Name: Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung In Vitro Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Erfahren Sie die Analyse der Lymphozyten-Extravasation mit einem in vitro Modell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Entzündungsmechanismen und therapeutische Ansätze.

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Diese Studie wurde durch den Sonderforschungsbereich TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Projekt A9 bis H.W. und C.C.G., Projekt B1 bis N.S.) unterstützt.

1. Zellkultur von Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC) <ol><li> Beschichtung von Zellkulturflaschen <ol><li> Um die Fibronektin-Lösung vorbereitet, mit 10 ml PBS in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 150 &amp; mgr; l Fibronektin und gut mischen. </li><li> Zur Abdeckung des Bodens einer T-25-Zellkulturflasche 2 mL der Fibronektin-Lösung. Inkubieren der Zellkultur-Kolben bei 37 ° C im Inkubator mindestens 3 h. Fibronectin beschichteten Kolben können für 2 Wochen bei 37 ° C / 5% CO 2 aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Säen und Zellkultur von HBMEC <ol><li> Aspirat Fibronektin-Lösung aus dem Boden der Zellkulturflasche. Hinzufügen 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² suspendiert in 6 ml ECM-B - Medium (= ECM-B mit 5% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% Endothelzellwachstum Ergänzung). Inkubieren bei 37 ° C / 5% CO 2. Überprüfen Sie das Zellwachstum täglich mit einem Mikroskop. </li><li> Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.Ernte oder Teile von Zellen, wenn HBMEC etwa 80% Konfluenz erreichen. HBMEC sollte zwischen dem Kanal 1 und 15 verwendet werden, Verlust der physiologischen Eigenschaften zu vermeiden. </li></ol></li><li> Ernte HBMEC. <ol><li> Bereiten Accutase Lösung durch Mischen Accutase (1x) mit PBS in einem Verhältnis von 1: 1. Halten Accutase-Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Übertragen ECM-B-Medium von der Zellkulturflasche in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen HBMEC durch Zugabe von 5 ml PBS, um den Boden der Zellkulturflasche. Absaugen PBS und wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei weitere Male. </li><li> In 2 ml vorgewärmten Accutase Lösung. für 2 min bei 37 ° C inkubieren. Danach HBMEC werden durch fest Antippen der Zellkulturflasche mehrmals wieder suspendiert. Zellablösung wird gesteuert unter Verwendung eines Mikroskops </li><li> Das ECM-B-Medium, die zuvor in einem Rohr 15 mL gespeichert wird zurück in die Zellkulturflasche hinzugefügt, sobald HBMEC abzulösen beginnen. Spülen Sie den Boden des Kolbens wiederholt, bis die meisten HBMEC sinderneut suspendiert. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 1 ml ECM-B-Medium. Zählen von Zellen und verdünne die Zellsuspension zu einer Endkonzentration von 3 × 10 5 pro mL HBMEC ECM-B - Medium zu erreichen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung der Zellkultur-Einsätze <ol><li> Beschichtung von Zellkultureinsätzen Wichtiger Hinweis: Vermeiden Sie die Membran der Zellkultur - Einsätze zu berühren. <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l Fibronektin - Lösung (siehe Abschnitt 1.1.1) zu jedem Zellkultureinsatz (1A) und eine Vertiefung einer 96-Well - Flachbodenplatte (optischen Kontrolle gut). Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 3 h. Nach der Inkubation absaugen Fibronektinlösung. </li><li> 100 l HBMEC Suspension auf die Zellkultur-Einsätze und die optische Kontrolle gut. Hinzufügen 600 ul ECM-B-Medium mit dem unteren Bereich der ZelleKultureinsätze. Inkubieren für 3 - 4 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2 , bis Barrierenintegrität (1B) erreicht ist , das Zellwachstum kontrolliert durch mikroskopische Auswertung des HBMEC in der optischen Kontrollvertiefung. Hinweis: Das Zellwachstum über 4 Tage wird nicht empfohlen. </li><li> Optional: entzündliche Bedingungen nachahmen aspirieren das Medium aus dem unteren Fach und ersetzen sie durch ECM-B-Medium, ergänzt mit 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 h vor der Migrationstest. </li></ol></li></ol> 3. Qualitätskontrolle mit Evans Blue am Tag des Auswanderungs Assay <ol><li> Herstellung von evans blaue Lösung <ol><li> PBS / B27-Lösung der Mischung 10 ml PBS mit 200 &amp; mgr; l B27 Ergänzung unter Verwendung einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen herzustellen. Verdünnte Evans-Blau-Stammlösung (20 mg / ml PBS) 1: 1000 mit PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans-Blau-Assay Permeabilität <ol><li> Anzusaugen, das Medium aus dem unteren Abteil durch die obere Kammer gefolgtvon einer Zellkultureinsatzes eine konfluente Monoschicht HBMEC enthält. 100 l evans blaue Lösung des Zellkultureinsatzes. </li><li> Hinzufügen 600 &amp; mgr; l PBS / B27 zu dem unteren Abteil und Inkubation für 60 min bei 37 ° C / 5% CO 2. Entfernen Sie vorsichtig den Zellkultureinsatz Pinzette. </li></ol></li><li> Evans-Blau-Messung <ol><li> Entfernen PBS / B27 aus dem unteren Abteil und übertragen wurden jeweils 100 ul zu zwei Vertiefungen einer schwarzen 96-Napf-Polystyrol-Platte mit flachem Boden. Legen Sie Platte in einem Tecan Infinite M200 Pro-Plattenleser und bestimmen die optimale z-Position. </li><li> Measure Anregung von Evans-Blau unter Verwendung von entsprechenden Einstellungen (zum Beispiel: Anregung: 620 nm, Emission: 680 nm, Anregungsbandbreite: 9 nm, Emissionsbandbreite: 20 nm, 175x Verbesserung, 25 blinkt, Integrationszeit: 20 us). </li><li> HBMEC Barrierefunktionen vergleichen erfassten Daten zu einer Standardkurve zeigt evans blau Permeation durch HBMEC zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Samen zu bestimmening Zellen (1B, rechts). </li></ol></li></ol> 4. Migration Assay <ol><li> Präparation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC). <ol><li> Fügen Sie 10 ml RPMI in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und 200 &amp; mgr; L B27 Ergänzung. Graf PBMC und zentrifugieren Zellen bei 300 · g für 5 min. Resuspendieren PBMC in einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Aufbau des Migrationstest <ol><li> Aspirat Medium aus der unteren Kammer , gefolgt von der oberen Kammer aus dem Zellkultur - Inserts enthalten konfluenten Monolayern HBMEC (1A). Spender pro 100 uL PBMC - Suspension jeweils mit den Zellkultureinsätzen hinzufügen und auch eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen pro (in vitro - Kontrolle). </li><li> Hinzufügen 600 &amp; mgr; l RPMI / B27 zum unteren Kompartiment der Zellkultureinsätze und 500 &amp; mgr; l auf die PBMC der in vitro - Steuerung und inkubieren 6 h bei 37 ° C / 5% CO 2. </li&gt; </ol></li><li> Ernten von migrierten PBMC <ol><li> Nehmen Sie den Zellkultureinsatz aus einer Pinzette vorsichtig den Boden mit 400 ul PBS spülen, ohne die Membranen zu berühren. Entsorgen Sie den Zellkultureinsatz. </li><li> Fügen Sie 20 &amp; mgr; l Fließzahl Fluorospheres (etwa 1.000 Perlen / ul) zu dem unteren Abteil des Zellkultureinsatzes sowie an die in - vitro - Kontrolle und gut mischen. 