auch zu diesem Zweck verwendet werden , 4 zu trennen , verwenden. </li></ol> 2. Anzucht Zelllinien TetR Ausdruck <ol><li> Besorgen Sie sich eine Zellkulturlinie ein Tet-Repressor-Plasmid in ihre genomische DNA eingebaut beherbergen. Hierin wird das Protokoll unter Verwendung von humanen embryonalen Nierenzellen 293T (HEK-293T) beherberge pcDNA6 / TR Plasmid als Beispiel geschrieben werden. </li><li> Seed Zellen in 100 mm Gewebekulturplatte mit Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 25 mM HEPES, pH 7,3 (hierin: Voll DMEM) und inkubiere O / N bei 37 &amp;# 176; C und 5% CO 2. Alle Arbeiten mit Zellen sollten in einer biologischen Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. </li><li> Um die Expression von Tet-Repressor-Gen absaugen Medium und ersetzen Sie es mit Voll DMEM, ergänzt mit 5 ug / ml Blasticidin zu halten. Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Sobald Zellen 80 erreichen - 90% Konfluenz, aspirieren das Medium und die Zellen vorsichtig zweimal mit DPBS waschen (ohne Calcium und Magnesium) erwärmt auf 37 ° C. </li><li> Um ohne dass eine mechanische Beschädigung die Zellen vorsichtig heben, brüten die Kultur in DMEM mit Trypsin 0,05% erwärmt auf 37 ° C für 1,5 min. </li><li> Blockieren Sie die Trypsin Aktion mit einem gleichen Volumen von Voll DMEM. Pipette vorsichtig nach oben und unten, um die Zellen zu heben und sie in ein steriles Röhrchen übertragen. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 200 xg für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren und ersetzen Sie es mit 1 ml Voll DMEM. Pipette, um die Lösung mit den Zellen auf und ab, bis keinZellklumpen zu sehen. Zählen und Berechnen der Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Samen von 1 bis 2 x 10 6 Zellen in 100 mm Gewebekulturschale mit 12 ml Voll DMEM mit 5 ug / ml Blasticidin. Teilen Sie die Zellen zweimal in der Woche, da sie 90% Konfluenz erreichen. </li></ol> 3. Transfektion der Plasmid von Interesse in Zellen <ol><li> Unter Verwendung des gleichen Verfahrens von Teilen von Zellen , wie oben beschrieben, Übertragungszellen in die Vertiefungen in einer 12-Well - Platte , hergestellt mit 0,9 ml Voll DMEM, ausreichend 50% konfluent zu machen (~ 200.000 Zellen) und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem CO 2 Inkubator. </li><li> Bereiten Sie eine Transfektionsgemischs mit pcDNA4 / an das Gen von Interesse enthält, ein inertes Plasmid, das die Gesamt-DNA-Menge auf 1 &amp; mgr; g zu bringen (falls nötig), 3 ul Lipid Transfektionsreagenz und DMEM auf das endgültige Volumen von 100 &amp; mgr; l zu machen. Die optimale Menge an Plasmid-DNA verwendet werden, variiert stark, wie unterschiedliche Proteine ​​in unterschiedlichen Effizienz exprimieren. Für electphysiologische Experimente, umfassen EGFP in Säugetier - Expressions Plasmid in der Cocktail - Transfektion , um Zellen sichtbar zu machen , die erfolgreich Transfektion 4 unterziehen. </li><li> Inkubiere das Transfektionsgemisch bei RT für 30 min. </li><li> Transfektion von Zellen durch Pipettieren der Transfektionsgemisch tropfenweise auf den plattierten Zellen in 12-Well-Platte und Rock die Platte kräftig eine homogene Dispersion von DNA und Transfektionsreagenz zu gewährleisten. Zellen sollten zum Zeitpunkt der Transfektion ~ 80% konfluent sein. </li><li> Inkubieren der transfizierten Zellen O / N bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Bestätigen Sie, dass die Zellen durch die Beobachtung des Fluoreszenzsignals von EGFP unter UV-Lampe am nächsten Morgen erfolgreich transfiziert wurden, wenn die Elektrodurchführen. </li></ol> 4. Überzug Zellen auf Poly-D-Lysine (PDL) Deckgläser / Wells <ol><li> Sterilisieren 12 mm Deckgläser durch mit 70% Isopropyl Ethanollösung Begießen. Trockene und legen Sie eine einzelne coverslip in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte für elektrophysiologische Aufzeichnung. </li><li> Pipette eine Lösung von 0.1 - 0.2 mg / ml PDL-Lösung auf jedes Deckglas oder auch eines Kalzium-Imaging-Kammer. </li><li> Man lässt 30 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator zu sitzen. </li><li> Waschen Sie mit Zellkultur doppelt destilliertem Wasser (DDW) dreimal, zwischen jedem Wasch Absaugen. Nach dem letzten Waschen gründlich trocknen und lassen bei RT zu sitzen. </li><li> Für die Elektro füllen jede Vertiefung mit einem PDL beschichtet Deckglas mit 500 &amp; mgr; l