Name: Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton-Mikroskopie in vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp-Gerüsten zur Reparatur kritischer Knochendefekte.

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Diese Studie wurde unterstützt durch das Shenzhen Pfau Programm, China (Nr. 110811003586331), Shenzhen Basic Research-Programm (No. JCYJ20150401150223631, Nr. JCYJ20150401145529020 und Nr. JCYJ20160331190714896), Guangdong öffentliche Forschung und Kapazitätsaufbau Sonderprogramm (Nr. 2015A020212030), National Natural Science Foundation of China (Nr. 81501893), das National Major Basic Forschungsprogramm von China (2013CB945503), und die SIAT Innovationsprogramm für exzellente junge Forscher (Y5G010).

die Pflege der Tiere wurde in Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Nutzung des Labor Tiere der Provinz Guangdong. Alle Verfahren wurden unter der Aufsicht und Genehmigung der Ethikkommission für Animal Research, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences durchgeführt.
 1. Lentivirale (LV) Produktion <ol><li>Klon der Pdgf-b cDNA in einen Lentivirale Ausdruck Vektor (pLenti6/5-eGFP oder LV-eGFP) eine benutzerdefinierte Multiple-Klonen Website stromabwärts von der Zytomegalievirus Projektträger mit Spe ich und Sal Ich Restriktionsschnittstellen zu konstruieren der pLenti6/5-PDGFB-eGFP Plasmid (LV - Pdgfb) 25.</li>
	<li>Produzieren Lentivirale Partikel (LV - Pdgfb) von HEK - 293 FT Zellen durch Zusammenarbeit mit Virus Verpackung Plasmide (pLP1, pLP2 und pVSV-G) transfecting mit der standard-Calcium-Phosphat-Methode mit Chloroquin (Endkonzentration: 25 µM) 25.</li> <li>nach 48 h Transfektion, Ernte und Filtern 500 mL von Virus-haltigen überstand mit einem Filter (0,45 µm). Anschließend die Viruspartikel durch Ultrazentrifugation 89.000 x g für 2 h. Aufschwemmen in 200 µL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), aliquoten zu konzentrieren, und Lagern bei-80 ° c</li>
	<li>Ermitteln die Titer von Lentivirus, brüten HEK293T Zellen mit seriell verdünnte Lentivirale Lösung für 24 h und berechnen der Lentivirale Titer, wie zuvor beschrieben 25.</li>
</ol> 2. Herstellung von 3D-gedruckten PLGA/nHAp Gerüste und LV Immobilisierung <ol><li>auflösen 20 g der PLGA (Poly-D, L-Lactid-co-Glykolids) Material in 20 mL 1,4-Dioxan, eine homogene Lösung zu bilden. 2 g von nanoskaligen HAp (Nano-Hydroxyapatide) Pulver (nHAp) der Projektmappe hinzufügen; die PLGA: nHAp Verhältnis 10:1 (w/w) werden sollen.</li>
	<li>Gemischte Lösung kräftig rühren (rühren Drehzahl: 1.500 u/min) bei Raumtemperatur für 16 h mit einem Magnetrührer zu einer einheitlichen Paste. Fertigen sie in porösen PLGA/nHAp Gerüste mit einem 3D-Drucker Niedertemperatur-mit einer computergesteuerten Düse, die Einlagen der Paste Schicht für Schicht, von unten nach oben, nach einer vordefinierten Modell 26; die Porengrößen von den Gerüsten reichen von 200 bis 400 µm.</li>
	<li>Vakuum Gefriertrocknen Gerüste für 48 h, Lösemittel möglichst vollständig zu entfernen. Genießen Sie die Gerüste in 75 % Ethanol Lösung für 1 h für Sterilisation und neutral, aseptische Gerüste zu lyophilize. 
	Hinweis: Die wichtigsten Parameter für Vakuum Gefriertrocknung gehören die Kondensationstemperatur (° C) und Vakuumgrad (Pa). Unter einem Vakuumgrad 45 Pa, die PLGA/nHAp Gerüste wurden Vakuum gefriergetrocknet bei-78 ° C für 48 h um das Lösungsmittel gründlich zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL LV Partikel (4,5 x 10 5) zu jedem PLGA/nHAp Gerüst (4 x 4 x 2 mm) und inkubieren Sie die Gerüste für 2 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator ermöglicht Adsorption.</li>
	<li>Nach Immobilisierung, spülen Sie die Gerüste zweimal mit PBS auf ungebundene LV Partikel zu entfernen. Snap-Freeze LV Partikel-beschichtete Gerüste in flüssigem Stickstoff, wieder lyophilize und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.</li>
</ol> 3. In-vitro- Kinetik der LV Freisetzung von Partikeln von Gerüsten und LV Transduktion Activity Assay <ol><li>inkubieren 3D Gerüste (4 x 4 x 2 mm) mit LV-grün fluoreszierendes Protein (LV-eGFP, 4.5 x 10 5 LV-Partikel) in 1 mL der kompletten DMEM in kryogenen 2,0 mL Fläschchen bei 37 ° C mit Schütteln für 5 Tage.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 1 mL Probe alle 12 h 12 h bis 120 h nach Inkubation und ersetzen Sie das Medium. Zu jedem Zeitpunkt fügen Sie 1 mL frisches Medium anstelle von 1 mL der Inkubation Medium.</li>
	<li>Die gesammelten Medien nutzen, um HEK293T Zellen durch Co Inkubation für 48 h. Maßnahme die Anzahl der bioaktiven LV-Teilchen durch die Bestimmung der Anzahl der GFP-positiven HEK293T von Flow Cytometry 27 Zellen transduzieren.
	<ol><li>Vor transducing die HEK293T Zellen, entfernen Sie das Kulturmedium und spülen die HEK293T Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie das gesammelte Medium mit Lentivirus befreit die Gerüste zum Brunnen (1 mL/Na) und Kultur mit den HEK293T Zellen für 48 h bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator.</li>
	</ol></li></ol> 4. In-vitro- Bewertung von Knochenmark stammenden MSC (BMSC) Migration <ol><li>vor der Migration Test vorbereiten BMSCs Ausdruck Tomate fluoreszierenden Proteins (BMSCs-T) und PDGF-BB Protein (BMSCs-P) 28.</li>
	<li>Führen die BMSC Migration Assay mit einer Boyden Kammer mit einer 24-Well-Platte und Polycarbonat Filter mit einer Porengröße von 8 µm.