1 ml der resultierenden Suspension PBMC Cytometry Rohre zu fließen. </li></ol></li></ol> 5. Durchflusszytometrie <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Zentrifuge PBMC bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Antikörperlösung durch Zugabe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zu 100 &amp; mgr; l Durchflusszytometrie-Puffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) pro Probe. Für die Ergebnisse präsentiert unter 1 &amp; mgr; l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 &amp; mgr; l CD56-PC7, 1 &amp; mgr; l CD8-A700 und 1 ul CD16-A750 wurden pro Probe verwendet. </li><li> Resuspendieren PBMC in 100 &amp; mgr; l der Antikörperlösung und bei 4 ° C für 30 min inkubieren. </li><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; L Durchflusszytometrie-Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min. </li></ol></li><li> Probennahme <ol><li> Resuspendieren PBMC in der erforderlichen Menge (variiert in Abhängigkeit von dem Durchflusszytometer verwendet wird) der Durchflusszytometrie-Puffer. </li><li> Acquire stained PBMC unter Verwendung eines Durchflusszytometers mit einem aktiven Detektors zwischen 525 und 700 nm Wellenlängen-Durchflusszahl Fluorospheres (Anregung 488 nm, Emission 525 bis 700 nm) zu erfassen. (Die folgenden Schritte sind ein Beispiel, wenn ein Gallios Durchflusszytometer betrieben mit Kaluza G-Software verwendet wird. (1) Starten der Computer (2) Wenn das Betriebssystem vollständig geladen ist, startet das Durchflusszytometer durch den „Zytometer auf“ Drücken der Taste das jeweilige Erfassungsprotokoll Laden von „open-Protokoll“ drücken. (4) wählen Sie das gewünschte Protokoll und wählen Sie „öffnen“. (5) Duplizieren Sie das Protokoll für jede Probe mit der rechten Taste anklicken. (3)Maustaste auf das Protokoll sichtbar im virtuellen Karussell und einem Linksklick auf das Feld „Duplikat“. (6) Beschriften jede Probe in der Probenliste. (7) übertragen, die Proben zu den angegebenen Positionen des Karussells und die Übernahme beginnen.) </li></ol></li><li> Probenanalyse <ol><li> Öffnen resultierende Durchflusszytometriedaten die jeweilige Software. Bestimmt Anzahl von Subpopulationen von Interesse für transmigrierten PBMC sowie Zellen , die von in vitro - Kontrollvertiefungen und Zählung Fluorospheres fließt die jeweilige Analyse - Software. (Ein Beispiel für die Gating - Strategie wird im Ergebnisteil (Abbildung 1 C gegeben: die Transmigration von NK-Zell - Untergruppen zu analysieren, zunächst auswählen Lymphozyten in einer Seitwärtsstreuungskanals (SSC) gegen Vorwärtsstreuung Kanal (FSC) Plot Lymphocyten ist. dann in einem CD3 gegen CD56 Plot angezeigt und CD56 + CD3 -. NK - Zellen ausgewählt werden , zu unterscheiden zwischen NK-Zell - Untergruppen, NK - Zellen angezeigt inein CD56 gegen CD16 Grundstück und CD56 hell CD16 dim / - sowie CD56 dim CD16 + NK - Zellen ausgewählt. Außerdem Zählung Strömungs Fluorospheres werden aus einem FSC gegen SSC Stück ausgewählt und anschließend in einem Grundstück eines Kanals mit einer Emission zwischen 525 und 700 nm gegenüber der Zeit angezeigt, deren Anzahl zu bestimmen.) </li><li> Um die Gesamtzellzahl jeder Probe zu berechnen, normalisieren die erfasste Anzahl von Zellen unter Verwendung von Flusszahl Fluorospheres: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Bestimmen Prozentsatz der migrierten Zellen als Verhältnis zwischen dem gesamten migrierten Zellen und den Gesamtzellen in der in - vitro - Kontrolle. </li></ol></li></ol>