Voll DMEM auf 37 ° C erwärmt. </li><li> Führen Sie die gleiche Methode, um die transfizierten Zellen spalten, wie oben beschrieben. Nach Resuspendieren der Zellen nach der Trypsin-Behandlung und Blockierung, die Übertragung 80 &amp; mgr; l Zellen (oder ca. 30.000 Zellen) zu der Mitte jedes PDL beschichteten Deckglas für die Elektro Aufnahme. Lassen Sie Zellen für mindestens 1,5 Stunden absetzen oder über Nacht in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C inkubiert. </li><li> Für Calcium Imaging Transfer und Stelle 20 &amp; mgr; l Zellen (etwa 20.000 Zellen) in die Mitte jedes Kalzium PDL beschichtet Bildgebung gut. Lassen Sie Zellen für mindestens 30 Minuten absetzen und fügen 180 ul Voll DMEM in jede Vertiefung. </li></ol> 5. Induzierende Genexpression <ol><li> Bereiten Sie eine Doxycyclin Stammlösung von 1 mg / ml in DDW gemäß den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Stammlösung vor Licht geschützt bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen. Für die langfristige Lagerung halten Doxycyclin Stammlösung bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine frische 2 ug / ml (Elektrophysiologie) oder 3 ug / ml (Kalzium-Imaging) Doxycyclin-Lösung in Full DMEM und warm es auf 37 ° C. </li><li> Für elektrophysiologischen Ableitungen, Pipette 500 ul von 2 pg / ml Doxycyclin-Lösung in jede Vertiefung eine endgültige Konzentration von 1 ug / ml Doxycyclin zu machen. Für Calcium Imaging, 100 &amp; mgr; l von 3 ug / ml Doxycyclin-Lösung in jede Vertiefung eine endgültige Konzen zu machention von 1 &amp; mgr; g / ml Doxycyclin. Schreiben Sie die Stunde der Induktion nach unten. </li><li> Inkubieren Sie für die gewünschte Zeitdauer für die Induktion bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 6. Kalibrieren Chronologie der Proteinexpression <ol><li> Kalibrieren Proteinexpression durch Calcium Imaging 5, 10 <ol><li> Bereiten Ringerlösung (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 20 mM HEPES, pH eingestellt auf 7,4 mit NaOH) und erwärmen auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Konzentrationen von Kanal-Agonisten in Ringer-Lösung zu sättigen. Da die Menge des Agonisten verdünnt wird, wenn sie den Calcium-Bildgebungskammern mit den Zellen und der extrazellulären Lösung, die doppelte Menge der gewünschten Endkonzentration des Agonisten zugegeben. Dies macht auch die Menge an Badlösung in jeder Vertiefung kritisch zu steuern. </li><li> Eine Lösung aus nichtionischen F-127 20% W / V in DMSO. Die Lösung wird auf 40 ° C bis nichtionogene F-127 gelöst ist. Bewahren Sie die nicht-ionischen F-127-Lösung bei RT und erwärmen auf 40 ° C vor dem Gebrauch. Nichtionogene F-127 wird verwendet dispergieren acetoxymethyl (AM) Ester von fluoreszierenden Ionenindikatoren wie Fura-2 in wässrigen Lösungen zu helfen. </li><li> Absaugen Medium und ersetzen Sie es mit Fura-02.00 Ladelösung (Ringer-Lösung, ergänzt mit 2 - 3 uM Fura-02.00, 0,02 mg / ml nicht-ionisches F-127 und 10 mM D-Glucose). </li><li> Inkubieren für 60 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Absaugen Fura-02.00 Lösung und waschen Sie die Zellen mit Ringer + 10 mM D-Glucose-Lösung extrazelluläre Farbstoff zu entfernen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Lassen Sie 200 ul Ringer + 10 mM D-Glucose-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Legen Kammer auf der Bühne über dem Mikroskop Nasenstück und befestigen Sie es mit Halter. </li><li> Schalten Sie die Lampe, Kamera und Mikroskop und wählen Sie Fura-2-Filter-Emission bei 510 nm wav zu erkennenelength. </li><li> Stellen Sie für die gewünschte Vergrößerung und Fokussierung Zellen im ausgewählten Bereich. </li><li> Im Dunkeln, Hintergrundlicht subtrahieren und Belichtungszeit einstellen. </li><li> Festlegen der Bild Sampling mit der gewünschten Geschwindigkeit und Rekordfluoreszenzantwort von Fura-2 beladenen Zellen durch Anregen sie bei 340 und 380 nm Wellenlänge. Das Verhältnis von 340/380 Signale ist ein Indikator für die intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration und damit auch für TRPV1 Aktivität. </li><li> In 2 uM Capsaicin in 200 &amp; mgr; l Ringer-Lösung durch Pipettieren eine endgültige sättigenden Konzentration von 1 &amp; mgr; M Capsaicin zu schaffen, um die Expression von TRPV1 zu bewerten. </li><li> Analysieren TRPV1 Reaktion gemäß Induktionszeit und bestimmen Protokoll für das Protein von