Name: Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Lernen Sie die bronchoalveoläre Lavage zur Analyse entzündlicher Zellinfiltrationen in murinen Lungen. Diese einfache Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Mechanismen bei Atemwegserkrankungen.

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LVH ist wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Biomedizinische Molekularbiologie der Universität Gent. ERJ wird durch UniVacFlu unterstützt, Gewährungsnummer 607690. KR wird von EC-FP7-Projekt FLUNIVAC unterstützt.

Alle Tierversuche, die in dieser Studie beschrieben wurden, wurden nach dem nationalen (belgischen Gesetz 14/08/1986 und 22/12/2003, belgischen Königlichen Dekret vom 06/04/2010) und der europäischen Gesetzgebung (EU-Richtlinien 2010/63 / EU und 86 / 609 / EWG). Alle Experimente an Mäusen und allen Tierprotokollen wurden vom Ethikkomitee der Universität Gent (Genehmigungsnummern LA1400091 und EC2016-027) genehmigt. 1. Vorbereitung <ol><li> Spülflüssigkeit <ol><li> Eine ausgewogene Salzlösung mit 100 μM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zubereiten. HINWEIS: Um Proteinspiegel in der BAL-Flüssigkeit zu messen, empfiehlt es sich, Protease-Inhibitoren zuzusetzen, um die Protease-Aktivität in der BAL-Flüssigkeit zu verhindern. </li></ol></li><li> Katheter <ol><li> Machen Sie einen Katheter, indem Sie eine 23 G Nadel in transparente Plastik Polyethylen 21 G Schlauch (Innendurchmesser: 0,58 mm, Außendurchmesser: 0,965 mm und Länge: 0,5 cm). Premade Katheter können auch verwendet werden. </li></ol></li><li> AnesthWDVS <ol><li> Bereiten einer terminalen Anästhetikum, vorzugsweise eine , die Atemstillstand verursacht (beispielsweise ein Barbiturat wie Natriumpentobarbital (&gt; 100 mg / kg) Lösung in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)). HINWEIS: Es wird empfohlen injiziert Anästhesie zu verwenden anstelle von inhalativen Anästhesie, wie inhalierte Anästhesie einen Einfluss auf die BAL-Gehalt aufweisen. CO 2, zum Beispiel hat einen Einfluss auf den pH - Wert des Blutes und damit auf die Umverteilung der verschiedenen Verbindungen 12. </li></ol></li><li> Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) rote Blutpuffer Zelllyse <ol><li> Bereiten einen ACK - Lysepuffer 8,29 g NH 4 Cl und 1 g KHCO 3 in 1 l H 2 O mit 100 uM EDTA durch Auflösen; die roten Blutkörperchen Lysepuffer können auch von einer externen Quelle bezogen werden. </li></ol></li></ol> 2. Durchführung der Bronchiallavage (BAL) <ol><li> Einführen des Katheters in die Trachea<ol><li> Euthanize der Maus durch intraperitoneale Injektion einer letalen Dosis eines kurzwirkenden Barbiturat Anästhetikum eine 26 G-Nadel. Um eine ordnungsgemäße tödliche anesthetization zu bestätigen, kneifen die hintere Pfote der Maus mit einer Pinzette die Fußreflexzonen zu überprüfen. </li><li> Legen Sie das Tier auf dem Rücken auf einer chirurgischen Platte und befestigen Sie die Maus durch Pinning die Glieder nach unten. </li><li> Spray 70% Ethanol auf dem Hals zu desinfizieren. Einen Einschnitt in der Haut am Hals in der Nähe der Luftröhre mit einem Skalpell. </li><li> Öffnen Sie die Haut die Speicheldrüsen zu belichten. Trennen Sie die Speicheldrüsen durch Zangen mit dem M. sternohyoideus zu belichten. Einzuschneiden den Muskel um die Trachea Zange mit der Luftröhre zu belichten. </li><li> Legen Sie einen Baumwollfaden unter der Trachea mit Zangen. </li><li> Sorgfältig durchsticht die Mitte des freiliegenden Trachea zwischen zwei Knorpelringen mit einer 26 G-Nadel. Achten Sie darauf, nicht die Luftröhre weiter zu beschädigen. </li><li> Setzen Sie den Katheter etwa 0,5 cm in die Luftröhre. Stellen Sie sicher, dass die catheter ist nicht zu weit nach unten in die Trachea eingeführt, da dies zu einer Schädigung der Lungenstruktur führen kann. </li><li> Stabilisierung des Katheters durch die Luftröhre um den Katheter binden den Baumwollfaden in Schritt 2.1.5 platziert werden. Wenn der Katheter nicht ausreichend gebunden ist, kann die injizierte balancierter Salzlösung in Richtung des oberen Teils des Atmungstraktes fließt statt nach unten in die Lunge. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die Spülflüssigkeit <ol><li> Laden eine 1 ml-Spritze mit 1 ml steriler ausgewogener Salzlösung mit 100 &amp; mgr; M EDTA. </li><li> Verbinden Sie die 1-ml-Spritze mit dem Katheter und sanft das Salz / EDTA-Lösung in die Lunge injizieren. </li><li> Aspirieren Sie die Lösung behutsam, während der Thorax der Maus zu massieren. Wenn die Flüssigkeit absaugen nicht sichtbar in der Spritze ist, legt den Katheter vorsichtig ein wenig weiter nach unten oder oben der Trachea. </li><li> Entfernen die Spritze von der Nadel übertragen, und die wiedergewonnene Spülflüssigkeit in ein 15 ml-Röhrchen auf Eis gestellt. Normalerweise 700-900 &amp;# 181, L von BAL wird aus 1 ml injizierter Lösung gewonnen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 - 2.2.4 zweimal mehr. HINWEIS: Wenn es darum geht, den nicht zellulären Inhalt zu analysieren, empfiehlt es sich, die gepoolten Proben zu konzentrieren, wenn es Probleme mit der Empfindlichkeit gibt. </li></ol></li></ol> 3. Sammeln der zellulären und nichtzellulären Bestandteile der BAL-Flüssigkeit <ol><li> Die Spülflüssigkeit für 7 min bei 400 xg und 4 ° C zentrifugieren. </li><li> Sammeln Sie den Überstand und verwenden Sie