	<ol><li>Ort 0,5 mL BMSCs (5 x 10 4) mit LV ausdrücken Tomaten fluoreszierenden Proteins (BMSCs-T) in den oberen Kammern transfiziert. Platzieren Sie 0,5 mL BMSCs (2 x 10-5) mit LV mit dem Ausdruck PDGF-BB Protein (BMSCs-P) in den unteren Kammern transfiziert.</li>
	</ol></li> <li>Gehören sechs Gruppen in diesem Experiment und das untere Fach jedes gut 500 µL hinzu. 
	A. blank Kontrolle, serumfreien Medium nur B. FBS Kontrolle, mittlere ergänzt mit 10 % FBS C. PDGF-BB-Kontrolle, 4 ng/mL PDGF-BB in serumfreien Medium D. PDGF-BB nutzen PDGF-BB-Gruppe (4 ng/mL) und polyklonalen Antikörper Anti-PDGF-BB (4 ng/mL) serumfreien Medium E. BMSC Gruppe, 2 x 10 5 BMSCs in serumfreien Medium F. BMSCs-P-Gruppe, 2 x 10 5 BMSCs-P im Serum freie Mitte.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 48 Stunden bei 5 % CO 2 und 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator. Danach entfernen Sie die migrierten Zellen auf der unteren Seite der Kammer und sammeln sie für die Quantifizierung der Anzahl der BMSCs-T von Durchflusszytometrie.
	<ol><li>Entfernen migrierte Zellen auf die untere Kammer Seite mit einem Schaber Zelle und die migrierten Zellen mit 2 mL PBS aufzuwirbeln. Quantifizieren Sie die Anzahl der migrierten BMSCs-T von Flow Cytometry 29.</li>
	</ol></li></ol> 5. Einrichtung eines murinen Calvarial kritischer Mangel Knochenmodell und Gerüst Transplantation Hinweis: männliche BALB/c Mäuse (7 Wochen alt) aus Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Guangdong, China) erworben wurden.
<ol><li>Enroll insgesamt 42 männliche Mäuse für den calvarial Knochendefekt experimentieren. Nach dem Zufallsprinzip teilen die Mäuse in drei Gruppen, mit vierzehn Jahren in jeder Gruppe, die die folgenden Behandlungen erhalten: Gruppe A, keine Implantate; Gruppe B, PH-Gerüste implantiert (PLGA/nHAp); und Gruppe C, PHp Gerüste implantiert (PLGA/nHAp/LV-Pdgfb).</li>
	<li>Betäuben der Tiere mit der intraperitonealer Verabreichung von Natrium-Pentobarbital (50 mg/kg). Entfernen Sie Fell mit Enthaarungscreme Paste und reinigen Sie der Kopfhaut mit 75 % Alkohollösung vor dem ersten Schnitt. Der Leiter der jede Maus mit einem stereotaktischen Instrument zu halten, noch während der Operation zu beheben.</li>
	<li>Einen ersten Einschnitt mit einem Skalpell machen und dann vergrößern Sie es Witzh-Schere um einen linearen Hautschnitt von 1 cm zu erstellen. Kratzen der Knochenhaut vom Knochen des Schädels, die Knochenoberfläche des Schädels mit einem sterilen Wattestäbchen zu offenbaren.</li>
	<li>Mithilfe einen Trephine Grat um einen Durchmesser von 4 mm kritische Größe Defekt auf der linken Seite der Calvaria 30 zu erstellen. Das Gerüst in die Knochen-defekt-Website zu verpflanzen. 
	Hinweis: Kritische Größe Mängel (CSDs) waren ursprünglich definiert als &#34; die kleinste Größe intraossäre aufgewickelt in einem bestimmten Knochen und Tierarten, die während der Lebensdauer des Tieres nicht spontan heilen wird &#34; In diesem Experiment, 4 mm Durchmesser defekt ist eine kritische Größe Knochendefekt nach den vorher studieren 31 , 32.</li>
	<li>Verwenden ophthalmologischen Zange um das Periost wieder sanft an der Operationsstelle zu decken. Naht die eingeschnittene Haut mit drei Stichen pro cm.</li>
	<li>Postoperative Pflege durchführen. Verwalten Sie die analgetische Buprenorphin (0,1 mg/kg), Schmerzen zu lindern. Pflegen Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen, bis das Tier erwacht. Danach füttern Sie die Tiere mit Futter und Wasser und zeichnen Sie ihre Aktivitäten jeden Tag bis zum Ende des Tests. Hinweis: Analgesie kann verabreicht werden, vor dem Eingriff abhängig von Ihrem lokalen Tierpflege Ausschuss Leitlinien.</li></ol> 6. In Vivo Bildgebung der Angiogenese innerhalb der Knochendefekt mit MPM Hinweis: FITC konjugiert 250 kD Dextran (10 mg/mL) in Kochsalzlösung wurde intravenös injiziert in Mäuse zu hoher SNR (Signal-Rausch-Verhältnis) Bilder von neuen Blutgefässen zu erhalten nach einer früheren Studie 33. Bitte beachten Sie, dass dies ein Überleben Verfahren. <ol><li>bauen die multiphoton Mikroskopie (MPM) System für zwei-Photonen aufgeregt Fluoreszenz (TPEF) und zweiten harmonischen Generation Signal (SHG) Imaging.</li>
	<li>Betäuben der Tiere eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg) und die Tiere auf eine Heizplatte, ihre Körpertemperatur auf 37 ° C während der Experimente zu immobilisieren. Verwenden Sie 3,0 % Isofluran Gas in 100 % Sauerstoff in den imaging-Prozess weiterhin zufriedenstellende Anästhesie und Analgesie. Intraperitoneale Injektion Kochsalzlösung (200 µL/Tier) um Austrocknung vor Bildgebung zu verhindern.</li>
	<li>Melodie der Femtosekunden Ti-Saphir-Laser auf 860 nm. Erstellen Sie eine 512 x 512 µm Stichprobenraum durch Scannen von ein paar Galvo-Spiegel und verwenden NA1.0 eintauchen in Wasser Objektiv Focusthe Erregung Strahl in die Probe und das rückgestreute Signal TPEF/SHG zu sammeln. 