Der/die Autor(en) hat die folgenden potenziellen Interessenkonflikte in Bezug auf die Forschung, die Autorenschaft und/oder die Veröffentlichung dieses Artikels angegeben: A.S.-M. und U.B. haben keine finanziellen Offenlegungen. T. S.-H. Reise- und Konferenzkosten von Biogen erhalten. N.S. erhielt Honorare für Redner und Beiräte von Biogen und Novartis Pharma sowie Reisekosten von Biogen. H.W. erhielt eine Vergütung für seine Tätigkeit in wissenschaftlichen Beiräten/Lenkungsausschüssen von Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis und Sanofi-Genzyme. Darüber hinaus erhielt er Honorare für Referenten und Reisekosten von der Bayer Vital GmbH, der Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis und Sanofi-Genzyme. Er erhielt Vergütungen als Berater von Biogen, Merck Serono, Novartis und Sanofi-Genzyme. H.W. erhielt Forschungsunterstützung von Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Deutschland und Sanofi USA. C.C.G. erhielt Honorare für Referenten und Reisekosten für die Teilnahme an Tagungen von Genzyme, Novartis Pharma GmbH und Bayer Health Care.

Hier präsentieren wir eine Technik, um die Seelenwanderung von Lymphozyten über die menschliche Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. In - vitro - Analyse von Lymphozyten - Migration auf das ZNS ist wichtig , grundlegende Prozesse der Lymphozyten - Extravasation, potentielle krankheitsbedingte Veränderungen und neue therapeutische Ansätze zu studieren. Mehrere Modifikationen der Blut-Hirn-Schranke Modell möglich. So könnten beispielsweise Zellen aus dem oberen Kompartiment ana...

Lymphozytenmigration aus dem Blut in das Gewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Immunüberwachung. Eine Folge von spezifischen molekularen Wechselwirkungen stellt sicher , ortsspezifische Extravasation in Dünndarm, Haut, Lymphknoten, das zentrale Nervensystem (ZNS) und andere Gewebe 1. Veränderungen in der Lymphozytenmigration sind in der Pathophysiologie einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten 2 beteiligt. Migration in die Immunprivilegierten CNS ist streng reguliert und entsprechend Veränderungen dieses Verfahrens sind in CNS-bedingten Krankheiten wie Enzephalomyelitis 3, Neuromyelitis optica, Schlaganfall und Multiple Sklerose (MS) , 2, 4, 5, 6, 7 beteiligt. Daher ist es wichtig, Lymphozyten-Extravasation besser zu verstehen Krankheit Pathophysiologie und Entwicklung von Instrumenten für ein Studium<html> Melioration von Krankheitsbelastung 8, 9, 10, 11, 12. Lymphozyten wandern in das ZNS über verschiedene Routen. Extravasation durch postkapillaren Venolen in den Subarachnoidalraum über die Blut-Liquor - Schranke innerhalb des Plexus choroideus und über die Blut-Hirn - Schranke hat 1 beschrieben worden ist , 13, 14, 15. Migration durch die Blut-Hirn - Schranke wird durch die Wechselwirkung von Lymphozyten mit Endothelzellen 14 durchgeführt. Im Gegensatz Zellen in der Peripherie, Endothelzellen des ZNS äußern an endotheliale hohe Mengen an tight junction-Moleküle, um dadurch genau die Menge von Zellen und Proteinen Begrenzen der Lage Überquerung der Blut-Hirn-Schrankelass = &quot;xref&quot;&gt; 16. Entzündung führt Lockerung der tight junctions und induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen; Somit verbessert Lymphozytenmigration in das ZNS 1, 17, 18. Extravasation über die Blut-Hirn-Schranke ist ein mehrstufiger Prozess. Haltegurt - Lymphocyten an die Endothelzellen und dann entlang dem Endothel in einem Fertigungsrolle hauptsächlich durch Selectine 1, 15 vermittelt. Anschließend Wechselwirkungen zwischen durch das Endothel sekretiert Chemokine und Chemokin den jeweiligen auf Lymphozyten induzieren Konformationsänderungen exprimierten Rezeptoren der Integrine, wodurch feste Adhäsion an die Endothelzellen 1 zu fördern. Schließlich, Lymphozyten entweder Durchforstungs entlang der endothelialen Barriere gegen den Blutstrom, bevor sie in den perivaskulären Raum transmigrating oder abgewürgt sofort und direkt transmigrate an der Stelle der festen Haftung 1, 19, 20. All diese Schritte der Lymphozyten Extravasation kann in vitro unter Verwendung von unterschiedlichen Techniken 21 analysiert werden. Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet , um das anfängliche Tethering zu studieren und Walzen 15. Adhäsions - Assays bieten detaillierte Informationen über feste Verhaftung Barrieren endothelialer 22. Transmigrationsassays als 21 hier erlauben Analyse von Immunzellen - Transmigrations demonstriert, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Unter Verwendung der humanen in vitro - Modell Blut - Hirn - Schranke, konnten wir kürzlich zeigen , dass eine höhere migrAtory Kapazität von CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen im Vergleich zu ihrem CD56 dim CD16 + Pendants durch ein Vorherrschen dieser NK - Zell - Untergruppe in der intrathekalen Kammer 21 reflektiert wurde. So ist unser Versuchsaufbau scheint geeignet zu sein , die in vivo - Situation zu imitieren.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>ohne CaCl2 oder MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronektin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>aus Rinderplasma</td></tr><tr><td>T-25 Zellkulturkolben</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>klar, 6,5 mm Durchmesser, 3,0 & Mikro; M Porengröße</td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>Stammlösung: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x konzentrierte</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden, schwarz</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorosphären</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-Farben-Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1,5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-& gamma</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>Klon UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>Klon N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>Klon 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>Klon RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>Klon B9.11</td></tr></tbody></table>