ihn sofort zur weiteren Analyse ( zB ELISA) oder bei -80 ° C einfrieren. Halten Sie das Zellpellet, um den zellulären Zustrom in den Lungen zu analysieren. </li><li> Das Zellpellet wird in 200 μl ACK-lysierenden Puffer resuspendiert. ANMERKUNG: Dieser Schritt stellt die Lyse der Erythrozyten sicher, während die weißen Blutzellen intakt gehalten werden. </li><li> Inkubieren für 2 min bei RT. HINWEIS: Um die durch die Rotzelllyse verursachte Variation zu reduzieren, sollte dieser Schritt nicht länger als 2 min durchgeführt werden. </li&gt; <li> 1 ml kalter PBS, die ACK-Lysepuffer zu verdünnen. </li><li> Zentrifuge für 7 min bei 400 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendiere die Zellen in einem ausreichenden Volumen von PBS für Downstream-Analyse (siehe unten). HINWEIS: Das Volumen des PBS hängt von der Downstream-Studie, die durchgeführt werden soll. </li></ol> 4. Die Analyse der verschiedenen Zelltypen in der BAL-Flüssigkeit durch Durchflusszytometrie HINWEIS: Eine Möglichkeit ist es, die absolute und relative Zellzusammensetzung der BAL-Flüssigkeit zu analysieren, mittels Durchflusszytometrie durchgeführt wird. Das Ziel dieser Arbeit ist die Technik des BAL zu erarbeiten. Die Durchflusszytometrie ist eine spezielle Technik für sich allein. Es wird empfohlen , auf dem Durchflusszytometrie Technik spezialisierte Papiere zu lesen , 13, 14, 15, 16, 17. Antikörper, gekoppelt an ein Fluorophor tHut erkennen Oberflächen-Antigene (siehe Tabelle 1 ), die für einen bestimmten Zelltyp (e) spezifisch sind. Durch die Verwendung einer Gating-Strategie ist es möglich, T-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen, B-Zellen, Eosinophile und Neutrophile in der Zellfraktion des BAL zu identifizieren. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antigen </td><td> Zelltyp </td></tr><tr><td> Cluster der Differenzierung 3 (CD3) </td><td> Ausgesprochen auf T-Zellen </td></tr><tr><td> Cluster der Differenzierung 11c (CD11c) </td><td> Hohe Expression auf den meisten dendritischen Zellen, aber auch auf Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen und einigen B-Zellen. </td></tr><tr><td> Cluster der Differenzierung 11b (CD11b) </td><td> Ausgedrückt auf der Oberfläche von vielen Leukozyten, einschließlich Monozyten, Neutrophilen, natürlichen Killerzellen, Granulozyten und Makrophagen. </td></tr><tr><td> SiglecF </td><td> EINLveolaren Makrophagen und Eosinophilen. </td></tr><tr><td> MHCII </td><td> Normalerweise nur auf Antigen-präsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen, mononuklearen Phagozyten und B-Zellen gefunden. </td></tr><tr><td> CD19 </td><td> B-Lymphozyten-Antigen </td></tr><tr><td> Ly-6G </td><td> Ein Marker für Monozyten, Granulozyten und Neutrophilen </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Auswahl von Immunzellen-Oberflächenantigenen. Diese Tabelle enthält eine Liste von Oberflächen-Epitopen, die zur Charakterisierung der verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Es werden Kombinationen von mehreren Markern benötigt, um einen bestimmten Zelltyp zuverlässig zu definieren. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Proben </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tube </td><td> Antigen-Fluorophor wird den Zellen zugesetzt </td&gt; <td> Antikörper - Stammkonzentration (mg / ml) </td><td> Antikörper Verdünnung </td><td> Gesamtvolumen (ul) </td></tr><tr><td></td><td> Lebensfähigkeitsfarbstoff fixierbar </td><td> 0,2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> SiglecF </td><td> 0,2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Probe X </td><td> MHCII </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD3 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD19 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11b </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> Ly6G </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Spannungskontrollen </Stark&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tube </td><td> Antigen-Fluorophor wird den Zellen zugesetzt </td><td> Antikörper-Stammkonzentration (mg / ml) </td><td> Antikörperverdünnung </td><td> Gesamtvolumen (μL) </td></tr><tr><td> Ungefärbte Zellen </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Einzelgefärbte Zellen </td><td> Fixierbarer Lebensfähigkeitsfarbstoff </td><td> 0,2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Einzelgefärbte Zellen </td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Einzelgefärbte Zellen </td><td> SiglecF </td><td> 0,2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Einzelgefärbte Zellen </td><td> MHCII </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Einzelgefärbte Zellen </td><td> CD3 </td><td> 00,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Einzelne gefärbten Zellen </td><td> CD19 </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Einzelne gefärbten Zellen </td><td> CD11b </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Einzelne gefärbten Zellen </td><td> Ly6G </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Kompensationssteuerungen </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tube </td><td> Antigen-Fluorophor Perlen hinzugefügt werden </td><td> Antikörper - Stammkonzentration (mg / ml) </td><td> Antikörper Verdünnung </td><td> Gesamtvolumen (ul) </td></tr><tr><td> ungefärbten Perlen </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Einzel gefärbte Perlen </td><td> CD11c </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td&gt; </tr><tr><td> Einzel gefärbte Perlen </td><td> SiglecF </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Einzel gefärbte Perlen </td><td> MHCII </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Einzel gefärbte Perlen </td><td> CD3 </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Einzel gefärbte Perlen </td><td> CD19 </td><td> 0,2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Einzel gefärbte Perlen </td><td> CD11b </td><td> 0,2 </td><td> 1/400 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Einzel gefärbte Perlen </td><td> Ly6G </td><td> 0,2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Liste der Kontrollen einbezogen werden. Diese Tabelle zeigt alle notwendigen Kontrollen für die genaue Interpretation der erzielten Ergebnisse. <ol><li> Zelloberflächenfärbung HINWEIS: Es ist impoUm alle kritischen Kontrollen für die Durchflusszytometrieanalyse einzubeziehen. Es werden drei Sätze von Rohren benötigt (siehe Tabelle 2 ): (1) Röhrchen, die die Proben enthalten; (2) Röhrchen mit BAL-Zellen für jeden Antikörper-Fluorophor, um einzelne Flecken herzustellen; Dies ermöglicht die Bestimmung der Spannungen für jeden Kanal auf dem Durchflusszytometer; Und (3) Röhrchen mit Perlen für jeden Antikörper-Fluorophor, um einzelne Flecken herzustellen; Dies ist die Bestimmung der Kompensationsmatrix. <ol><li> Mischen Sie die Antikörper und den Fc-Block (anti-CD16 / CD32) in PBS bei den entsprechenden Verdünnungen (siehe Tabelle 2 ). Es ist notwendig, die optimale Arbeitsverdünnung für jeden Antikörper vor dem Experiment zu bestimmen. </li><li> Die Zellen in 50 μl der Antikörpermischung für die Probe resuspendieren und 50 μl des entsprechend verdünnten Antikörpers den kritischen Kontrollen zugeben. ANMERKUNG: Die Färbung kann in einer 96-well, u-förmigen Platte durchgeführt werden. Dadurch ist es möglich, das Fleckvolumen leicht zu reduzierenNd führen erhebliche Mengen an Proben. </li><li> Inkubieren für 30 min im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> 5 min bei 400 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in PBS auf ein Endvolumen von 200 μl erneut suspendieren. HINWEIS: Dieses Endvolumen hängt von der minimalen Lautstärke ab, auf die das Durchflusszytometer zugreifen kann. Das kann sich zwischen den Maschinen leicht unterscheiden. Darüber hinaus hängt das Lesevolumen von der Anzahl der Zellen und / oder der Zeit ab, die die Probe ausführen wird, um im Durchflusszytometer zu laufen. </li><li> Verwenden Sie die Proben und Kontrollen für die Durchflusszytometrische Analyse. HINWEIS: Um die absolute Zellzahl der verschiedenen Zellpopulationen zu bestimmen, sollten Zählperlen hinzugefügt werden. Füge die gleiche Anzahl von Perlen (± 25.000 Perlen) zu jeder Probe kurz vor der Messung hinzu. Durch die Verwendung von Vorwärts- und Seitenstreuung können Zählperlen durch Durchflusszytometrie identifiziert werden (siehe Abbildung 1 ). Anschließend kann die absolute Anzahl von Zellen in der Probe durch Vergleich von th berechnet werdenE-Verhältnis von Perlenereignissen zu Zellereignissen. Folgende Formel kann verwendet werden: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55398/55398eq1.jpg" /></li></ol></li><li> Durchflusszytometrische Analyse HINWEIS: Die Durchflusszytometrie sollte sofort nach Beendigung des Färbeprotokolls durchgeführt werden. Es muss ein Durchflusszytometer mit entsprechenden Lasern und Filtern zur Signalerkennung verwendet werden. Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Laser und Filter, die für die in diesem Manuskript beschriebene Studie benötigt werden. Für weitere Informationen zur Durchflusszytometrieanalyse siehe Adan et al. 18 <ol><li> Richten Sie die Primärtore auf der Vorwärts- und Seitenstreuung ein, ohne Schutt und Dubletts (siehe Abbildung 1 ). </li><li> Stellen Sie die Spannung und die Kompensation für die spektrale Überlappung mit Hilfe der einzelligen Zellen und Perlen ein. HINWEIS: Diese Einstellungen sind für jeden Durchflusszytometer unterschiedlich und müssen vor jedem Experiment überprüft werden. Foder korrekte Flussanalyse, die Vorwärts- und Seitenstreuspannungen sind kritisch. Eine korrekte Vorwärts- und Seitenstreuung kann bei der Identifikation und Bestätigung der Identität der untersuchten Zellen helfen. Um diese Spannungen eine ungefärbte Probe bestimmen sollte zuerst ausgeführt werden. </li><li> Aufgebaut Fluoreszenz Gatter für das Oberflächenantigen (siehe Abbildung 1) und analysieren , um die Proben. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Lasertyp </td><td> Filteraufbau </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 505 LP </td><td> 525/50 </td></tr><tr><td> Blau (488 nm) </td><td> 550 LP </td><td> 575/26 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td> 670 LP </td><td> 685/35 </td></tr><tr><td></td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr><tr><td> Violett 405 nm </td><td></td><td> 450/50 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rot 633 nm </td><td></td><td> 660/20 </td></tr><tr><td> 70 mW </td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Übersicht über den Laser und Filter des Durchflusszytometer in dieser Studie verwendet.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