Interesse. </li></ol></li><li> Einstellen Protein Expression in heterologen Systemen die gesamte Zellkonfiguration der Patch - Clamp - Technik unter Verwendung von 4, 11. <ol><li> bereiten ter Badlösung aus (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES und 5 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES), eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH. </li><li> Bereiten Konzentrationen von Kanal-Agonisten in der extrazellulären Lösung zu sättigen. </li><li> Ziehen Glaselektroden mit einem Innendurchmesser (ID) von 1,10 mm und Feuerpolitur auf einen Widerstand von 2 bis 4 MOhm. </li><li> Bereiten einer Pipettenlösung (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO 4, 0,5 CaCl 2, 1 EGTA und 10 HEPES , eingestellt auf pH 7,2 mit KOH. Filtern Sie die Pipettenlösung vor der Verwendung. Vor jedem Versuch, eine einzelne, feuerpolierte Glaspipette durch Eintauchen der Spitze in der Pipettenlösung für mindestens eine Minute lang gefüllt ist zurück, und dann geschmolzen und gedehnt Spitze mit einer Spritze mit der gleichen Pipettenlösung gefüllt werden. </li><li> Heben Sie vorsichtig mit einem einzigen PDL beschichtet Deck mit den plattierten Zellen aus dem Bohrloch zu einer 35 mm Petrischale aus Kunststoff mit etwa 2 ml Badlösung bei RT gefüllt. Beachten Sie unter epi-Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Suchen Sie ein EGFP positive Zelle, wie mit dem epifluoreszenten Mikroskop sichtbar gemacht, auf dem vorbereiteten Deckglas und dem Zentrum der visualisierten Bereich bewegen. </li><li> Bringen Sie die gefüllte Pipette auf die Pipettenhalter des Mikromanipulators und Injizieren einer kleinen Menge von Überdruck in das System Kontamination der intrazellulären Pipettenlösung zu vermeiden. Senken sie knapp über dem GFP - positive Zelle, für die richtige Widerstand zu prüfen. </li><li> Da die Pipette in die Zelle berührt, eine kleine Menge von Unterdruck, um eine GOhm Dichtung zwischen der Glaspipette und Zellmembran zu schaffen anzuwenden. </li><li> Mit einer kurzen, scharfen Impuls der Saug-, brechen die Zellmembran, so dass die Pipette in Kontakt mit den intrazellulären Inhalt der Zelle zu kommen. </li><li> Schalten Sie den Verstärker-Modus ganze Zelle, und senken Sie die Bessel-Filter und Ausgangsverstärkung auf 1 - 5 kHz und 0.5α sind. </li><li> Notieren Sie sich die aktuelle Antwort auf die sättigendenKonzentrationen von Kanal-Agonisten durch Spannungsrampen oder spaltfreie Protokoll. </li><li> Da die Expression Effizienz zwischen verschiedenen Proteinen verändern, wiederholen Sie die Aufnahmen unterschiedliche Induktions Länge Zeiten. </li></ol></li><li> Die Bestimmung ideale Induktionszeit für einzelne Kanalaufnahmen 4. <ol><li> Eine Lösung aus (mM) 150 Na-Gluconat, 15 NaCl, 5 EGTA, und 10 HEPES, eingestellt auf pH 7,4 mit NaOH, als Pipettenlösung. Für die Bad-Lösung, verwenden Sie die Lösung aus Schritt 6.2.1. </li><li> Wiederholen ganze Zelle Verfahren unter Verwendung von ID 0,86 mm Glaspipetten feuerpoliert auf einen Widerstand von 10 bis 12 M &amp; Omega; und legen Potential halten mV bis -40. </li><li> Erstellen Sie eine Dichtung auf der Membran wie zuvor beschrieben, und die Membran bersten. </li><li> Mit dem Mikromanipulator, heben Sie die Pipette mit der Membranfleck weg von der Zelle. </li><li> Positionieren Sie das Perfusionssystem direkt neben der Pipette mit dem Membran-Patch. </li><li> Lower tBessel er Filter und Ausgangsverstärkung auf 2 - 5 kHz und 10α sind. </li><li> Perfundieren Konzentrationen von Agonisten auf die Membranscheibe sättigt, Auswerten, ob der Patch einen oder mehrere Kanäle enthält gemäß der Antwort. </li><li> Analysieren Sie die Anzahl der Einzelkanal-Patches erfolgreich gegen die Induktionszeit auf Zellen angewendet aufgezeichnet. Stellen Sie die Induktionszeit entsprechend den gewünschten Ergebnissen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Transfection ist ein weit verbreitetes Protokoll für die Proteinexpression und Forschung, mit vielen verschiedenen Variationen Ausdruck Konsistenz und Stabilität zu verbessern. Transient Transfektionsreagentien bieten eine einfache, leicht zu verwendende Protokoll, wo die Zelle und Protein von Interesse innerhalb weniger Stunden analysiert werden können, um über Nacht aus der Zeit der Transfektion. Leider kann dieser Ansatz unberechenbar sein , wenn die Art der Analyse 2 ein einheitliches Niveau ...