analyse von lymphozyten-extravasation einer verwendung<em&gt; in vitro</em&gt; modell des barrier menschliches blut-hirn

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte Extravasation in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist entscheidend für die Immunüberwachung. Krankheitsbedingte Veränderungen der Lymphozyten-Extravasation könnten in pathophysiologischen Veränderungen im ZNS führen. So Untersuchung der Lymphozytenmigration in das ZNS ist wichtig, entzündlichen ZNS-Erkrankungen zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein in vitro - Modell der menschlichen Blut-Hirn - Schranke Lymphozyten - Extravasation zu studieren. Human brain mikrovaskuläre Endothelzellen (HBMEC) sind konfluent auf einem porösen Polyethylenterephthalat gewachsenen Transwell einzufügen das Endothel der Blut-Hirn-Schranke zu imitieren. Barrierefunktion durch Zonula occludens Immunhistochemie, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen sowie Analyse von Evans-Blau-Permeation validiert. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Diapedese von seltenen Lymphozytteilmengen wie CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen. FurthermErz, die Auswirkungen von anderen Zellen, Zytokinen und Chemokinen, krankheitsbedingte Veränderungen und unterschiedliche Behandlungsschemata auf die Migrationsfähigkeit von Lymphozyten untersucht werden. Schließlich kann die Wirkung von Entzündungsreizen sowie unterschiedliche Behandlungsschemata auf der endothelialen Barriere analysiert werden.

Repräsentative Ergebnisse zeigen Transmigration von NK-Zell- und T-Zell - Untergruppen mit dem menschlichen Blut-Hirn - Schranke - Modell (1A) gezeigt. Die Integrität der HBMEC Monoschicht wurde durch Anfärben des tight junction Moleküls ZO-1, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen validiert, und Evans - Blau - Permeation (1B). Folgende 3 - 4 Tage Kultur ausgedrückt HBMEC das tight junction Molekül ZO-1 (1B, links). A...