	Hinweis: Die Bildgebung erfolgte auf einem Heim-Build multiphoton mikroskopischen imaging System (MPM). Während der Aufnahme, ein Femtosekunden Ti-Saphir-Laser wurde abgestimmt auf 860 nm als optimale Erregung Wellenlänge. Der Laserstrahl wurde Raster über ein Probe-Flugzeug mit einem Paar von Galvanometer Spiegel gescannt. Nach dem Durchlaufen eines dichroitischen Spiegels von 685 nm, der Strahl konzentrierte sich auf die Probe durch ein 20 X NA1.0 Ziel. Die induzierte TPEF und SHG-Signale wurden durch den gleichen Zweck gesammelt. Die Signale wurden vom Laser Erregung durch die dichroitischen Spiegel oben erwähnt und durch einen 680 nm-kurz-Pass-Filter gereinigt aufgeteilt. Die TPEF und SHG-Signale wurden von einem Faserbündel gesammelt und führte zu einem Spektrographen. Der Detektor auf der Spektrograph wurde eine lineare Anordnung von Photomultiplier Tubes (PMTs). Die Kombination von Spektrographen und linear-Array PMTs angeboten die Möglichkeit, das Signal aufzeichnen in 16 aufeinanderfolgenden Spektralbändern von 400 nm bis 600 nm, 12,5 nm Abständen. Daher wurden die TPEF und SHG-Signale gleichzeitig erkannt und in spektralen Bereichen getrennt. Darüber hinaus nutzte ein axialer Motor für 3D-Bildgebung, die bildgebende Tiefe steuern. Bereich der jedes Bild war auf 512 x 512 µm, und das tiefe Intervall war bis 2 µm (Kontrollgruppe, 5 µm) eingestellt. Insbesondere, 5 Seiten auf jeden Fehler wurden abgebildet, um statistisch signifikante Daten zu sammeln, und die ausgewählten bildgebenden Sites verteilten sich gleichmäßig und zufällig entlang des Mangels.</li>
	<li>Scan 5 Seiten auf jeden Fehler statistisch signifikante Daten zum Schiff Bildung Messen sammeln.
	<ol><li>Verwendung Scan Seiten gleichmäßig und zufällig verteilt entlang des Mangels. Für die Kontrollgruppe haben das Sichtfeld (FOV) Abdeckung der ursprünglichen Knochenbereich und dem Rand des Mangels anzuzeigen, aber für den pH-Wert und PHp Gruppen der FOV auf dem implantierten Schafott.</li>
		<li>Machen einen 1 cm linear Hautschnitt mit einem Skalpell und Naht die offene Haut die Fixierung die Transplantation Website offenbaren. Eine Spritze, um einen Tropfen Wasser zwischen dem DIP Objektiv und Transplantationen bilden ein Wasserglas zu platzieren verwenden.</li>
	</ol></li> <li>Acquire Bild stapelt alle 12 s über eine 2 h imaging-Periode. Anzeigen und analysieren volumetrische Daten mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Programm und quantifizieren die Blutgefäß-Bereiche mit ImageJ Software 34 , 35.</li>
</ol> 7. Gene Expression Analysis von Pdgf-b und Angiogenese-Genen durch RT-qPCR Hinweis: PCR wurde nach den üblichen Schritten durchgeführt: 95 ° C für 30 s, 40 Zyklen von 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 30 S. Post-PCR-schmelzen Kurven bestätigt die Besonderheit des einzelnes Ziel Verstärkung, und die Falte Veränderung des Gens von Interesse im Vergleich zu β-Aktin bestimmt war. Die Reaktion für jede Probe wurde dreimal getestet.
<ol><li>Ernte implantiert, Gerüste und Gewebe aus der experimentellen Mäuse bei 2, 4 und 8 Wochen nach der Operation 36; Kontrollproben Gruppe (n = 4), zu den gleichen Zeitpunkten genommen, von benachbarten Knochengewebe sollte. 
	Hinweis: Zu jedem Zeitpunkt (2, 4 und 8 Wochen), die Mäuse mit CO 2 Inhalation eingeschläfert. Sezieren die Calvaria, anschließend entfernen und ernten die implantierten Gerüste aus der Calvaria.</li>
	<li>Eine kommerzielle Reagenz verwenden, um die Gesamt-RNS von jeder Probe nach Angaben des Herstellers zu extrahieren &#39; s-Protokoll. Die Reverse Transkription-Kit verwenden, um umzukehren-Transkription die RNA in cDNA nach Hersteller &#39; s Protokoll.</li>
	<li>Führen quantitative Real-Time PCR mit SYBR Green Detection System; die Primer sind in Tabelle 1 aufgeführten.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td colspan="8"> Primer(5&#39;&#8211;3&#39;)</td></tr> <tr><td colspan="2" rowspan="1"> gen</td>
			<td colspan="2" rowspan="1"> nach vorn</td>
			<td colspan="4" rowspan="1"> umgekehrte</td></tr>
		<tr><td>Pdgfb</td> <td colspan="3"> CATCCGCTCCTTTGATGATCTT</td> <td colspan="4"> GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT</td></tr>
		<tr><td>vWF</td> <td colspan="3"> CTCTTTGGGGACGACTTCATC</td> <td colspan="4"> TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC</td></tr>
		<tr><td>VEGFR2</td> <td colspan="3"> GAAATGACACTGGAGCCTACA AG</td> <td colspan="4"> TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G</td></tr>
		<tr><td>β-Aktin</td> <td colspan="3"> GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG</td> <td colspan="4"> GCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT</td></tr></tbody>
</table> Tabelle 1: Pimer Sets.
 8. MicroCT-Analyse der Knochenregeneration <ol><li>einschläfern Mäuse mit CO 2 Inhalation bei 8 Wochen nach der Operation. In einer gut belüfteten Umgebung sanft jede Maus in einen Käfig sauber Maus zu platzieren und Pumpen CO 2-Gas in den Käfig zu betäuben die Mäuse vor der Euthanasie.</li>
	<li>Sezieren den Schädel für die MicroCT Darstellung von der Knochen-defekt-Region. Benutzer der folgenden Scan-Parameter in den Experimenten: 9 µm Auflösung, Al-0,5 mm-Filter, 50 kV Spannung und aktuellen 142 µA.</li>
	<li>Reconvon der Gesellschaft erbrachten Struct alle Bilddaten mit kommerzieller Software. Kalibrieren Sie die Scans mit der Kalibrierfunktion einer CTAn-Software. 
	Hinweis: Stellen Sie ein Hounsfield Gerät (HU) unter die Mäuse in jedem Scan.</li>
</ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Knochen ist ein stark vaskularisierte Gewebe mit einer einzigartigen Kapazität kontinuierlich zu heilen und während der gesamten Lebensdauer eines einzelnen1umzugestalten. Das Niveau der Vaskularisierung ist wichtig für Osteogenesis und defekt Reparatur. Niedrige Vaskularisierung begrenzt die breite klinische Anwendung von Tissue-Engineering Knochen. Bau eines stark vaskularisierte Tissue-Engineering Knochens nach der Theorie der Bionik ist ein Werkzeug für die Reparatur von Knochendefekten großes...