Heterolog Systeme exprimierenden ist eines der am häufigsten verwendeten Techniken 1 eine Vielzahl von Zellfunktionen zu untersuchen. Ihre geringe endogene Proteinprofil, minimale Wartungsanforderungen, zuverlässige Wachstum und die Fähigkeit zur Aufnahme und zum Ausdruck bringen Fremd - DNA haben Zelllinien wie menschliche embryonale Nieren (HEK293) und chinesischen Hamsters (CHO) hergestellt fast wesentlich für die biologische Forschung 2, 3. Forschungsbereiche mit heterologe Systeme umfassen Membranproteine, intrazelluläre Signal und enzymatische Aktivität. Nach der Transfektion von Fremd - DNA in die Zelle, kann viele verschiedene Formen der Analyse durchgeführt werden, einschließlich der Elektrophysiologie, ratiometrisch Calcium Imaging, Western Blot, etc. 4, 5. Aufgrund der Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für die heterologe Expressionssysteme, viele different Reagenzien und Produkte wurden 6 dieser Zellen und ihre Qualitäten zu verwenden , entwickelt. DNA-Abgabesysteme, die vorübergehend oder dauerhaft von Fremd-DNA in die Zellen integrieren exogene Protein zu untersuchen hat für die biologische Forschung eine der beliebtesten und nützlichsten Werkzeuge geworden. Genauer gesagt transient in einer Zelle Transfizieren DNA wird als einfache, gerade nach vorne Prozess, der erfordert relativ wenig Zeit und Materialien verwendet. Darüber hinaus ist die Erfolgsrate der Zellen , die die Transfektion unterzogen 7 hoch. Diese Technik ist sehr zuverlässig , wenn sie mit einem Markergen , wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) kombiniert wird , und kann für viele verschiedene Techniken , wie Calcium Abbildungs- und Elektrophysiologie 5 verwendet werden. Doch leider kommt mit einigen großen Gefahren DNA in Wirtszellen transient exprimieren, nicht im geringsten, dass das Expressionsniveau pro Zelle unzuverlässig ist. Die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNA u gemachtp pro Zelle ist unkontrollierbar, so der Ausdruck zwischen den einzelnen Versuchen 2 stark variieren kann. Dieses Problem wird bedeutsam, wenn entweder versuchen, physiologischen Bedingungen zu replizieren, oder präzise Techniken der Datenerhebung durchführen. Als Lösung für die erwähnt haben Komplikationen oben stabile Transfektion Protokolle entwickelt worden, bei dem ein Gen von Interesse in das Genom einer Zelle unter der strengen Kontrolle eines induzierbaren Promotors eingesetzt werden kann, wie beispielsweise einem Tetracyclin-Repressor-Expressionssystem, gewährleistet eine einzige Kopie des Plasmids integriert in das Genom von jeder Zelle und wird erst nach Induktion des Transkriptionsmechanismus, beispielsweise in Gegenwart von Doxycyclin ausgedrückt. Während dies die Hindernisse inkonsistenter Proteinexpressionsniveaus löst, verliert diese Methode, um die Bequemlichkeit der schnellen und relativ einfaches Protokoll von transienten Transfektionen. eine stabile Zelllinie zur Festlegung dauert wenigstens einige Wochen in which muss man eine Tötung Kurve gesetzt durch spezifische Antibiotika kalibrieren die Proteinexpression zu erhalten und die Integration des Vektors sicherzustellen und geschickt wählen und Zellkolonien wachsen. Insgesamt dauert dies deutlich mehr Zeit und Aufwand mit einer niedrigeren Erfolgsquote 8. Hier stellen wir ein Zwischenprotokoll, das auf den Stärken der beiden bekannten Transfektion Optionen zieht eine einfache und effektive Möglichkeit zur Verfügung zu stellen, um die Expressionsniveaus in jeder induzierbaren Zelllinie zu steuern. Während Zellen, die mit einem induzierbaren Tet-System beibehalten wird, transfizieren wir transient unsere Gen von Interesse, Transient Receptor Potential Kationenkanal-Unterfamilie V Element 1 (TRPV1), in einen Vektor ligiert, der homolog mit dem Repressor-System zu kombinieren. Auf diese Weise kann das Gen in die Zellen eingeführt werden, ohne zu exprimieren beginnen. Nur mit der Zugabe von Doxycyclin beginnt das Gen zu exprimieren, uns erlaubt, die Mengen an Protein expr zu kalibrierenITZUNG nach der Technik oder in physiologischen Bedingungen beobachtet Ebenen. Unser Protokoll vermeidet auch langwierige Komplikationen im Zusammenhang mit einer stabil exprimierenden Zelllinie zu erzeugen. Wir beginnen mit den wechselnden Ebenen der TRPV1-Aktivierung in Kalzium-Imaging von nichtinduzierten über vier Stunden Induktion zeigt und wie der Anstieg der intrazellulären Kalziumspiegel korreliert. Wir dupliziert dann das Protokoll in der gesamten Zellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik, zeigt die zunehmende Strom mit der Zeit der Induktion erhöht wird. Schließlich präsentieren wir Beispiele für Einkanal Elektro Aufnahmen und zeigen, dass diese Technik für kontrollierte Expression besonders nützlich ist, wenn für eine genaue Datenerfassung auf Basis von einzelnen Einheiten des Proteins suchen. Durch unser Protokoll, bieten wir eine bequeme Möglichkeit, Protein-Expression in heterologen Systemen zu steuern, während lange Zellkultur Komplikationen vermieden werden, so dass ein Weg, um Bedingungen zwischen den Experimenten zu steuern und bieten mowieder reproduzierbare Ergebnisse.