BAL ist eine nützliche Technik, um zytologische und biochemische Informationen als Reaktion auf Infektionen oder Medikamente zu erhalten. Zunächst wurde BAL verwendet, um die übermäßige Schleimproduktion bei Patienten mit Phosgen-Toxizität zu bewältigen 3 . Heutzutage wird die Technik bei Menschen verwendet, um die Lungenpathogenese, die Diagnose und die therapeutische Behandlung von Krankheiten zu untersuchen 3 , 24 . In Labortieren wird BAL häufig verwendet, um entzündliche Reaktionen, Immunmechanismen und Infektionskrankheiten, die in den pulmonalen Atemwegen 1 , 2 auftreten, zu überwachen. Um das entzündliche Zellmuster bei Atemwegserkrankungsmodellen zu untersuchen, sollte dem BAL eine absolute und differenzielle Zellzählung folgen. Neben der absoluten Zellzahl sind auch die relativen Zellzahlen von Interesse. Zum Beispiel zeigen Reparatur- und Krebsmodelle vEry kleine bis gar keine BAL-Zellzahl erhöht. In diesem Modell ist die Beurteilung der zellulären Zusammensetzung nützlich. Durch die Verwendung von Zellfärbung mit Lichtmikroskopie kombiniert, verschiedene Zelltypen, wie Eosinophile, Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten, können basierend auf der Morphologie 25, 26, 27, 28, 29, 30 identifiziert werden. Durchflusszytometrie kann für spezifische Beurteilungen verwendet werden, wie beispielsweise verschiedene T-Zell - Phänotypen zu identifizieren , 7, 31. Neben der Identifizierung der verschiedenen infiltrierenden Zellpopulationen kann die nicht-zelluläre Zusammensetzung in der Lunge untersucht wird BAL verwendet. Verfahren, wie ELISA, Immunoblot, Zytokin-bead array, Immunhistochemie und quantitative Polymerase-Kettenreaktion werden auf BAL-Flüssigkeit durchgeführt, Cytokine, Wachstum um zu bestimmen,Faktoren und anderen entzündlichen Komponenten. Zur Bestimmung der Lungenschädigung können auch die Gesamtprotein- und Laktatdehydrogenase-Werte im BAL-Fluid gemessen werden 32 , 33 . Mit der Entwicklung neuer Diagnosewerkzeuge wird die genomische und proteomische Charakterisierung von BAL-Komponenten in naher Zukunft möglich sein. Die Kombination von erweiterten Berechnungsfähigkeiten und Hochdurchsatz-Genexpressionstechnologien ermöglicht es, spezifische Genexpressionsprofile für verschiedene Krankheitszustände zu definieren. Die Durchführung dieser Techniken auf BAL-Flüssigkeit kann Gen- und Protein-Expressionsmuster liefern, um die wichtigen Moleküle zu identifizieren, die an den verschiedenen Phasen der Lungenerkrankungen beteiligt sind. Die Hauptbeschränkung der Daten aus BAL-Flüssigkeit ist die mangelnde Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Forschungsversuchen 3 , 9 . Es gibt ein hohes Maß anVariabilität in der Lavagetechnik und die anschließende Verarbeitung von BAL-Flüssigkeit. Um jede BAL-Studie vergleichen zu können, ist es notwendig, die Art der eingesparten Spülflüssigkeit, die Instillationsstätte und die Fraktion, die für die zelluläre und nicht-zelluläre Zusammensetzung analysiert werden soll, zu standardisieren. Es gibt signifikante Unterschiede in der Anzahl der Spaltfraktionen zwischen verschiedenen Studien, die von einem bis 14 mal 34 , 35 , 36 variieren. Dieser Unterschied kann einen Einfluss auf die geschätzten Gesamtzellzahlen in den Lungen haben. Es ist wichtig zu wissen, welche BAL-Fluidfraktion die Mehrheit der Zellen enthält. Song et al. Zeigte, dass etwa 70% der Gesamtzahl der Zellen in Fraktion eins bis drei 22 abgerufen wurden. Jedoch schlugen andere Berichte vor, dass die zweite Lavage mehr Zellen enthielt als die erste 37 , 38 </sup&gt;. Wir können aus diesen Studien kommen zum Schluss, dass eine Spülung mit nur einem Bruchteil nicht die ganze Lunge darstellen wird, was zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse. Die nichtzelluläre Zusammensetzung der BAL - Flüssigkeit enthält wertvolle Informationen über den Gesundheitszustand der Lunge 33, 39, 40. Variationen in der Verdünnung der BAL-Flüssigkeit tragen zu der Differenz in der Quantifizierung der löslichen Fraktion und folglich auf den Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Versuchen. Song et al. verglichen, um das Protein und Lactatdehydrogenase Ebene jeder Fraktion Lavage und folgerte, dass die Fraktion erste lavage zwei- bis dreimal mehr als die zweite Fraktion enthielt. Um eine repräsentative BAL Probe zur Analyse abgerufen werden, sind einige technische Überlegungen von entscheidender Bedeutung. Einer von ihnen ist die richtige anesthetization auszuführen. Es ist sehr wichtig, den Fuß ref zu überprüfenLex der Maus, um die endgültige Sedierung zu gewährleisten. Dies ist nicht nur aus ethischen Gründen wichtig, sondern auch, weil es schwierig ist, den Katheter in der richtigen Position zu platzieren und zu halten, wenn die Maus nicht richtig betäubt wird. Eine zweite wichtige technische Betrachtung ist die Position des Katheters in der Trachea. Wenn der Katheter zu tief eingelegt ist, kann er die Lungenstruktur beschädigen. Das distale Ende des Katheters sollte während des BAL-Verfahrens nicht in die Lunge gelangen. Der Katheter sollte auch mit einem Baumwollfaden stabilisiert und abgebunden werden. Wenn der Katheter nicht stabilisiert ist, kann die eingespritzte Kochsalzlösung nach oben in die Nasenhöhle fließen, anstatt in die Lunge zu gelangen. Während der Injektion und Absaugung der Kochsalzlösung ist es wichtig, den Katheter stabil zu halten. Die aus der BAL-Flüssigkeit gewonnenen Daten müssen die gesamte murine Lunge darstellen. Daher ist es wichtig, ein ausreichendes Volumen an Kochsalzlösung Puffer ( dh3 ml, aufgeteilt in 3 Aliquots von jeweils 1 ml). Es gibt keine lineare Beziehung zwischen der Zellausbeute und der BAL-Fluidausbeute. Es ist wichtig, die Lösung sanft zu sammeln, während man den Thorax der Maus massiert. Wenn Scherkräfte zu stark sind, können die Lebensfähigkeit, die Funktion und die Struktur der Zellen innerhalb der Atemwege und der BAL-Flüssigkeit beeinträchtigt werden. Wenn die angesaugte Flüssigkeit in der Spritze nicht sichtbar ist, bewegen Sie den Katheter vorsichtig oder tiefer in die Luftröhre. Besondere Hinweise auf spezifische Aspekte der BAL-Verarbeitung und -Analyse. Dadurch werden die von BAL-Samples erhaltenen Informationen maximiert. Nach BAL sind die Zellen in einem nährstoffarmen salzhaltigen Medium. Es ist daher sehr wichtig, die Proben innerhalb von 1 h nach der BAL-Probenahme zu verarbeiten. Wenn eine verlängerte Lagerung erforderlich ist, ist die Verwendung eines Nährstoff-ergänzten Mediums erforderlich. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewahren, vermeiden Sie Röhrchen, die die Zelladhäsion an der Oberfläche fördern. Vermeiden Sie centrifugation von Zellsuspensionen bei Geschwindigkeiten, die wahrscheinlich zelluläre Integrität gefährden oder einheitliche Aufwirbelung der abgerufenen BAL-Zellen zu verhindern. BAL-Flüssigkeit enthaltenden Zellen sollten bei 400 xg und 4 ° C für 7 min zentrifugiert werden. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass die Zellsuspensionen sollen bei 4 ° C während der Verarbeitung gehalten werden.