Knochen ist ein stark vaskularisierte Gewebe, die auch weiterhin während der Laufzeit eines einzelnen1umzugestalten. Die schnelle und effektive Knochenregeneration von großen Knochendefekten infolge Trauma, Pseudarthrose, Tumor Resektionen oder kraniofaziale Fehlbildungen ist ein komplexer physiologischer Vorgang. Traditionelle therapeutische Ansätze verwendet für Knochen defekt Reparatur Autotransplantation und Allograft-Implantierung unter anderem ihre Verwendung umfasst mehrere Probleme und Einschränkungen, z. B. begrenzte Verfügbarkeit, wichtiger Geber Website Morbidität, ein hohes Risiko der Infektion, und Hosten Sie Immunabwehr2,3. Künstliche Knochentransplantate bieten jedoch eine effiziente Alternative um diese Einschränkungen zu lindern. Sie können aus biologisch abbaubaren Materialien hergestellt werden, sind einfach zu fabrizieren werden mit einer geeigneten Porengröße und können genetisch veränderten4,5.
Verschiedene Gewebe-engineering-Gerüste sind derzeit in der Entwicklung von Tissue-Engineering Knochen6,7eingesetzt worden. Knochen-Reparatur und Regeneration effektiver induzieren, veränderte Biomaterialien kombiniert mit Wachstumsfaktoren entstanden und erzielt gute Ergebnisse8,9. Leider begrenzen die kurze Halbwertszeit, leicht zu verlieren-Aktivität und Supraphysiological Dosierung von Wachstumsfaktoren für die therapeutische Wirksamkeit ihrer klinischen Anwendung10. Um diese Probleme zu überwinden, wurde die Lieferung von Wachstumsfaktor Genen anstelle von Wachstumsfaktoren als einen wirksamen Ansatz zu Bioaktivität zur Behandlung von knöcherner Defekte und Krankheiten11,12nachgewiesen. Virale Vektoren sind vielversprechende Lieferung Werkzeuge für die Geweberegeneration aufgrund ihrer hohen Effizienz13zum Ausdruck zu bringen.
Unter den Wachstumsfaktoren wurde Platelet-derived Wachstumsfaktor (PDGF-BB) in dieser Studie ausgewählt, weil es nicht nur ein Mitogen und Lockstoffgradient für mesenchymale und osteogene Zellen, sondern auch ein Stimulans für Angiogenese14,15 ist . Präklinische und klinische Studien zeigten, dass PDGF-BB Knochen Reparatur parodontalen knöcherner Defekte16,17sicher und effektiv fördern könnte. Neuere Studien gezeigt, dass PDGF-BB Angiogenese durch motivierende Endothelzellen Migration und Proliferation in Vivo18,19stimuliert. Außerdem kann PDGF-BB auch mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in der Lage, Differenzierung in Endothelzellen20, und diese weitere Highlights die potenzielle Rolle von MSCs in Neovaskularisation machen. Induzieren die de Novo Bildung des Gefäßsystems in Gerüste mit PDGF-BB ist daher ein wichtiger Schritt für die Reparatur von Gewebe zu Gerüste in Knochen Gewebe-Engineering entwickelt.
Knochenheilung defekt ist ein dynamisches Gewebe morphogenetischen Prozess, der koordinierte Osteogenesis und Angiogenese bei der Reparatur von Positionen21erfordert. Neoangiogenese in implantierten Tissue-Engineering Gerüste ist eine wesentliche Voraussetzung für die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff für Wachstum und überleben und zum Entfernen von Stoffwechselschlacken. Häufig verwendet, bildgebende Verfahren, berechnete Mikro-einschließlich Röntgen Computertomographie (MicroCT), Magnet-Resonanz-Tomographie (MRI), Rasterelektronenmikroskopie (SEM), Optische Kohärenztomografie (OCT) und konfokale Laser-scanning-Mikroskopie, anstelle von angewendet werden histologische Untersuchung Angiogenese Informationen22,23zu erhalten. Diese Methoden stehen jedoch verschiedene Hindernisse zu visualisieren und Neovasculature in 3D Gerüste im Knochen Tissue Engineering zu messen. Multiphoton Mikroskopie (MPM) ist eine vergleichsweise neue Bio-Imaging-Technik, die den entscheidenden Vorteil gleichzeitig Zellen, extrazelluläre Matrix, die Visualisierung und die umliegenden vaskulärer Netzwerken hat in-vivo. Es besitzt eine inhärente dreidimensionale Bildgebung Fähigkeit für tiefe Gewebe eindringen und verursacht geringe lichtbedingten. Daher hat MPM in den letzten zehn Jahren viel Aufmerksamkeit in biomedizinischen Studien24, darunter in Neurowissenschaften, Immunologie und Stammzellen Dynamik gewonnen. Es ist jedoch kaum in der orthopädischen Forschung verwendet.