<table><tbody><tr><td>pcDNA&Handel; 4/TO Säugetier-Expressionsvektor</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102020</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade; 5/TO Säugetier-Expressionsvektor</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR Aufreinigungskit</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Swift&trade; &nbsp; MaxPro Thermocycler</td><td>Esco&nbsp;</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsenzyme</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ER0501</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific</td><td>Fisher EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&reg; TOP10 Chemisch kompetente E. coli</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>C404006&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin (Natrium), USP Grade</td><td>Gold Bio</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypton für die Mikrobiologie</td><td>Merck</td><td>6.19305E+13</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD weltweit</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000R Inkubierter Schüttler</td><td>LAB COMPANION</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&reg; Plasmid</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS 300V Netzteil</td><td>Major Science</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>Eule&Handel; EasyCast&Handel; B1A Mini-Gel-Elektrophorese-System</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx&trade;-293 Zelllinie</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), flüssig (hoher Glukosegehalt)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&reg; Puffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade; 6/TR&nbsp; </td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS), qualifiziert, EU-zugelassen, Herkunft aus Südamerika</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Pufferlösung (1 M)</td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamin (stabil Glutamin) (200 mM)</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i CO2 Inkubator</td><td>ThermoScientific</td><td>Fisher 51026406</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Trade&trade; Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) Modifiziert, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Double Neubauer ruled Metallisiertes Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serummedium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&reg;- LT1 Transfektionsreagenz</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser, #1 Dicke, 12 mm Durchmesser rund</td><td>Knittel Glas</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&trade; Poly-D-Lysin (PDL)</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, Zellkulturqualität</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclinhyclat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM-Ester</td><td>Biotium</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&reg; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-Capsaicin</td><td>Tocris</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70 Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 Wellenlängenumschalter</td><td>Sutter Instruments</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi Blaufluoreszenzmikroskopie Kamera</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige Borosilikatschläuche</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Standardwandige Borosilikatschläuche</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Abzieher für Mikropipetten</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank Perfusionssystem</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&reg; 1440A Geräuscharmes Datenerfassungssystem</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.6 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr></tbody></table>

