Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine bequeme Möglichkeit zur Kontrolle der Expression von Ionenkanälen in heterologen Systemen zu bieten und gleichzeitig langwierige Komplikationen in der Zellkultur zu vermeiden. Dies bietet eine Möglichkeit, die Bedingungen zwischen den Experimenten zu kontrollieren und replizierbarere Ergebnisse zu erzielen. Diese Methode kann dazu beitragen, die Forschung auf dem Gebiet der Ionenkanäle zu erleichtern.

Wie zum Beispiel die Charakterisierung von Kanaleigenschaften in der Pharmakologie. Da die derzeitigen Methoden entweder komplex sind oder eine inkonsistente Proteinexpression aufweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir innerhalb relativ kurzer Zeit kontrollierte Expressionsniveaus einer Vielzahl von Proteinen erreichen können, die auf einzelne Experimente zugeschnitten sind.

Um dieses Verfahren zu starten, übertragen Sie TREX 293-Zellen auf eine 12-Well-Platte, die mit 0,9 Millilitern vollem DMEM pro Well vorbereitet wurde, um eine Konfluenz von 50 Prozent zu erzeugen. Und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator. Als nächstes bereiten Sie ein Transfektionsgemisch her, das aus DMEM, dem hier gezeigten Gen von Interesse, TRPV1, einem inerten Plasmid, und dem Lipidtransfektionsreagenz besteht.

Für elektrophysiologische Experimente ist EGFP in das Säugetierexpressionsplasmid in den Transfektionscocktail aufzunehmen, um die Zellen zu visualisieren, die erfolgreich transfektioniert wurden. Inkubieren Sie die Transfektionsmischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Transfizieren Sie dann die Zellen, indem Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die plattierten Zellen in der 12-Well-Platte pipettieren.

Schütteln Sie die Platte kräftig, um eine homogene Dispersion von DNA und Transfektionsreagenz zu gewährleisten. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen anschließend über Nacht bei 27 Grad Celsius. Bestätigen Sie am nächsten Morgen, wenn Sie Elektrophysiologie durchführen, dass die Zellen erfolgreich transfiziert wurden, indem Sie das Fluoreszenzsignal von EGFP unter einer UV-Lampe beobachten.

Wenn Sie Elektrophysiologie durchführen, übertragen Sie die Zellen von der 12-Well-Platte auf PDL-beschichtete Deckgläser in 500 Mikrolitern vollem DMEM. Bei der Durchführung einer Calcium-Bildgebung sind ca. 20.000 Zellen in PDL-beschichteten Calcium-Bildgebungskammern zu erkennen. Bei diesem Verfahren wird eine Doxycyclin-Stammlösung mit einem Milligramm pro Milliliter in doppelt destilliertem Wasser hergestellt.

Schützen Sie die Stammlösung bis zu drei Wochen lang bei vier Grad Celsius vor Licht. Bewahren Sie die Doxycyclin-Stammlösung für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius auf. Bereiten Sie als Nächstes frische Doxycyclinlösung in vollem DMEM vor.

Und ihn auf 37 Grad Celsius erwärmen. Für elektrophysiologische Aufzeichnungen pipettieren Sie 500 Mikroliter Doxycyclinlösung mit zwei Mikrogramm pro Milliliter in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von Doxycyclin bei einem Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Für die Kalziumbildgebung geben Sie 100 Mikroliter Doxycyclinlösung mit drei Mikrogramm pro Milliliter in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von Doxycyclin bei einem Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Inkubieren Sie die Probe für die gewünschte Zeit für die Induktion bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Um die Proteinexpression durch Kalziumbildgebung zu kalibrieren, bereiten Sie die Ringer-Lösung vor und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius. Um die Dispergierung von AM-Estern zu unterstützen, bereiten Ionenindikatoren wie Fura-2 in quiösen Soluionen eine Lösung von nichtionischem F-127 in DMSO her.

Die Lösung auf 27 Grad Celsius erhitzen, bis sich das nichtionische F-127 aufgelöst hat. Lagern Sie dann die nichtionische F-127-Lösung bei Raumtemperatur und erwärmen Sie sie vor der Verwendung wieder auf 37 Grad Celsius. Bereiten Sie danach eine Fura-2 AM-Ladelösung aus der Ringer-Lösung vor, ergänzt mit zwei bis drei mikromolaren Fura-2 AM, 02 Milligramm pro Milliliter nichtionischem F-127 und 10 Millimolar D-Glukose.

Saugen Sie dann das Medium aus den Zellen in den Kammern ab und ersetzen Sie es durch Fura-2 AM Ladelösung. Inkubieren Sie die Zellen 60 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Aspirieren Sie anschließend die Fura-2 AM-Lösung.