Die Atemwege begegnen zahlreichen Beleidigungen, die zu Entzündungen, Pathogeninvasionen oder bösartigen Transformation führen können. Die Epithelzellen, die das Lungenlumen bilden, bilden eine der Hauptbarrieren des Säugetierkörpers. Zusammen mit alveolaren Makrophagen verhindern sie, dass Umweltbedrohungen über die Atemwege Zugang zum Systemsystem haben. Beispiele für solche Bedrohungen sind organische und anorganische Chemikalien, Bakterien und Viren. Ebenso können spezifische Immunisierungen oder therapeutische Interventionen auf die Lungen ausgelegt werden. In all diesen Fällen ist eine aufwändige Analyse der evozierten Reaktion wichtig, um biologische Prozesse zu verstehen, zu intervenieren oder zu verhindern, die innerhalb des Atmungssystems stattfinden. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ist eine unschätzbare Methode, um solche Reaktionen zu analysieren, da die resultierenden Proben wichtige Informationen über die entzündlichen Reaktionen, Immunmechanismen und Infektionskrankheitsprogression enthaltenDas kann in den pulmonalen Atemwegen 1 , 2 auftreten. Durch die Verwendung von BAL ist es möglich, die infiltrierenden Zellen zu untersuchen. Das kontrastiert mit verdauten Lungen, die eine &quot;schmutzigere&quot; Zellpopulation mit vielen toten und klebrigen Zellen geben. BAL wird durch Einführen einer Kochsalzlösung in die terminalen Bronchiolen und anschließende Gewinnung dieser Lösung durchgeführt. Die abgerufene Lösung kann dann verwendet werden, um residenten Lungen zu quantifizieren und phänotypisch zu analysieren und infundierende entzündliche Zellen zu infiltrieren. Diese Methode wird häufig angewendet, um zellulären Zustrom in Krankheitsmodellen der Atemwege, wie Asthma, chronisch obstruktive pulmonary Disease (COPD) und Infektionskrankheiten Modelle zu untersuchen. Neben der zellulären Zusammensetzung spiegelt sich auch die molekulare Zusammensetzung der pulmonalen Atemwege in der BAL-Flüssigkeit. Um dies zu analysieren, können Enzym-verbundener Immunosorbent-Assay (ELISA), Immunoblot und die simultane Analyse von mehreren Zytokinen durch ein Cytokin-Perlen-Array seingeführt, um die Anwesenheit von Zytokinen und Chemokinen zu beurteilen. BAL ist ein gut etabliertes Verfahren den Einstrom von Entzündungszellen bei entzündlichen Atemwegserkrankungen Tiermodellen zu untersuchen. Die Beobachtung eines veränderten zellulären Einstrom (zB erhöhte Konzentrationen von Lymphozyten, Eosinophilen, Neutrophilen oder) kann zu einem besseren Einblick in die Krankheit führen und kann ein objektiver Parameter sein , die Leistung einer therapeutischen Intervention zu bestimmen. Die genaue und reproduzierbare Interpretation der BAL zellulären Analyse erfordert, dass die BAL korrekt durchgeführt wird, und dass die aufgefangene Flüssigkeit wird richtig gehandhabt und verarbeitet. Der Begriff „Bronchiallavage“ wurde 3 von Stitt vor mehr als achtzig Jahren eingeführt. Im Jahr 1961 erhielt Myrvik Alveolarmakrophagen aus der Lavage von Kaninchenlungen 3. BAL ist jetzt ein häufig verwendetes Verfahren der Lungen im Mausmodell zu analysieren und zu überwachen, noch diere ist noch kein Bericht eines standardisierten BAL Verfahren in der wissenschaftlichen Literatur 4, 5. Darüber hinaus gibt es wahrscheinlich so viele Möglichkeiten , um BAL durchführen , wie es Forschungslabors sind mit der Technik 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Es ist wichtig, dass die Daten aus der BAL repräsentieren die ganze Mäuselunge erhalten, und nicht nur einen Teil der Lunge. Diese Art der Variabilität erschwert die Interpretation und Vergleich der Ergebnisse der verschiedenen Studien. Hier wird ein einfaches, kostengünstiges und reproduzierbares BAL Verfahren wird beschrieben, dass die Sammlung der zellulären und löslichen Fraktion, die in dem Atemweg Lumens der Maus ermöglicht. Kurz gesagt, wird ein Katheter in die Trachea freigelegt o platziertFa anästhesierte Maus. Eine Spritze ist mit dem Katheter verbunden, und eine gepufferte Kochsalzlösung, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält, wird in die Lungen eingeführt. Das Lungenlumen wird durch sanftes wiederholtes Spülen der Kochsalzlösung unter Verwendung des Kolbens entnommen. Der Unterdruck, der während dieses Schrittes angewendet wird, ist minimal, um den Zusammenbruch der Atemwege zu verhindern. Nach der Sammlung sollte die erhaltene BAL weiter verarbeitet werden, um die Zellen durch Durchflusszytometrie aufzuzählen und zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>reizende</td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 Nadel</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>Größe: 0,60 x 30 mm</td></tr><tr><td>26 G x 1/2 Nadel</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td>Größe: 0,45 x 12 mm</td></tr><tr><td>Kunststoffschlauch</td><td>BD Medizintechnik</td><td>427411</td><td>Polyethylen Schlauch, I.D. 0,58 mm (0,023") Außendurchmesser 0,965 mm (0,38") 30,5 m (100')</td></tr><tr><td>Natrium-Pentobarbital</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS ohne Ca2+ Mg2+ oder Phenolrot; steril filtrierte</td></tr><tr><td>1 mL Spritzen</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td>pyrogene und ungiftige</td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools GmbH&nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 50 mL</td><td>TH. Geyer</td><td>7696705</td><td>Frei von Rnase/Dnase/Endotoxin</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 15 mL</td><td>TH. Geyer</td><td>7696702</td><td>Frei von Rnase/Dnase/Endotoxin</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0030 120.094</td><td>Polypropylen</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>sterilfiltriert</td></tr><tr><td>Lebend/tot - EFLUOR 506 EBIOSCIENCE</td><td></td><td>65-0866-18 &nbsp;</td><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff</td></tr><tr><td>CD11c-PE-cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF-PE</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>552126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MHCII-APCefluor780</td><td>Biolegend</td><td>107628&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE-cy5</td><td>VWR</td><td>55-0031-U100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE-cy5</td><td>eBiowissenschaften</td><td>15-0193-83&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-V450</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>560455&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-AF700</td><td>Biolegend</td><td>127621</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Counting Beads</td><td>Life Technologies Europe B.V.&nbsp;</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/CD32</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>96-Well 340 & Mikro; l Ablageplatte</td><td>Falcon</td><td>353263</td> Durchflusszytometer <td>aus natürlichem Polypropylen mit V-Boden</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katheter</td><td>BD Biosciences</td><td>393202</td><td></td></tr></tbody></table>

