Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die In Vivo Blutgefäßbildung in dreidimensionalen Gerüsten in Echtzeit durch Multiphotonenmikroskopie sichtbar zu machen. Diese Messungen sind Schlüsselfragen im knochenbildenden Bereich, wie z.B. wie die Bildung von Blutgefäßen in vivo in dreidimensionalen Gerüsten in Echtzeit neutralisiert und ausgetrickst werden kann. Der einzige Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, CERES, extrazelluläre Metriken und umgebende molekulare Netzwerke in vivo gleichzeitig zu neutralisieren.

Bereiten Sie zunächst eine homogene Lösung vor, die 20 Gramm PLGA und 20 Milliliter 1,4 Dioxan enthält. Geben Sie dann zwei Gramm pulverisiertes nHAP in die Lösung. Mischen Sie die Suspension mit einem Magnetrührer 16 Stunden lang bei 1500 U/min bei Raumtemperatur kräftig, um eine gleichmäßige Paste zu bilden, die zum Drucken von porösen PLGA-NHAP-Gerüsten verwendet wird.

Trocknen Sie die Gerüste nach dem Drucken 48 Stunden lang in Frost, um alle Lösungsmittel vollständig zu entfernen. Und sterilisieren Sie sie dann eine Stunde lang in 75 Prozent Ethanol. Anschließend lifalysieren Sie sie erneut, um neutrales, antiseptisches Material zu erhalten.

Geben Sie anschließend vier Komma fünf mal 10 bis zum Fünftel der lentiviralen Partikel zu jedem Gerüst und lassen Sie die Partikel in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius zwei Stunden lang absorbieren. Jetzt, da lentivirale Partikel auf den Gerüsten absorbiert wurden, waschen Sie die Gerüste zweimal mit zwei Millilitern PBS, um ungebundene Rückstände zu entfernen. Frieren Sie die gewaschenen Gerüste in flüssigem Stickstoff ein.

Und nach dem erneuten Lifalysieren lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für weitere Studien. Übertragen Sie 3D-Gerüste, die zuvor mit vier Komma fünf mal zehn beschichtet waren, auf das fünfte lentivirale Partikel mit grün fluoreszierendem Protein in kryogenen Zwei-Punkt-Null-Fläschchen, die mit einem Milliliter vollständigem DMEM gefüllt sind, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für fünf Tage. Entnehmen Sie alle zwölf Stunden der Inkubation einen Milliliter Proben des Mediums, das lentivirale Partikel enthält, die von den Gerüsten freigesetzt werden, und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter frisches Medium.

Um HEK293T Zellen zu transduzieren, entfernen Sie zunächst das Medium von HEK293T Zellen, die in einer 12-Well-Platte kultiviert wurden, und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Geben Sie dann einen Milliliter des zuvor gesammelten Mediums in die gewaschenen HEK293T Zellen und inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator. Messen Sie nach 48 Stunden Inkubation die Anzahl der GFB-positiven HEK293T Zellen durch Durchflusszytometrie, um die Anzahl der bioaktiven lentiviralen Partikel zu bestimmen.

Zu Beginn teilen Sie C57 schwarze sechs Mäuse nach dem Zufallsprinzip in drei Behandlungsgruppen auf: Kontrolle, PH und PHp von jeweils 14 Tieren. Rasieren Sie die Haut am Kopf einer betäubten Maus und desinfizieren Sie die Oberfläche mit einer Jodtinktur und dann einer 75-prozentigen Alkohollösung. Platzieren Sie den Kopf der Maus in ein stereotaktisches Instrument, messen Sie die Haut mit einem Skalpell und machen Sie dann mit einer Schere einen linearen Schnitt von einem Zentimeter.

Kratzen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen das Periost vom Schädelknochen ab, um seine Oberfläche freizulegen. Erzeugen Sie dann auf der linken Seite des Schädels mit einem Trepanbohrer einen Defekt mit einem Durchmesser von vier Millimetern kritischer Größe. Verpflanzen Sie das Gerüst in die Seite des Knochendefekts.

Verwenden Sie eine Augenzange, um das Operationsfeld sanft mit dem Periost zu bedecken. Schließen Sie anschließend die Wunde, indem Sie drei Stiche pro Zentimeter Schnitt anbringen. Verabreichen Sie schließlich das Analgetikum Buprenorphin, um die postoperativen Schmerzen zu kontrollieren, und halten Sie das Tier auf einem Heizkissen, um seine Körpertemperatur zu halten, bis es aufwacht.

