Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung In Vitro Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Das übergeordnete Ziel dieses Transmigrationsassays ist es, die Lymphozytenextravasation in das zentrale Nervensystem in vitro zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, entzündliche Erkrankungen des zentralen Nervensystems besser zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Einige Vorteile dieser Technik sind, dass sie leicht zugänglich ist und dass sie die Analyse seltener Lymphozytenpopulationen auf Einzelzellebene ermöglicht.

Diese Methode kann Einblicke in die Transmigration von Lymphozyten über die Blut-Hirn-Schranke geben und kann auf die Untersuchung der Transmigration über die Blut-Liquor-Schranke angewendet werden. Darüber hinaus kann die Evans-Blau-Permeationsanalyse durchgeführt werden, um die Integrität des Blut-Hirn-Schrankenmodells zu beurteilen. Beginnen Sie damit, den Boden eines T-25-Zellkulturkolbens mit zwei Millilitern frisch zubereiteter Fibronektinlösung für eine mindestens dreistündige Inkubation in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu bedecken.

Am Ende der Inkubation wird die Fibronektinlösung durch 7,2 mal 10 to the fourth human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) in sechs Millilitern vollständigem ECM-b-Medium ersetzt und der Kolben wieder in den Inkubator gestellt. Wenn die HBMEC eine Konfluenz von 80 % erreichen, überführen Sie den Überstand in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die adhärenten Zellen dreimal mit fünf Millilitern PBS. Nach der dritten Wäsche geben Sie zwei Milliliter vorgewärmte Accutase-Lösung für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius in die Zellen.

Klopfen Sie dann mehrmals fest auf den Kolben und bestätigen Sie die Zellablösung durch Lichtmikroskopie. Wenn sich die Zellen vom Boden des Kolbens abzuheben beginnen, spülen Sie den Kolben mit dem geernteten Überstand wiederholt, bis der größte Teil des HBMEC wieder suspendiert ist. Übertragen Sie dann die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem ECM-b-Medium zur Zählung.

Um die Zellkultureinsätze für einen Transmigrationsassay vorzubereiten, geben Sie zunächst 100 Mikroliter Fibronektinlösung zu jedem Einsatz und zu einer Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Ersetzen Sie nach drei Stunden bei 37 Grad Celsius die Fibronektinlösung durch 100 Mikroliter HBMEC und geben Sie 600 Mikroliter frisches ECM-b-Medium in die unteren Kompartimente der Zellkultureinsätze. Anschließend stellen Sie die Platten für drei bis vier Tage wieder in den Zellkultur-Inkubator.

Um zu testen, ob die Integrität der Barriere erreicht wurde, aspirieren Sie das Medium aus dem unteren und oberen Kompartiment eines Zellkultureinsatzes und geben Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete Evans-Blau-Lösung in den Einsatz. Geben Sie 600 Mikroliter PBS, ergänzt mit B27, in das untere Fach und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Entfernen Sie nach einer Stunde den Einsatz vorsichtig mit einer Pinzette und übertragen Sie 100 Mikroliter PBS B27 aus dem unteren Fach in zwei einzelne Vertiefungen einer schwarzen Polystyrolplatte mit flachem Boden für 96 Vertiefungen.

Laden Sie dann die Platte in einen Multimode-Mikroplatten-Reader und bestimmen Sie die optimale Z-Position. Um die HBMEC-Barrierefunktion zu bestimmen, messen Sie die Anregung der Evans-Blau-Farbstofflösung mit den entsprechenden Einstellungen und vergleichen Sie die erfassten Daten mit einer Standardkurve, die die Evans-Blau-Permeation über das HBMEC zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Aussaat darstellt. Nachdem Sie die Bildung der Zellmonoschicht bestätigt haben, resuspendieren Sie die Probe der mononukleären Blutzelle (PBMC) auf eine Konzentration von fünfmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in RPMI-Medium, das mit B27 ergänzt ist.