Hier beschreiben wir ein menschliches Blut-Hirn-Schrankenmodell, das es ermöglicht, die Transmigration von Lymphozyten in das zentrale Nervensystem in vitro zu untersuchen.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Das übergeordnete Ziel dieses Transmigrationsassays besteht darin, die Extravasation von Lymphozyten in das zentrale Nervensystem in vitro zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, unser Verständnis entzündlicher Erkrankungen des zentralen Nervensystems zu vertiefen und die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze voranzutreiben. Zu den Vorteilen dieser Technik zählen ihre einfache Zugänglichkeit und die Möglichkeit, seltene Lymphozytenpopulationen auf Einzelzell-Ebene zu analysieren.Diese Methode kann Einblicke in die Lymphozyten-Transmigration über die Blut-Hirn-Schranke gewähren und auf die Untersuchung der Transmigration über die Blut-Liquor-Schranke angewendet werden. Außerdem kann eine Permeationsanalyse mit Evansblau durchgeführt werden, um die Integrität des Blut-Hirn-Schranke-Modells zu beurteilen. Beginnen Sie damit, den Boden eines T-25-Zellkulturkolbens mit zwei Millilitern frisch zubereiteter Fibronectin-Lösung zu bedecken und für mindestens drei Stunden in einem Zellkulturgehäuse bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren zu lassen.Am Ende der Inkubation die Fibronectin-Lösung durch 7,2 × 10⁴ humane Gehirn-Mikrovaskulärendothelzellen (HBMEC) in sechs Milliliter vollständigem ECM-b-Medium ersetzen und den Kolben zurück in den Inkubator stellen. Sobald die HBMEC eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, den Überstand in ein 15-Milliliter-Konischglas überführen und die anhaftenden Zellen dreimal mit jeweils fünf Milliliter PBS waschen. Nach dem dritten Waschschritt zwei Milliliter vorgewärmte Accutase-Lösung zu den Zellen geben und zwei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Danach das Gefäß mehrmals kräftig klopfen und die Zellablösung mittels Lichtmikroskopie überprüfen. Sobald sich die Zellen vom Boden des Gefäßes lösen, das gewonnene Überstandmedium verwenden, um das Gefäß wiederholt auszuwaschen, bis sich die meisten HBMEC wieder in Suspension befinden. Anschließend die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischglas zur Zentrifugation überführen und das Pellet in einem Milliliter frischem ECM-b-Medium zur Zellzählung resuspendieren.Um die Zellkulturinserts für einen Transmigrationsassay vorzubereiten, geben Sie zunächst 100 Mikroliter Fibronectin-Lösung in jedes Insert sowie in ein Loch einer 96-Loch-Flachbodenplatte. Nach drei Stunden bei 37 Grad Celsius ersetzen Sie die Fibronectin-Lösung durch 100 Mikroliter HBMEC und fügen 600 Mikroliter frisches ECM-b-Medium in die unteren Kompartimente der Zellkulturinserts hinzu. Danach stellen Sie die Platten für drei bis vier Tage zurück in den Zellkulturinkubator.Um zu überprüfen, ob die Barrierefunktion erreicht wurde, saugt man das Medium aus den unteren und oberen Kompartimenten eines Zellkultur-Inserts ab und gibt 100 Mikroliter frisch zubereitete Evans-Blau-Lösung in das Insert. Fügen Sie 600 Mikroliter PBS, ergänzt mit B27, dem unteren Kompartiment hinzu und stellen Sie die Platte zurück in den Inkubator. Nach einer Stunde entfernen Sie das Insert vorsichtig mit einer Pinzette und überführen 100 Mikroliter PBS mit B27 aus dem unteren Kompartiment in zwei einzelne Vertiefungen einer schwarzen, aus Polystyrol bestehenden 96-Well-Platte mit flachem Boden.Danach die Platte in einen Multimodus-Mikroplattenreader laden und die optimale Z-Position bestimmen. Um die Barrierefunktion der HBMEC zu ermitteln, die Anregung der Evans-Blau-Farbstofflösung unter Verwendung der geeigneten Einstellungen messen und die gewonnenen Daten mit einer Standardkurve vergleichen, die die Evans-Blau-Permeation durch die HBMEC zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Aussaat darstellt. Nach Bestätigung der Bildung der Zellmonolayer die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) in RPMI-Medium, ergänzt mit B27, auf eine Konzentration von fünf mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter resuspendieren.Als Nächstes saugt das Medium aus den unteren