<table><tbody><tr><td>Poly(D,L-Lactid-co-glycolide) (PLGA)</td><td>Sigma</td><td>P1941</td><td>L/G-Verhältnis 75:25, MW 66000-107000</td></tr><tr><td>Hydroxylapatit-Nanopartikel</td><td>Sigma</td><td>702153</td><td>Mittlerer Durchmesser < 200 nm</td></tr><tr><td>Chloroquindiphosphatsalz</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes 250-kD-Dextran</td><td>Sigma</td><td>FD250S</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dioxan-Lingfeng</td><td>, Shanghai</td><td></td><td>0,45 Mikron</td></tr><tr><td>Stericup filtert</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB Cdna</td><td>Sino Biological, Inc</td><td>MZ50801-G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDGF-BB Maus polyklonaler Antikörper</td>&<td>nbsp; BioVision, Inc</td><td>5489-30T</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB Rekombinantes Protein</td><td></td><td>4489-50</td><td></td></tr><tr><td>Calcium-Phosphat-Transfektionslösung</td><td>Promega Corporation</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>L-DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td> Penicillin-Streptomycin<td></td></tr><tr><td>, Flüssigkeit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Transwell&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>Männliche BALB/c-Mäuse</td><td>Guangdong Medical Laboratory Animal Center&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Pentobarbital&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1063180500</td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskopie</td><td></td><td></td><td>Eine in den Shenzhen Institutes of Advanced Technology hergestellte Mikroskopie zur Detektion von zwei-photonenangeregter Fluoreszenz (TPEF) und Second-Harmonic-Generation-Signal (SHG).</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Keyuan, Shandong</td><td>401750169</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin und Eosin</td><td>Beyotime</td><td>C0105</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Leica & nbsp;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge OPtima L-100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Niedertemperaturdrucker&nbsp;</td><td>Tsinghua Universität</td><td></td><td>Ein selbstgemachtes</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument an</td> der Tsinghua Universität&nbsp;<td>Roche</td><td>5815916001</td><td></td></tr><tr><td>microCT</td><td>Bruker</td><td>1176</td><td></td></tr><tr><td>kommerzielle Software</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von angiogenese durch multiphoton mikroskopie in vivo in gentechnisch veränderten 3d-plga/nhap gerüst für calvarial kritische knochen defekt reparatur