Und waschen Sie die Zellen mit Ringer's und 10 Millimolar D-Glucose-Lösung, um überschüssigen zellulären Farbstoff zu entfernen. Lassen Sie jeweils 200 Mikroliter Ringer-Lösung und 10 Millimolare D-Glukoselösung darin. Und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Stellen Sie die Kammer nach 30 Minuten auf den Tisch über dem Mikroskop-Nasenstück und befestigen Sie sie mit einer Halterung. Berechnen und bereiten Sie dann eine Arbeitskonzentration des TRPV1-spezifischen Agonisten Capsaisin entsprechend der gewünschten Endkonzentration vor. Schalten Sie als Nächstes die Lampe, die Kamera und das Mikroskop ein und wählen Sie den Fura-2-Filter, um die Emission bei einer Wellenlänge von 510 Nanometern zu erkennen.

Stellen Sie die gewünschte Vergrößerung ein und fokussieren Sie die Zellen im ausgewählten Feld, indem Sie diese Parameter mit den Mikroskopknöpfen manipulieren. Im Dunkeln subtrahieren Sie das Hintergrundlicht und stellen die Belichtungszeit ein. Stellen Sie die Bildstichprobe auf die gewünschte Rate ein.

Beginnen Sie dann mit der Aufzeichnung der Fluoreszenzreaktion von Fura-2-beladenen Zellen, indem Sie sie bei Wellenlängen von 340 Nanometern und 380 Nanometern anregen. Das Verhältnis von 340 zu 380 Signalen ist ein Indikator für die intrazelluläre Calciumkonzentration und damit auch für die TRPV1-Aktivität. Fügen Sie anschließend zwei mikromolare Capsaicin in 200 Mikroliter Ringer-Lösung hinzu, um eine endgültige Sättigungskonzentration von einem mikromolaren Capsaicin zu erzeugen, um das Expressionsniveau von TRPV1 zu bewerten und die TRPV1-Reaktion zu analysieren.

Um die ideale Einführungszeit für die Einkanalaufzeichnung zu bestimmen, bereiten Sie zunächst das Bad und die Pipettenlösungen vor. Bereiten Sie dann einige Glaspipetten vor, die auf einen Widerstand von 10 bis 12 Megaohm feuerpoliert sind. Führen Sie eine Ganzzell-Patch-Klemme durch, indem Sie eine Versiegelung auf der Membran der Zielzelle erstellen.

Stellen Sie anschließend das Haltepotenzial auf minus 40 Millivolt ein. Und die Membran durch Anlegen von Unterdruck aufbrechen. Heben Sie anschließend die Pipette mit dem Mikromanipulator mit dem Mebrane-Pflaster von der Zelle weg.

Positionieren Sie dann das Profusionssystem direkt neben der Pipette mit dem Membranpflaster. Senken Sie den Bessel-Filter und die Ausgangsverstärkung auf zwei bis fünf Killahurtz bzw. 10 Ampere. Anschließend die sättigenden Konzentrationen des Agonisten auf das Membranpflaster geben.

Analysieren Sie dann die Anzahl der erfolgreich aufgezeichneten Einzelkanal-Patches im Vergleich zur Induktionszeit, die auf die Zellen angewendet wurde, und passen Sie die Induktionszeit entsprechend den gewünschten Ergebnissen an. Hier sind die pseudofarbigen Bilder von TREX 293-Zellen zu sehen, die vor und nach der Capsaicin-Applikation vorübergehend RTRPV1 exprimieren. Und hier sind die entsprechenden Veränderungen der intrazellulären Calciumspiegel im Laufe der Zeit in den behandelten, transfizierten TREX 293-Zellen.

Jedes Diagramm stellt einen Durchschnitt von 50 Zellen dar. Die Erfolgsrate des Einkanal-Patches in TRPV1-Aufnahmen hängt von der Induktionszeit ab. Hier sind die aktuellen Spuren von Patches von TREX 293-Zellen, die den RTRPV1 nach zwei Stunden und vier Stunden Induktion vorübergehend exprimieren.

Und dieses Diagramm beschreibt die Anzahl der Kanäle in einem Patch nach der angegebenen Induktionszeit. Diese Technik kann uns die Analyse eines Proteins mit kontrollierter Expression innerhalb von 12 Stunden nach der Transfektion ermöglichen, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Transfektionskonzentrationen und die Induktionszeit für verschiedene Proteine zu standardisieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein steuerbares Expressionssystem auf zeiteffiziente Weise für das Ion Ihrer Wahl herstellen können.