bronchoalveoläre lavage von murinen lungen zur analyse der entzündlichen zellinfiltration

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveoläre Lavage (BAL) ist ein experimentelles Verfahren, das verwendet wird, um den zellulären und azellulären Gehalt des Lungenlumens ex vivo zu untersuchen, um Einblick in einen laufenden Krankheitszustand zu erhalten. Hier wird eine einfache und effiziente Methode beschrieben, um BAL auf murine Lungen ohne die Notwendigkeit von speziellen Werkzeugen oder Ausrüstung durchzuführen. BAL-Flüssigkeit wird durch Einsetzen eines Katheters in die Trachea von endlich anästhesierten Mäusen isoliert, durch die eine Salzlösung in die Bronchiolen eingeflößt wird. Die eingefleckte Flüssigkeit wird vorsichtig zurückgezogen, um die BAL-Flüssigkeitsabfrage zu maximieren und die Scherkräfte zu minimieren. Diese Technik ermöglicht die Lebensfähigkeit, Funktion und Struktur der Zellen innerhalb der Atemwege und BAL-Flüssigkeit zu bewahren. Es können zahlreiche Techniken angewendet werden, um ein weiteres Verständnis des Krankheitszustands der Lunge zu erhalten. Hier ist eine häufig verwendete Technik zur Identifizierung und Aufzählung verschiedener Immunzellenartenbeschrieben, wobei Cytometry mit einer ausgewählten Gruppe von fluoreszierend markierten Zelloberflächenspezifische Marker kombiniert wird fließen. Die BAL hier vorgestellte Verfahren können auch infektiöse Agenzien, flüssigen Bestandteile oder inhalierter Partikel in murine Lungen zu analysieren.

BAL mit 3 × 1 ml gepufferter Salzlösung, ein Volumen zwischen 2 und 3 ml Nach der Durchführung soll gestellt werden. Die BAL-Flüssigkeit kann weiter analysiert werden, die zelluläre und nichtzelluläre Gehalt zu charakterisieren. Um die Anwesenheit von Cytokinen und Chemokinen zu untersuchen, ELISA 19, Immunoblot 20, und die gleichzeitige Analyse von mehreren Cytokinen durch eine Zytokin bead Anordnung 21 durchgeführt werden. Darüber hinaus kann das Albumin und Gesamtproteingehalt dieses Fluids 22 bestimmt werden. Als Beispiel beschreibt dieses Manuskript wie das zelluläre Gehalt der BAL-Flüssigkeit mittels Durchflusszytometrie analysiert. 24 Stunden nach der sie intratracheal mit Lipopolysaccharid eingeflößt wurden: Die analysierte BAL-Flüssigkeit wurde von den weiblichen Balb / cAnNCrl Mäusen (7 Wochen alt) gesammelt. Die folgenden Antikörper, gekoppelt an ein Fluorophor, were verwendet , um die verschiedenen Zelltypen zu identifizieren: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3e, CD19, Ly6g und CD11b (siehe Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien). Der fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff wurde ebenfalls verwendet. Durch die Verwendung einer Gating - Strategie auf der Grundlage der differenziellen Expression von Antigenen auf den Oberflächen der verschiedenen Zellpopulationen (Abbildung 1), war es möglich , Makrophagen, dendritische Zellen, B - Zellen, T - Zellen, Neutrophilen, Eosinophilen und zu identifizieren. Erstens, Schutt und Dubletten wurden gated basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuparameter. Eine Lebensfähigkeit Farbstoff Gating auf den lebenden Zellen erleichtert. Als nächstes wurden CD11c hoch Zellen und CD11c niedrig Zellen identifiziert. In den CD11c hohen Bevölkerungs wurden identifiziert Makrophagen und dendritischen Zellen basierten auf MHCII und SiglecF Ausdruck ist. In der CD11c niedrig Population, T-Zellen und B-Zellen wurden auf Basis von CD3 &amp; egr; und CD19 Expression identifiziert ist. in the verbleibenden Zellpopulation wurden Neutrophile und Eosinophile, basierend auf der CD11b und Ly-6G Markerexpression identifiziert sind. Zählen Perlen wurden hinzugefügt , um die absoluten Zellzahl der verschiedenen Zellpopulationen zu bestimmen , indem das Verhältnis von bead Ereignissen Ereignisse Zelle 23 verglichen wird . Diese Zählung Perlen wurden basierend auf ihrer Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften (Abbildung 1) identifiziert. Tabelle 4 gibt einen Überblick über die absoluten Zellzahl der verschiedenen Zellpopulationen in der BAL - Flüssigkeit eines naiven Maus und eine Maus , die für 24 h mit 5 ug Lipopolysaccharid stimuliert wurde. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" /> Abbildung 1: Gating - Strategie für den durchflusszytometrischen Nachweis von Makrophagen, dendritische Zellen, T - Zellen, B - Zellen, Neutrophile und Eosinophile iN BAL Flüssigkeit. BAL-Zellen wurden unter Verwendung des beschriebenen BAL-Protokolls isoliert. Die Zellen wurden von Mäusen 24 h nach intratrachealer Instillation von Lipopolysaccharid isoliert. Zählen von Perlen und Zellen wurden auf der Grundlage von Vorwärts- und Seitenstreuungseigenschaften identifiziert. Im Zelltor wurden einzelne Zellen mit Vorwärts- und Seitenstreuung identifiziert. In dieser letzten Population wurden Zellen, die lebendig waren, identifiziert. CD11c hohe Zellen und CD11c niedrige Zellen wurden dann identifiziert. In der CD11c-Hochpopulation wurden Makrophagen und dendritische Zellen auf der Basis von MHCII- bzw. SiglecF-Expression identifiziert. In der CD11c-niedrigen Population wurden T-Zellen und B-Zellen auf der Grundlage der CD3- bzw. CD19-Expression identifiziert. In der verbleibenden Zellpopulation wurden Neutrophile und Eosinophile auf der Basis von CD11b bzw. Ly-6G-Expression identifiziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine</a>Größere Version dieser Figur. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zellpopulation </td><td> Absolute Anzahl von Zellen in naiven Mäusen </td><td> Absolute Anzahl von Zellen in LPS stimulierten Mäusen </td></tr><tr><td> Makrophagen </td><td> 79,612 </td><td> 25,439 </td></tr><tr><td> dendritische Zellen </td><td> 495 </td><td> 671 </td></tr><tr><td> T-Zellen </td><td> 45,271 </td><td> 28,089 </td></tr><tr><td> B-Zellen </td><td> 4,164 </td><td> 2,926 </td></tr><tr><td> Neutrophilen </td><td> 632 </td><td> 566,716 </td></tr><tr><td> Eosinophilen </td><td> 3,483 </td><td> 4,332 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: RepräsentationenTative Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse an der BAL-Flüssigkeit von Naiven und LPS-stimulierten Mäusen.