Wenn die Maus wieder zu Bewusstsein kommt, versorgen Sie sie mit Nahrung und Wasser und überwachen Sie ihre täglichen Aktivitäten bis zum Ende des Experiments. Nachdem Sie das Multiphotonenmikroskopiesystem für die TPEF- und SHG-Bildgebung zusammengebaut haben, stimmen Sie den Femtosekunden-Titan-Saphir-Laser auf 860 Nanometer ab. Um neu gebildete Blutgefäße sichtbar zu machen, injizieren Sie der Maus intravenös 200 Mikroliter einer Dextranlösung von 10 Milligramm pro Milliliter in Kochsalzlösung und immobilisieren Sie dann mit dem stereotaktischen Instrument das anästhesierte Tier auf einer Heizplatte, um seine Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten.

Injizieren Sie der Maus intraperitoneal 200 Mikroliter Kochsalzlösung, um eine Austrocknung zu verhindern. Zum Schluss versorgen Sie das Tier mit einer dreiprozentigen Mischung aus Isofluran und 100 Prozent Sauerstoff, um während der Bildgebung eine ausreichende Anästhesie und Analgesie aufrechtzuerhalten. Um mit der Bildgebung zu beginnen, scannen Sie ein Paar Galvospiegel, um einen Abtastbereich von 512 x 512 Mikrometern zu erstellen.

Fokussieren Sie dann mit einer NA-Einpunkt-O-Wasserimmersionsobjektivlinse den Anregungsstrahl auf die Probe und sammeln Sie das rückstreuende TPEF HSG-Signal. Stellen Sie das Sichtfeld so ein, dass es in der Kontrollgruppe den normalen Knochenbereich und den Rand des Defekts abdeckt, bei der Bildgebung des Tieres aus der PH- oder PHp-Gruppe jedoch nur das implantierte Gerüst. Scannen Sie dann fünf verschiedene Stellen des Fehlers.

Erfassen Sie Bildstapel alle 12 Sekunden über einen Zeitraum von zwei Stunden. Hier wird ein Foto des Gerüsts präsentiert, das mit der 3D-Drucktechnik vorbereitet wurde, zusammen mit einem Mikro-CT-Bild, das die Gesamtporosität des vorbereiteten Materials zeigt. Die mikroporöse Struktur des Gerüsts ist in einem REM-Bild zu sehen, das mit 5000-facher Vergrößerung aufgenommen wurde.

Wie gezeigt, exprimierten HEK293T Zellen, die mit Medien behandelt wurden, die lentivirale Partikel enthielten, die von den Gerüsten freigesetzt wurden, effizient das grün fluoreszierende Protein. Nach Schätzungen der Durchflusszytometrie erreichte die Gesamtzahl der freigesetzten Partikel etwa 40 Prozent. Der robusteste Freisetzungseffekt wurde innerhalb der ersten 24 Stunden der Studie beobachtet und nahm im Laufe der Zeit allmählich ab, was bestätigt, dass lentivirale Partikel, die auf den Gerüsten beschichtet sind, ihre biologische Aktivität bis zu 96 Stunden lang beibehalten.

Die In-vivo-Analyse der Blutgefäße, die sich innerhalb eines Schädelknochendefekts gebildet haben, zeigte, dass neue Blutgefäße, die in der Kontrollgruppe der Mäuse nicht nachweisbar waren, acht Wochen nach der Gerüsttransplantation sowohl in der PH- als auch in der PHp-Gruppe deutlich sichtbar waren. Während sowohl in der PH- als auch in der PHp-Gruppe viele Kollagenablagerungsstellen nachgewiesen wurden, konnte nur in der PHp-Gruppe eine zunehmende Anzahl kleinerer Gefäße beobachtet werden, die zu Gerüsten heranwuchsen, und die gesamte Blutgefäßfläche war signifikant unterschiedlich. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Kopf der Maus ruhig zu stellen, um ihn während des Scannens ruhig zu halten und Artefakte zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Verfahren wie die photoakustische Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Daten wie z.B. tiefe Gewebebilder zu liefern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Knochenregeneration, um die Angiogenese bei Transplantaten zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die In-vivo-Plasmabildung in 3D-Gerüsten in Echtzeit und die Mikrophotonenmikroskopie visualisieren können.