Als nächstes aspirieren Sie das Medium aus den unteren und oberen Kompartimenten der entsprechenden Anzahl von Zellkultureinsätzen, die die konfluenten HBMEC-Monoschichten enthalten, und fügen Sie 100 Mikroliter PBMC pro Spender zu den Zellkultureinsätzen und zu einer Vertiefung einer 24-Well-Platte pro In-vitro-Kontrolle hinzu. Geben Sie 600 Mikroliter RPMI plus B27 in die unteren Kammern der Zellkultureinsätze und 500 Mikroliter in die In-vitro-Kontrollvertiefungen und stellen Sie die Platten für sechs Stunden in den Zellkulturinkubator zurück. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Zellkultureinsätze mit einer Pinzette und spülen Sie den Boden vorsichtig mit 400 Mikrolitern PBS ab, ohne die Membranen zu berühren.

Mischen Sie dann gründlich 20 Mikroliter Flow-Count Fluorosphären mit den Zellen in den experimentellen und in vitro Kontrollwells und überführen Sie einen Milliliter der resultierenden PBMC-Suspensionen in die entsprechenden Durchflusszytometrieröhrchen. Entnehmen Sie die Zellen durch Zentrifugation und fügen Sie jeder Probe die interessierenden Fluorochrom-konjugierten Antikörper in 100 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Puffer hinzu. Waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit 250 Mikrolitern frischem Durchflusszytometriepuffer und resuspendieren Sie die Pellets in das entsprechende Volumen des Durchflusszytometriepuffers für die Analyse.

Wenn alle Daten erfasst wurden, öffnen Sie die entsprechende Durchflusszytometrie-Analysesoftware. Um die Transmigration der NK-Zelluntergruppe zu analysieren, wählen Sie zunächst die Lymphozyten in einem Streukanaldiagramm zwischen Seite und Vorwärts aus und zeigen Sie die Zellen in einem Punktdiagramm von CD3 und CD56 an. Wählen Sie dann die CD56-positiven, CD3-negativen NK-Zellen aus.

Um zwischen den transmigrierten NK-Zelluntergruppen zu unterscheiden, zeigen Sie die Zellen in einem CD56- und CD16-Plot und Gate für die CD56bright-, CD16dim- oder -negativen und CD56dim-, CD16-positiven Zellen an. Wählen Sie dann die Flow-Count-Fluorosphären aus einem Vorwärts- und Seiten-Streudiagramm aus. Um die Kügelchenzahl zu bestimmen, zeigen Sie die ausgewählten Daten in einem Diagramm eines Kanals an, der eine Emissionswellenlänge zwischen 525 und 700 Nanometern über der Zeit abdeckt.

Bestimmen Sie schließlich den Prozentsatz der migrierten NK-Zellen als Verhältnis zwischen der Gesamtzahl der migrierten Zellen und der Gesamtzahl der Zellen in der In-vitro-Kontrolle. Nach drei- bis viertägiger Kultivierung exprimierte das HBMEC das Tight-Junction-Molekül Zonula occludens-1 und wuchs in Monoschichten, die einen transendothelialen elektrischen Widerstand und eine reduzierte Evans-Blau-Farbstoffpermeation aufweisen. Die Stimulation der Endothelzell-Monoschicht mit Interferon gamma und TNF alpha für 24 Stunden vor einem vollständigen PBMC-Transmigrationsassay führt zu einer erhöhten Migration aller analysierten Lymphozytenpopulationen.

Interessanterweise weisen CD56bright-, CD16dim- oder negative NK-Zellen sowohl bei unstimulierten als auch bei Zytokin-aktivierten HBMEC eine höhere Migrationskapazität auf als CD56dim, CD16-positive NK. Obwohl die relative Zunahme der Transmigration durch eine entzündete Zellmonoschicht für die CD56dim-Zellen insgesamt höher ist, was die In-vivo-Beobachtungen nachahmt, dass CD56bright, CD16dim-negative NK-Zellen im intrathekalen Kompartiment angereichert sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von 10 Stunden abgeschlossen werden.

Die Vorbehandlung des in vitro Transmigrationsaufbaus mit Interferon gamma und TNF alpha ermöglicht die Untersuchung der Lymphozytenmigration unter entzündlichen Bedingungen. Unser Protokoll kann durch Anwendung von Scherkräften oder durch Co-Kultivierung mit anderen Zellen der Blut-Hirn-Schranke, wie Astrozyten, modifiziert werden, um ein verfeinertes Modell für die Transmigration von Lymphozyten in das Zentralnervensystem bereitzustellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Lymphozytentransmigration anhand eines In-vitro-Modells der menschlichen Blut-Hirn-Schranke untersuchen kann.