Der Gesundheitszustand der Lunge spiegelt sich in der Art und Anzahl der Immunzellen, die in den Bronchiolen der Lunge vorhanden sind. Wir beschreiben eine bronchoalveoläre Lavagetechnik, die die Isolierung und Untersuchung von nichtadhärenten Zellen und löslichen Faktoren aus dem unteren Atemtrakt der Mäuse ermöglicht.

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zellulären und azellulären Inhalte des Lungenlumens mittels Bronchoalveolärlavage für ex vivo-Analysen sowie zur Beurteilung des aktuellen Krankheitszustands des Tieres zu gewinnen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der respiratorischen Immunologie bezüglich infektions- und entzündungsbedingter immunologischer Mechanismen zu beantworten, indem die angeborenen zellulären und humoralen Reaktionen in der Lunge quantifiziert werden. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik liegen in ihrer Einfachheit, Effizienz und hohen Reproduzierbarkeit, wobei kein spezielles Gerät oder Werkzeug erforderlich ist.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, stellen Sie einen Katheter her, indem Sie eine 23-Gauge-Nadel in ein 0,5 cm langes Stück transparente, plastische Polyethylen-21-Gauge-Schlauchleitung einführen, und bringen Sie das Tier in Rückenlage. Sichern Sie die Gliedmaßen der Maus und desinfizieren Sie den Hals mit 70 % Ethanol. Anschließend verwenden Sie ein Skalpell, um einen Hautschnitt in der Nähe der Luftröhre anzulegen.Öffnen Sie die Haut, um die Speicheldrüsen freizulegen, und verwenden Sie eine Pinzette, um die Drüsen zu trennen und den Sternohyoidealmuskel freizulegen. Verwenden Sie die Pinzette, um den Muskel um die Luftröhre herum zu eröffnen. Sobald sie sichtbar ist, führen Sie mit der Pinzette eine Baumwollnaht unter dem Trachealgewebe hindurch.Verwenden Sie anschließend eine 26-Gauge-Nadel, um vorsichtig die Mitte der Luftröhre zwischen zwei Knorpelringen zu durchstechen, und führen Sie den vorbereiteten Katheter etwa 0,5 Zentimeter in das Tracheallumen ein. Stabilisieren Sie den Katheter mit der Naht. Laden Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter steriler, ausgewogener Salzlösung, die mit 100 Mikromolar EDTA ergänzt wurde.Schließen Sie die beladene Spritze an den Katheter an und injizieren Sie vorsichtig die Lösung aus physiologischer Kochsalzlösung und EDTA in die Lunge. Wenn die gesamte Kochsalzlösung injiziert wurde, aspirieren Sie die Lösung langsam unter sanfter Massage des Thorax. Es ist sehr wichtig, beim Injizieren und Rückgewinnen der Flüssigkeit aus dem Lungenlumen besonders vorsichtig vorzugehen, um die Rückgewinnung der BAL-Flüssigkeit zu maximieren und Scherkräfte zu minimieren.Wenn die Flüssigkeit im Katheter durch die Nase austritt, befestigen Sie die Naht entlang des Katheters erneut. Sobald das gesamte Aspirat gesammelt wurde, überführen Sie die Flüssigkeit in ein 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis und wiederholen Sie die Lavage zwei weitere Male. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von sieben Minuten abgeschlossen werden.Nach der dritten Bronchoalveolärlavage-Sammlung das gepoolte Aspirat zentrifugieren und das Überstand bei minus 80 Grad Celsius lagern. Den Pellet in 200 Mikrolitern ACK-Lysepuffer resuspendieren. Nach maximal zwei Minuten bei Raumtemperatur den Lysepuffer mit einem Milliliter kalter PBS verdünnen und die Zellen durch Zentrifugation gewinnen.Suspendieren Sie das Pellet in dem geeigneten Volumen PBS entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Proben und aliquotieren Sie die Zellen in die erforderliche Anzahl von Vertiefungen einer 96-Loch-Platte für die Analyse. Sammeln Sie die Zellen durch eine weitere Zentrifugation und suspendieren Sie die Pellets in 50 Mikroliter FC-Block und PBS erneut. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur geben Sie 50 Mikroliter der jeweils geeigneten Antikörpercocktail-Lösung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten bei 4 Grad Celsius, wobei sie vor Licht geschützt werden müssen.Am Ende der Inkubation die Platte zentrifugieren und den Überstand verwerfen, wobei die Pellets zur endgültigen Volumina von 200 µL FAX-Puffer pro Bohrung wieder aufgeschwemmt werden, um eine Durchflusszytometrie-Analyse durchzuführen. Mithilfe einer Gating-Strategie, die auf der unterschiedlichen Expression von Antigenen an der Oberfläche verschiedener Zellpopulationen der Bronchoalveolärlavage basiert, können verschiedene Immunzelltypen identifiziert werden. Die Zellen und Singuletts werden entsprechend ihren Vorwärts- und Seitwärtsstreuungseigenschaften ausgewählt.Die lebenden Zellen, die nicht durch die Live/Dead-Färbung angefärbt wurden, werden aussortiert (gegated), gefolgt von der Identifizierung der Cd11c High- und Cd11c Low-Zellen. In der Cd11c High-Population können Makrophagen und dendritische Zellen anhand ihres jeweiligen MHC-II- und SinglecF-Ausdrucks identifiziert werden. In der Cd11c Low-Population lassen sich T-Zellen und B-Zellen anhand ihres jeweiligen CD3/CD19- und MHC-II-Ausdrucks unterscheiden.In den verbleibenden Zellen können Eosinophile und Neutrophile anhand ihres jeweiligen Cd11b- oder Ly-6G-Marker-Ausdrucks identifiziert werden. Zum Bestimmen der absoluten Zellzahlen der verschiedenen Zellpopulationen können auch Zählperlen hinzugefügt werden, indem das Verhältnis von Perlen- zu Zellereignissen verglichen wird, beispielsweise bei naiven im Vergleich zu LPS-stimulierten Tieren. Nach der Gewinnung der BAL-Flüssigkeit können weitere Methoden wie ELISA, Immunoblot oder Zytokin-Perlenarray durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum azellulären Inhalt der BAL-Flüssigkeit zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, um den zellulären und azellulären Inhalt des Lungenlumens von Mäusen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine BAL effizient und reproduzierbar durchführt.