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Die Rekonstruktion der kritisch große Knochendefekte bleibt ein ernstes klinische Problem wegen schlechten Angiogenese im Tissue-Engineering Gerüste während der Reparatur, die führt zu einem Mangel an ausreichender Blutversorgung und Nekrose des neuen Gewebes verursacht. Rasche Vaskularisierung ist eine wesentliche Voraussetzung für das neue Gewebe überleben und Integration mit bestehenden Wirtsgewebe. Die de-Novo -Generation des Gefäßsystems in Gerüste ist einer der wichtigsten Schritte bei der Herstellung Knochenregeneration effizienter, so dass Reparatur Gewebe in ein Gerüst zu wachsen. Um dieses Problem zu lösen, wird die gentechnische Veränderung von einem Biomaterial Gerüst zur Angiogenese und Osteogenesis beschleunigen. Allerdings ist Visualisierung und tracking in Vivo Blutgefäß-Bildung in Echtzeit und im dreidimensionalen (3D) Gerüste oder neues Knochengewebe noch ein Hindernis für das Bone Tissue Engineering. Multiphoton Mikroskopie (MPM) ist eine neuartige Bio-Imaging-Modalität, die volumetrische Daten aus biologischer Strukturen in hoher Auflösung und minimal-invasive Weise erwerben kann. Ziel dieser Studie war es, Angiogenese mit multiphoton Mikroskopie in Vivo in einer gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für die calvarial kritische Knochen defekt Reparatur zu visualisieren. PLGA/nHAp Gerüste wurden für die nachhaltige Lieferung eines Wachstumsfaktors Pdgf-b Gens tragen Lentivirale Vektoren (LV -Pdgfb) Angiogenese zur Erleichterung und Verbesserung der Knochenregeneration funktionalisiert. In einem Gerüst-implantierten calvarial kritische Knochen defekte Maus-Modell, die Blutgefäß-Bereiche (BVAs) in PHp Gerüste waren deutlich höher als bei PH-Gerüste. Darüber hinaus erhöht sich der Ausdruck von Pdgf-b und Angiogenese-Genen, vWF und VEGFR2, entsprechend. MicroCT-Analyse ergab, dass die Knochenneubildung in der PHp Group erheblich verbessert im Vergleich zu den anderen Gruppen. Unseres Wissens ist dies das erste Mal multiphoton Mikroskopie im Knochen Gewebe-Engineering verwendet wurde, um die Angiogenese in einem 3D biologisch abbaubaren Gerüst in Vivo und in Echtzeit zu untersuchen.