steuerbare ionenkanal-expression durch induzierbare transiente transfektion

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfektion die Abgabe fremder Nukleinsäuren in eine Zelle, ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der Proteinforschung. Durch dieses Verfahren können Ionenkanäle durch elektrophysiologische Analyse biochemische Charakterisierung, Mutationsstudien untersucht werden, und ihre Auswirkungen auf zelluläre Prozesse. Transienten Transfektionen bieten ein einfaches Protokoll, in dem das Protein für die Analyse innerhalb von wenigen Stunden bis Tagen verfügbar wird. Obwohl dieses Verfahren eine relativ einfache und zeitspar Protokoll stellt eine der kritischen Komponenten kalibriert wird, die Expression des Gens von Interesse zu physiologisch relevanten Niveaus oder Ebenen, die für die Analyse geeignet sind. viele verschiedene Ansätze zu diesem Zweck, die die Fähigkeit bieten, die Expression des Gens von Interesse zu steuern entstanden. Mehrere stabile Zelltransfektion Protokolle bieten eine Möglichkeit, um dauerhaft ein Gen von Interesse in das zelluläre Genom unter der Regulierung eines Tetracyclin-kontrollierten TRANSCRIP einführentionalen Aktivierung. Während diese Technik zuverlässig Expressionsniveaus erzeugt, erfordert jedes Gen von Interesse ein paar Wochen der Facharbeit einschließlich Kalibrierung eines Tötungskurve, die Auswahl der Zellkolonien und mehr Ressourcen insgesamt. Hier stellen wir ein Protokoll, das die transiente Transfektion des Transient Receptor Potential Kationenkanal-Unterfamilie V Element 1 (TRPV1) -Gens in einem induzierbaren System als eine effiziente Weise verwendet ein Protein, das in einer kontrollierten Weise zu exprimieren, die in Ionenkanalanalyse wesentlich ist. Wir zeigen, dass mit Hilfe dieser Technik können wir Kalzium-Imaging, ganze Zelle, und Einkanal-Analyse mit gesteuerten Kanalpegel für jede Art der Datensammlung mit einem einzigen Transfektion erforderlich sind. Insgesamt stellt dies eine replizierbare Technik, die verwendet werden können Ionenkanäle Struktur und Funktion zu untersuchen.