und oberen Kompartimenten der entsprechenden Anzahl an Zellkultur-Einsätzen, die konfluente HBMEC-Monolagen enthalten, ab und gibt je Spender 100 Mikroliter PBMC zu den Zellkultur-Einsätzen sowie zu einem Brunnen einer 24-Loch-Platte pro in-vitro-Kontrolle hinzu. Fügt den unteren Kompartimenten der Zellkultur-Einsätze 600 Mikroliter RPMI plus B27 und den in-vitro-Kontrollbrunnen 500 Mikroliter hinzu und stellt die Platten für sechs Stunden zurück in den Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation entfernt man die Zellkultur-Einsätze mit einer Pinzette und spült vorsichtig die Unterseiten mit 400 Mikrolitern PBS, ohne die Membranen zu berühren.Anschließend gründlich 20 Mikroliter Flow-Count-Fluorosphären mit den Zellen in den experimentellen und in vitro-Kontrollmulden vermischen und ein Milliliter der resultierenden PBMC-Suspensionen in die entsprechenden Durchflusszytometrie-Röhrchen überführen. Die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die fluorochromkonjugierten Antikörper der gewünschten Spezifität in 100 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Puffer zu jeder Probe hinzufügen. Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen mit 250 Mikrolitern frischem Durchflusszytometrie-Puffer waschen und die Pellets in dem entsprechenden Volumen an Durchflusszytometrie-Puffer für die Analyse resuspendieren.Wenn alle Daten erfasst wurden, öffnen Sie die geeignete Software zur Analyse der Durchflusszytometrie. Um die Transmigration des NK-Zell-Subsets zu analysieren, wählen Sie zunächst die Lymphozyten in einem Streulicht-Scatter-Diagramm (Seitenstreuung gegen Vorwärtsstreuung) aus und stellen die Zellen in einem CD3-gegen-CD56-Punktediagramm dar. Anschließend selektieren Sie die CD56-positiven, CD3-negativen NK-Zellen.Um zwischen den transmigrierten NK-Zellsubpopulationen zu unterscheiden, stellen Sie die Zellen in einem CD56- gegen CD16-Plot dar und setzen Tore für die CD56bright, CD16dim oder negativen sowie die CD56dim, CD16-positiven Zellen. Wählen Sie anschließend die Flow-Count-Fluorosphären aus einem Vorwärts- gegen Seitwärtsstreuungs-Plot aus. Um die Anzahl der Beads zu bestimmen, stellen Sie die ausgewählten Daten in einem Plot eines Kanals, der eine Emissionswellenlänge zwischen 525 und 700 Nanometern abdeckt, gegen die Zeit dar.Bestimmen Sie abschließend den Prozentsatz der migrierten NK-Zellen als Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl der migrierten Zellen und der Gesamtanzahl der Zellen in der in-vitro-Kontrolle. Nach drei bis vier Tagen Kultur exprimierten die HBMEC das Tight-Junction-Molekül Zonula occludens-1 und wuchsen in Monolagen, die einen transendothelialen elektrischen Widerstand aufwiesen und eine verminderte Durchlässigkeit für Evans-Blau-Farbstoff zeigten. Die Stimulierung der endothelialen Zellmonolage mit Interferon-Gamma und TNF-alpha für 24 Stunden vor einem Transmigrationsassay mit gesamten PBMC führte zu einer erhöhten Migration aller analysierten Lymphozytenpopulationen.Interessanterweise weisen CD56bright, CD16dim oder negative NK-Zellen eine höhere Migrationskapazität auf als CD56dim, CD16-positive NK-Zellen, sowohl bei nicht stimulierten als auch bei zytokinaktivierten HBMEC. Obwohl der relative Anstieg der Transmigration durch eine entzündete Zellmonolayer insgesamt bei den CD56dim-Zellen höher ist, spiegelt dies die in vivo-Beobachtungen wider, dass CD56bright, CD16dim-negative NK-Zellen im intrathekalen Kompartiment angereichert sind. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 10 Stunden abgeschlossen werden.Die Vorbehandlung des In-vitro-Transmigrationsaufbaus mit Interferon-Gamma und TNF-alpha ermöglicht die Untersuchung der Lymphozytenmigration unter entzündlichen Bedingungen. Unser Protokoll kann modifiziert werden, indem Scherkräfte angewendet oder eine Kokultivierung mit anderen Zellen der Blut-Hirn-Schranke, wie Astrozyten, durchgeführt wird, um ein verfeinertes Modell für die Lymphozytentransmigration in das zentrale Nervensystem bereitzustellen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Lymphozytentransmigration mithilfe eines In-vitro-Modells der menschlichen Blut-Hirn-Schranke untersucht werden kann.