Zylindrischen porösen PLGA/nHAp Gerüste in der Höhe 0,6 mm und 4 mm im Durchmesser mit einem 3D-Drucker hergestellt wurden. Die Morphologien der Gerüste wurden per scanning Electron Microscopy und MicroCT analysiert. Abbildung 1A zeigt das Foto von dem implantierten Gerüst. Scannen von MicroCT ergab, dass mehr als 85 % der Poren Größen von 200 bis 400 µm (Abbildung 1 b) hatte. SEM Bildgebung gezeigt, dass die Oberfläche des Gerüstes hatte eine grobe Struk...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Blutgefäß Bildung in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit in 3D Gerüste multiphoton Mikroskopie. Angiogenese in gentechnisch veränderten Gerüste wurde in einem murinen calvarial kritische Knochen-defekt-Modell untersucht. Mehr neue Blutgefäße waren in der Behandlungsgruppe als Kontrollen erkannt.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die in vivo-Bildung von Blutgefäßen in dreidimensionalen Gerüsten in Echtzeit mittels Mehrphotonenmikroskopie zu visualisieren. Diese Messungen beantworten eine zentrale Frage im Bereich der Knochenregeneration, nämlich wie man die in vivo-Bildung von Blutgefäßen in dreidimensionalen Gerüsten in Echtzeit hemmen und nachvollziehen kann. Ein Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie es ermöglicht, CERES, extrazelluläre Matrixen und umgebende molekulare Netzwerke gleichzeitig in vivo zu hemmen.Bereiten Sie zunächst eine homogene Lösung mit 20 Gramm PLGA und 20 Milliliter 1,4-Dioxan vor. Fügen Sie anschließend zwei Gramm pulverisiertes nHAP zu der Lösung hinzu. Mischen Sie die Suspension unter Verwendung eines magnetischen Rührers 16 Stunden lang kräftig bei 1500 U/min bei Raumtemperatur, um eine gleichmäßige Paste zu erhalten, die zum Drucken poröser PLGA-nHAP-Gerüste verwendet wird.Nach dem Druck die Gerüste 48 Stunden lang gefriertrocknen, um jegliches Lösungsmittel vollständig zu entfernen. Anschließend sterilisieren sie eine Stunde lang in 75 Prozentigem Ethanol. Danach erneut lyophilisieren, um neutrales, antiseptisches Material zu erhalten.Fügen Sie anschließend vier Komma fünf mal zehn hoch fünf Lentiviren-Partikel zu jedem Scaffold hinzu und lassen Sie die Partikel in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius zwei Stunden lang absorbieren. Nachdem die Lentiviren-Partikel auf den Scaffolds absorbiert wurden, waschen Sie die Scaffolds zweimal mit zwei Milliliter PBS, um ungebundene Rückstände zu entfernen. Frosten Sie die gewaschenen Scaffolds durch kurzzeitiges Eintauchen in flüssigen Stickstoff ein.Und nach erneuter Lyophilisierung lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für weitere Untersuchungen. Überführen Sie 3D-Scaffolds, die zuvor mit 4,5 × 10⁵ Lentivirenpartikeln, die das grün fluoreszierende Protein tragen, beschichtet wurden, in 2,0-mL-Kryoröhrchen, die mit einem Milliliter vollständigem DMEM gefüllt sind, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für fünf Tage. Alle zwölf Stunden der Inkubation entnehmen Sie je ein Milliliter Probe des Mediums, das die von den Scaffolds freigesetzten Lentivirenpartikel enthält, und ersetzen Sie diese durch ein Milliliter frisches Medium.Um HEK293T-Zellen zu transduzieren, entfernen Sie zunächst das Medium von in einer 12-Loch-Platte kultivierten HEK293T-Zellen und waschen die Zellen zweimal mit PBS. Geben Sie dann ein Milliliter des zuvor gesammelten Mediums zu den gewaschenen HEK293T-Zellen hinzu und inkubieren Sie die Platte 48 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator. Nach 48-stündiger Inkubation bestimmen Sie die Anzahl der GFB-positiven HEK293T-Zellen mittels Durchflusszytometrie, um die Zahl der bioaktiven Lentivirenpartikel zu ermitteln.Zunächst werden C57 Black Six-Mäuse zufällig in drei Behandlungsgruppen aufgeteilt: Kontrolle, PH und PHp mit jeweils 14 Tieren. Die Haut auf dem Kopf einer anästhesierten Maus wird rasiert und die Oberfläche mit einer Jodtinktur und anschließend mit einer 75-prozentigen Alkohollösung desinfiziert. Der Kopf der Maus wird in ein stereotaktisches Instrument gelegt, die Haut wird mit einem Skalpell angehoben und anschließend mit einer Schere ein ein Zentimeter langer linearer Schnitt angelegt.Mithilfe eines sterilen Wattestäbchens das Periost vom Schädelknochen abkratzen, um dessen Oberfläche freizulegen. Anschließend auf der linken Seite des Schädels mit einem Trepanationsbohrer einen kritischen Defekt mit vier Millimeter Durchmesser anlegen. Den Scaffold in den Knochendefekt einpflanzen.Verwenden Sie Augenoperationsscheren, um die Operationsstelle vorsichtig mit dem Periost zu bedecken. Anschließend schließen Sie die Wunde, indem Sie drei Stiche pro Zentimeter Inzision anlegen. Verabreichen Sie abschließend das Analgetikum Buprenorphin, um postoperative Schmerzen zu kontrollieren, und halten Sie das Tier auf einer Heizplatte, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, bis es das Bewusstsein wiedererlangt.Wenn die Maus das Bewusstsein zurückerlangt, stellen Sie ihr Futter und Wasser zur Verfügung und überwachen Sie ihre tägliche Aktivität bis zum Ende des Experiments. Nachdem das Multiphotonen-Mikroskopie-System für TPEF- und SHG-Aufnahmen zusammengestellt wurde, stellen Sie den Femtosekunden-Titansaphir-Laser auf 860 Nanometer ein. Um neu gebildete Blutgefäße sichtbar zu machen, injizieren Sie der Maus intravenös 200 µL einer Dextran-Lösung mit 10 mg/mL in physiologischer Kochsalzlösung und fixieren Sie das anästhetisierte Tier dann mit Hilfe des stereotaktischen Instruments auf einer Heizplatte, um die Körpertemperatur bei 37 °C zu halten.Spritzen Sie der Maus 200 Mikroliter Kochsalzlösung intraperitoneal ein, um Dehydration zu verhindern. Geben Sie dem Tier abschließend eine dreiprozentige Mischung aus Isofluran in 100 Prozent Sauerstoff, um während der Bildgebung eine ausreichende Anästhesie und Analgesie aufrechtzuerhalten. Um mit der Bildgebung zu beginnen, scannen Sie ein Paar Galvanospiegel, um einen Abtastbereich von 512 mal 512 Mikrometer zu erzeugen.Danach unter Verwendung eines NA 1,0-Wasser-Immersion-Objektivs den Anregungsstrahl auf der Probe fokussieren und das rückgestreute TPEF-HSG-Signal sammeln. Das Sichtfeld so einstellen, dass es den gesunden Knochenbereich und den Rand des Defekts in der Kontrollgruppe abdeckt, bei der Bildgebung von Tieren der PH- oder PHp-Gruppe hingegen nur das implantierte Gerüst erfasst wird. Anschließend fünf verschiedene Stellen des Defekts abscannen.Nehmen Sie Bildstapel im Abstand von jeweils 12 Sekunden über einen Zeitraum von zwei Stunden auf. Dargestellt ist hier eine Fotografie des mit der 3D-Drucktechnik hergestellten Gerüsts sowie ein Mikro-CT-Bild, das die Gesamtporosität des hergestellten Materials zeigt. Die mikroporöse Struktur des Gerüsts wird in einem REM-Bild gezeigt, das mit 5000-facher Vergrößerung aufgenommen wurde.Wie gezeigt, exprimierten HEK293T-Zellen, die mit Medium behandelt wurden, das lentivirale Partikel enthielt, die von den Gerüsten freigesetzt wurden, effizient das grün fluoreszierende Protein. Wie mittels Durchflusszytometrie geschätzt wurde, erreichte die Gesamtanzahl der freigesetzten Partikel etwa 40 Prozent. Der stärkste Freisetzungseffekt wurde innerhalb der ersten 24 Stunden der Studie beobachtet und nahm im Verlauf der Zeit allmählich ab, was bestätigt, dass auf den Gerüsten beschichtete lentivirale Partikel ihre biologische Aktivität bis zu 96 Stunden beibehalten.Die in vivo-Analyse der Blutgefäße, die sich innerhalb eines kalvarialen Knochendefekts gebildet hatten, zeigte, dass neue Blutgefäße, obwohl sie in der Kontrollgruppe von Mäusen nicht nachweisbar waren, acht Wochen nach der Transplantation des Scaffolds in beiden Gruppen PH und PHp deutlich sichtbar waren. Zusätzlich wurden sowohl in der PH- als auch in der PHp-Gruppe zahlreiche Kollagenablagerungsstellen nachgewiesen, doch nur in der PHp-Gruppe ließen sich zunehmend kleinere Gefäße beobachten, die in die Scaffolds hineinwuchsen, und die gesamte Blutgefäßfläche unterschied sich signifikant. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, den Kopf der Maus zu fixieren, um Bewegungen während der Aufnahme zu vermeiden und so Artefakte zu verhindern. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die photoakustische Bildgebung angewendet werden, um zusätzliche Daten, beispielsweise Bilder von tieferen Gewebeschichten, zu erhalten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Knochenregeneration den Weg, um die Angiogenese in Transplantaten zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die in vivo Plasma-Bildung in 3D-Scaffolds in Echtzeit sowie die Mikrophotonen-Mikroskopie visualisieren kann.

