Verdunstungsmindernde Kultur Zustand Erhöht die Reproduzierbarkeit von mehrzelligen Sphäroidformation in Mikrotiterplatten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit der gleichmäßigen Sphäroidbildung unter Verwendung einer Liquid-Overlay-Technik in 384-Well-Platten zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die übermäßige Wiederverwendung von Medien von mehreren Platten reduziert und dadurch die Reproduzierbarkeit der Sphäroidbildung verbessert. Wir haben die Methode zur Kultivierung von 3D-Sphäroiden für Arthropoden-Screening-Tests in unserem Labor entwickelt und validiert, und unsere Studie bestand darin, den Kanteneffekt in den Platten der mehrzelligen Kulturen zu bewerten.

Heute werde ich das Verfahren zusammen mit Sona, einem Poster aus dem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie null Komma sieben, fünf Gramm Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt abwiegen und zu 100 Millilitern McCoy's 5A-Medium mit oder ohne Phenolrot und ohne Serum hinzufügen. Erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle und schwenken Sie sie alle ein bis zwei Minuten, um die Agarose vollständig aufzulösen.

Autoklavieren Sie dann die Lösung, um sie zu sterilisieren. Nachdem Sie die autoklavierte Agarose auf etwa 70 Grad Celsius abkühlen gelassen haben, filtrieren Sie sie durch einen 500-Milliliter-Nullkomma-Zwei-Mikrometer-Flaschenaufsatzfilter in einer Laminar-Flow-Box. Wenn nicht die gesamte Lösung auf einmal verwendet wird, aliquotieren Sie sie.

Lagern Sie diese gebrauchsfertige Agaroselösung aseptisch in einem Kühlraum oder einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius für bis zu vier Wochen. Wenn Sie in einer Flow-Box arbeiten, installieren Sie eine Dosierkassette mit Kunststoff- oder Metallspitze in einem Kombi-Reagenzienspender. Legen Sie das Schlauchgewicht in ein Gefäß mit 70 Prozent Ethanol und grundieren Sie dann die Kassette.

Bewegen Sie dann das Schlauchgewicht in ein Gefäß mit PBS und grundieren Sie es erneut. Erhitzen Sie anschließend ein gelagertes Aliquot gefilterter Agaroselösung in der Mikrowelle, um es zu schmelzen. Grundieren Sie die Dispensierkassette mit Agaroselösung und starten Sie dann das Protokoll, um mit 384 Wells in Gewebekultur behandelte Mikroplatten mit 15 Mikrolitern gefilterter Agaroselösung zu beschichten.

Lassen Sie die Agarose 15 bis 20 Minuten in der Platte abkühlen, bevor Sie die Zellen entweder wie im nächsten Abschnitt des Videos beschrieben aussäen oder bei vier Grad Celsius und vor direktem Licht geschützt lagern. Um die Dosierkassette zu reinigen, legen Sie das Schlauchgewicht in 70 bis 80 Grad Celsius steriles Wasser und drücken Sie die Prime-Taste am Spender. Dadurch wird die verbleibende Agarose in den Kassettenspitzen und den Schläuchen entfernt.

Der folgende Zellaussaatprozess sollte unter sterilen Bedingungen und in einer Laminar-Flow-Box durchgeführt werden. Beginnen Sie damit, die erforderliche Anzahl von mit Agarose beschichteten 384-Well-Mikrotiterplatten aus dem Kühlhaus zu nehmen und sie 15 Minuten lang auf Raumtemperatur äquilibrieren zu lassen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit den Kombi-Reagenzienspender für das Cell Seeing vor, indem Sie eine Standard-Röhrchendosierkassette mit 70 Prozent Ethanol und sterilem PBS grundieren.

Stellen Sie anschließend mit den manuellen Einstelltasten am Spender das Sehvolumen auf den erforderlichen Mikroliter und die Ausgabegeschwindigkeit auf mittel ein. Verwenden Sie ein rekombinantes Zelldissoziationsenzym, um adhärente HCT116-Zellen des menschlichen kolorektalen Karzinoms aus einem Gewebekulturkolben zu entfernen. In einem sterilen Becherglas wird ein Zellsuspensionsmaterial mit Zellen mit einer Dichte von 2,5 mal 10 bis 10 Zellen pro Milliliter pro Vertiefung in 50 Mikroliter vollständiges Wachstumsmedium hergestellt.

Wenn mehr als eine 384-Well-Platte ausgesät wird, verwenden Sie einen Magnetrührer, um zu verhindern, dass sie sich am Boden des Becherglases absetzen. Geben Sie mit einem Dispenser die 2500 Zellen in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte. Lassen Sie die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.

Nehmen Sie in der Zwischenzeit einen Verdampfungs-reduzierenden Mikroplattendeckel und geben Sie mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vier Milliliter fünf Prozent Dimethylsulfoxid in die linke Seitenwanne ab und streichen Sie langsam auf und ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der Mulde auf der rechten Seite. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit, die in die Seitenrinnen gegeben wird, nicht in der Mitte des Deckels zusammenfließt und einen Spalt für den Gasaustausch lässt.

Wenn zu viel Flüssigkeit hinzugefügt wird, sickert sie in die Außenseite des Deckels und gelangt anschließend in die äußere Vertiefung der 384-Gewebekulturplatte. Nach Ablauf von 30 Minuten untersuchen Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Eine 30-minütige Ruhezeit der Platten ermöglicht es den Zellen, sich vollständig im Vertiefungsboden und nahe beieinander abzusetzen, was für die Bildung einzelner Sphäroide pro Vertiefung wichtig ist.