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Beurteilung der Störung der Blut-Hirn-Schranke in einem EAE-Mausmodell. Fluoreszierende Farbstoffe unterschiedlicher Größe werden retroorbital injiziert und zirkulieren durch die Blutgefäße des Gehirns. Der kleinere Farbstoff dringt durch Lücken in das Hirngewebe ein, während der größere Farbstoff nur dann eintritt, wenn die Störung schwerwiegend ist, was mit dem Ausmaß der Barriereschädigung korreliert.

Bestimmung der Störung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen in einem EAE-Mausmodell

Dieses Video zeigt eine experimentelle Untersuchung der Lymphozytentransmigration über ein Blut-Hirn-Schranke (BHS)-Endothelmodell. In vitro wird eine Monoschicht aus mikrovaskulären Endothelzellen (HBMECs) des menschlichen Gehirns erzeugt, und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die Lymphozyten enthalten, werden der Monoschicht hinzugefügt. Die Zellen werden dann inkubiert, um eine Lymphozytentransmigration zu ermöglichen, und die migrierten Zellen werden mittels...

Untersuchung der Lymphozytentransmigration durch eine mikrovaskuläre Endothelzell-Monoschicht

Einrichtung von Menschenmodelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​kann die Forschung in Gehirn Bedingungen mit BBB Versagen profitieren. Wir beschreiben hier ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Kontakt BBB Modell, das Co-Kultur von Astrozyten und menschlichen Endothelzellen des Gehirns auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran erlaubt.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Wir präsentieren einen Fluoreszenz-Test, um zu zeigen, dass Lucifer Yellow (LY) ein robuster Marker ist, um die scheinbare parazelluläre Durchlässigkeit von hCMEC/D3-Zellmonolayern zu bestimmen, einem In-vitro-Modell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. Wir verwendeten diesen Assay, um die Kinetik einer konfluenten Monolayer-Formation in kultivierten hCMEC/D3-Zellen zu bestimmen.

Luzifergelb - Ein robuster parazellulärer Permeabilitätsmarker in einem Zellmodell der menschlichen Blut-Hirn-Barriere

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, die erweiterte Endothelzellkulturmethode (EECM), die die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC)-ähnlichen Zellen des Gehirns ermöglicht. Diese Zellen zeigen die Expression von Endothelzelladhäsionsmolekülen und sind somit ein humanes Blut-Hirn-Schrankenmodell, das geeignet ist, Immunzellinteraktionen in vitro zu untersuchen.

Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellzellen des Gehirns mit einem reifen Immunphänotyp

Dieser Bericht enthält Protokolle für den Aufbau, die Zellkultur und die Assays auf der μSiM-Plattform für den Aufbau von Blut-Hirn-Schrankenmodellen.

Nutzung der MicroSiM (μSiM) Barrieregewebeplattform zur Modellierung der Blut-Hirn-Schranke

Es wurde eine Methode entwickelt, um die Farbstoffextravasation aufgrund des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke (BHS) sichtbar zu machen, indem Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten zwei Fluoreszenzfarbstoffe verabreicht wurden. Die Verwendung von Glycerin als Kryoprotektivum erleichterte die Immunhistochemie an derselben Probe.

Bewertung des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Schranke in einem Mausmodell für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Erfahren Sie die Analyse der Lymphozyten-Extravasation mit einem in vitro Modell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Entzündungsmechanismen und therapeutische Ansätze.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung

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