visualizing-angiogenesis-multiphoton-microscopy-vivo-genetically

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Konstruierte Klappen erfordern ein integriertes funktionelles Gefäßnetzwerk. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung einer 3D-gedruckten Gewebeklappe vor, die ein hierarchisches Gefäßnetzwerk und seine direkten mikrochirurgischen Anastomosen an der Oberschenkelarterie der Ratte enthält.

Herstellung von technischen Gefäßklappen mit 3D-Drucktechnologien

Ein In-vitro-Modell der Gefäßnische des Knochenmarks wird erstellt, indem mesenchymale und endotheliale Zellen auf vorgegossene 3D-PEG-Hydrogele gesät werden. Die endothelialen Netzwerke, die EZM-Komponenten und die ALP-Aktivität der Nischen variieren je nach verwendetem Wachstumsfaktor. Die Plattform kann für fortgeschrittene Krebsmodelle verwendet werden.

Einfache Etablierung einer vaskularisierten osteogenen Knochenmarksnische unter Verwendung von vorgegossenen Poly(ethylenglykol) (PEG)-Hydrogelen in einer bildgebenden Mikrotiterplatte

In dieser Arbeit werden der zweidimensionale (2D) Scratch Wound Migration Assay und der dreidimensionale (3D) Sphäroid-Sphäroide-Assay zusammen mit ihren jeweiligen nachgeschalteten Analysemethoden, einschließlich RNA-Extraktion und Immunzytochemie, als geeignete Assays zur Untersuchung der Angiogenese in vitro vorgestellt.

Untersuchung der Angiogenese auf funktioneller und molekularer Ebene durch Nutzung des Scratch Wound Migration Assay und des Spheroid Sprouting Assay

Die Intravitalmikroskopie ermöglicht die Untersuchung dynamischer biologischer Prozesse wie Geweberegeneration und Tumorentwicklung. Das Schädeldachknochenmark, ein hochdynamisches Gewebe, bietet Einblicke in die Blutbildung und Gefäßfunktion. Die Verwendung eines biokompatiblen 3D-gedruckten Kopffixationsimplantats ermöglicht eine repetitive Längsbildgebung und verbessert so unser Verständnis der Gewebedynamik und der Mikroumgebung des Tumors.

Intravitale longitudinale Bildgebung der Gefäßdynamik im Schädeldachknochenmark

Die Keimangiogenese, die für Entwicklung und Krankheit von grundlegender Bedeutung ist, umfasst komplexe molekulare und mechanische Prozesse. Wir präsentieren ein vielseitiges 2,5D-ex vivo-Modell , das das zelluläre Keimen aus Schweine-Halsschlagadern analysiert und dabei die steifigkeitsabhängige Angiogenese und die ausgeprägte Leader-Follower-Zellmechanik aufdeckt. Dieses Modell hilft bei der Weiterentwicklung von Tissue-Engineering-Strategien und Krebstherapieansätzen.

2.5D-Modell zur ex vivo mechanischen Charakterisierung der Keimangiogenese in lebendem Gewebe

Lernen Sie die Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton-Mikroskopie in vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp-Gerüsten zur Reparatur kritischer Knochendefekte.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur (Video) | JoVE Journal

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

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