Zentrifugieren Sie die ausgesäten Platten 15 Minuten lang bei der vierfachen G. Füllen Sie nach dem Schleudern das Flüssigkeitsreservoir der 384 Gewebekulturplatte mit sterilem Wasser und ersetzen Sie die normalen Plattendeckel durch die mit Flüssigkeit gefüllten Umgebungsdeckel. Legen Sie die Platten in einen 37 Grad Celsius heißen Rotationsinkubator mit 95 Prozent Luftfeuchtigkeit, fünf Prozent CO2 und 20 Prozent Sauerstoff und lassen Sie die Zellen vier Tage lang zu mehrzelligen Tumorsphäroiden oder MCTS aggregieren. Vermeiden Sie es, die Inkubatortür in den folgenden Tagen zu lange zu öffnen, damit die Luftfeuchtigkeit nicht abrupt abfällt.

Verwenden Sie am vierten Tag nach der NCTS-Bildung einen automatischen Mikroplatten-Waschspender, um 30 Mikroliter vorgewärmtes Medium in jede Vertiefung zu geben. Stellen Sie die MCTS wieder in den Inkubator und lassen Sie die MCTS wachsen, bis sie die gewünschte Größe für Experimente erreicht haben. Um das Medium alle drei Tage auszutauschen, stellen Sie die Z-Höhe des Waschverteilers empirisch ein und stellen Sie die Dosiergeschwindigkeit und die Geschwindigkeit, mit der der Waschverteiler in die Vertiefungen fährt, mit der niedrigsten Geschwindigkeit ein, um Turbulenzen in den Vertiefungen zu minimieren.

Saugen Sie 30 Mikroliter Medium pro Vertiefung an und ersetzen Sie es durch 30 Mikroliter frisches, vorgewärmtes Medium. Anschließend werden die Zellen wieder in den Inkubator gestellt. Bilden Sie die MCTSs in einem automatisierten Bildgebungssystem mit hohem Inhalt unter Verwendung eines vierfachen Luftobjekts mit einer numerischen Apertur von 16 ab.

Stellen Sie mit der Imaging-Software die Belichtungszeit auf 11 Millisekunden und das Binning auf vier x vier ein. Passen Sie die Anzahl und den Abstand der Z-Stapel und das Pixel-Binning wie gewünscht an, damit das Experiment ein vollständiges MCTS in jedem Well erfasst. Verarbeiten Sie die 2D-Bilder schrittweise, um die MCTS-Fläche, die Haupt- und Nebenachse, den Umfang und die Festigkeit zu messen.

Spezifische Anweisungen finden Sie in den begleitenden M-Code- und Text-Readme-Dateien. Um die potenzielle Anwendbarkeit der Routine zu bestimmen, wurden sieben Tage alte MCTS vier Tage lang mit unterschiedlichen Konzentrationen der Krebsmedikamente Paclitaxel, PTX, Vincristin, VCR, Oxalyplatin, OXA, Doxyrubicin, DOX und fünf Flururacil, 5-FU, in drei verschiedenen Konzentrationen behandelt. Hier sind Bilder der MCTS zu sehen.

Diese Bilder wurden analysiert, um die Fläche, die Haupt- und Nebenachsen, den Umfang und die Festigkeit von medikamentös behandelten MCTS im Vergleich zu Kontrollen, CTLs, zu bestimmen. Zur Berechnung des geometrischen Volumens wurden die Haupt- und Nebenachse verwendet. Es gab eine konzentrationsabhängige Abnahme der MCTS-Fläche und des MCTS-Volumens nach medikamentöser Behandlung.

Obwohl ein Nullpunkt von einem Mikrogramm pro Milliliter Vincrystin und null Komma vier Mikrogramm pro Milliliter Doxyrubicin und fünf Fluorouracil zu einer Vergrößerung der MCTS-Fläche führte, wurde das Volumen erst nach dem Nullpunkt null ein Mikrogramm pro Milliliter Vincrystine signifikant erhöht. Der MCTS-Perimeter unterschied sich nur bei den höchsten Konzentrationen von Packlitaxel, Doxyrubicin und Five Fleurouracil, was sich vollständig auf die MCTS-Größe auswirkte. Die Behandlung mit Packlitaxel und Vincrystin bei null Komma zwei, fünf Mikrogramm pro Milliliter und null null sechs Mikrogramm pro Milliliter und Doxyrubicin und fünf Fleurouracil bei 100 Mikrogramm pro Milliliter führte zu einer signifikanten Abnahme der Festigkeit, was auf einen vollständigen bis teilweisen Zerfall der MCTS hinweist.

Zusammengenommen zeigen diese Daten den Nutzen dieser Methode bei der Untersuchung potenzieller Krebsmedikamente. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass nicht alle Zelllinien für eine bestimmte 3D-Kulturmethode geeignet sind und verschiedene Zelllinien Sphäroide bilden, die Unterschiede in der Sphäroidform, -größe, -histologie und -wachstumskinetik aufweisen.

Die von uns entwickelte stimulierende Routine ermöglicht eine effektive Bestimmung der Sphäroidgröße, insbesondere bei teilweise desintegrierten, medikamentös behandelten Sphäroiden, die keine klar definierte Grenze für die Messung der Querschnittsfläche haben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, dass die hier vorhandene Modifikation keine zusätzlichen Geräte oder Verbrauchsmaterialien erfordert und routinemäßig in Ihrem Arthropoden-Screening-Labor durchgeführt werden kann.