Um schnell eine induzierbare Expression Modell zu erstellen, haben wir den Einsatz von HEK293 - Zellen , die Tetracyclin - Repressor - Protein (TR) exprimieren (zB T-Rex-293) und Vektoren , die Tetracyclin - Operatorsequenzen (TetO) zwischen dem CMV - Promotor und die multiple Klonierungsstelle enthalten (beispielsweise pcDNA4 / TO). Wenn transfizierte in TReX-293-Zellen wird die Expression des Gens von Interesse in pcDNA4 / TO drückt, als TR an tetO bindet. Hinzufügen ...

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine praktische Möglichkeit zur Steuerung der Expression von Ionenkanälen in heterologen Systemen bereitzustellen, wobei langwierige Komplikationen der Zellkultur vermieden werden. Dadurch wird eine Kontrolle der Bedingungen zwischen Experimenten ermöglicht und die Erzeugung besser replizierbarer Ergebnisse gefördert. Diese Methode kann die Forschung im Bereich der Ionenkanäle unterstützen.Beispielsweise zur Charakterisierung von Kanaleigenschaften in der Pharmakologie. Da die derzeitigen Methoden entweder komplex sind oder eine inkonsistente Proteinausprägung zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir kontrollierte Expressionslevel einer breiten Vielfalt von Proteinen erreichen können, die auf individuelle Experimente zugeschnitten und innerhalb relativ kurzer Zeit erzeugt werden.Um dieses Verfahren zu beginnen, überführen Sie TREX 293-Zellen in eine 12-Loch-Platte, die zuvor mit 0,9 Millilitern vollständigem DMEM pro Loch vorbereitet wurde, um eine 50-prozentige Konfluenz zu erzielen. Inkubieren Sie die Zellen anschließend über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator. Bereiten Sie danach ein Trans

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir werden zeigen, wie man die Wirkung einer einzelnen Punktmutation auf die Funktion eines Ionenkanals zu studieren.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Quelle: Berens, C. et al. Anwendung eines induzierbaren Expressionssystems zur Untersuchung der Interferenz bakterieller Virulenzfaktoren mit der intrazellulären Signalübertragung. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video demonstriert die Verwendung eines induzierbaren Expressionssystems, um zu bestimmen, wo das bakterielle Effektorprotein CaeB die apoptotische Kaskade des Wirts stört. Es beschreibt die Schritte zur Transfektierung von CaeB-exprimierenden Zellen mit einem tetracyclin-responsiven System,...

Transfektion eines induzierbaren Genexpressionssystems in Zellen, die ein bakterielles Effektorprotein exprimieren

Dieses Video beschreibt die Methode zur Regulierung der Genexpression in kultivierten Zellen durch Transfektion mit einem Plasmid, das ein Gen von Interesse und ein regulatorisches Plasmid enthält. Die Expression dieses Plasmids kann durch Tetracyclin oder seine synthetischen Analoga gesteuert werden, was dieses System zu einem nützlichen Modell für die Untersuchung der regulierbaren Genexpression macht.

Induzierbares Tet-Off-regulierbares System: Eine In-vitro-Methode zur Modulation der Genexpression in kultivierten Zellen mit dem Tetracyclin-Off-System

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Ererbten Arrhythmien werden häufig durch Mutationen verursacht, die die Oberfläche Lieferung eines oder mehrerer Ionenkanäle verändern. Hier passen wir die Durchflusszytometrie-Assays eine Quantifizierung der relativen Gesamt und Zelloberflächenproteinexpression von rekombinanten Ionenkanäle in tsa-201-Zellen exprimiert zu liefern.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Nichtlysierende Insektenzellexpressionssysteme sind für die Produktion, Zellmigration / Lokalisierung und rekombinante Protein funktionelle Analyse nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir Verfahren, Expressionsvektoren und nachfolgende transiente Proteinexpression in kommerziell erhältlichen Lepidoptera-Zelllinien zu erzeugen. Die Co-Lokalisierung von Bemisia tabaci aquaporins mit subzellulären fluoreszierenden Markerproteinen wird ebenfalls vorgestellt.

Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Diese Arbeit beschreibt eine Methode für Hochdurchsatz-Experimente mit einem 3D-gedruckten LED-Array, um die lichtinduzierbare Genexpression in HEK293T Zellen zu optimieren.

Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

Erfahren Sie die steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transfektion in heterologen Systemen. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Proteinexpression und reproduzierbare Ergebnisse in der Ionenkanal-Pharmakologie.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

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