bronchoalveolar-lavage-murine-lungs-to-analyze-inflammatory-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir illustrieren nicht-chirurgische Lieferung von Testmaterialien in den Lungen von narkotisierten Mäusen über die Luftröhre. Dieses Verfahren ermöglicht die Lunge Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Erregern, Zytokine, Antikörper, Perlen, Chemikalien oder Farbstoffe. Wir beschreiben ferner die Ernte und Verarbeitung der Lunge und der Lunge Lymphknoten (LDLNs) für die Durchflusszytometrie.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Quelle: Venuprasad, K., et al. Intratracheale Verabreichung von Haemophilus influenzae in Mausmodellen zur Untersuchung von Atemwegsentzündungen. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Entnahme und Verarbeitung von bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit aus einer euthanasierten Maus, die mit nicht typisierbaren Haemophilus influenzae infiziert war, für die nachgelagerte Analyse.

Entnahme von bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit aus einem Mausmodell, das mit nicht typisierbarem Haemophilus influenzae infiziert war

Dieses Video zeigt die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Identifizierung und Zählung verschiedener Immunzellen in bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit. Zunächst werden einzelne Immunzellen mit einem Viabilitätsfarbstoff identifiziert, gefolgt von einer differentiellen Färbung von Oberflächenmarkerproteinen, die eine genaue Zählung der einzelnen Zelltypen ermöglicht.

Identifizierung und Zählung von Immunzellen in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit mittels Durchflusszytometrie

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Identifizierung von Immunzellen, die sich in der Lunge von Mäusen befinden. Nach der Isolierung von Zielimmunzellen aus murinem Lungengewebe werden sie mit einem Cocktail aus Fluorophor-markierten Antikörpern gegen spezifische Marker auf angeborenen und adaptiven Immunzellen oberflächenmarkiert. Zusätzlich werden Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen mit einem intrazellulären Marker markiert. Anschließend werden die verschiedenen...

Eine in vitro Methode zur Identifizierung von angeborenen und adaptiven Immunzellen, die sich in der Lunge von Mäusen befinden

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben.

Verfahren zur Erzeugung von Lungen Neutrophilie Mit aerosolisiertes Lipopolysaccharide

Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Verschiedene Verfahren wurden für die Modellierung von bakterieller Pneumonie bei Mäusen in der Literatur beschrieben. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive, kostengünstige, schnelle Methode zur Lungenentzündung durch Aspiration induzierenden (dh Inhalation) eines bakteriellen Inokulums in den Oropharynx pipettiert. Downstream Methoden zur Beurteilung der Lungen angeborenen Immunantwort sind auch detailliert.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

In dieser Studie stellen wir ein effektives und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung der Immunpopulationen der murinen Atemwege vor. Wir bieten auch eine Methode zur Identifizierung aller angeborenen und adaptiven Immunzellen, die sich in den Lungen gesunder Mäuse befinden, unter Verwendung eines 9-farbbasierten Durchflusszytometrie-Panels.

Durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung der angeborenen und adaptiven Immunzellen der murinen Lunge

Hier beschreiben wir die Messung von Husten mit einem nicht-invasiven und Echtzeit-Ganzkörperplethysmographie-System (WBP) und die normativen Verfahren zur Entnahme von Gewebeproben von Mäusen und stellen einige Methoden zur Beurteilung von Atemwegsentzündungen vor.

Methoden zum Nachweis von Husten und Atemwegsentzündungen bei Mäusen

Lernen Sie die bronchoalveoläre Lavage zur Analyse entzündlicher Zellinfiltrationen in murinen Lungen. Diese einfache Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Mechanismen bei Atemwegserkrankungen.

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

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