Name: Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Lernen Sie einen leitfähigen Biosensor-Assay mit hybridem β-Lactamase zur Detektion von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht schnelle biomolekulare Analysen.

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Die Autoren erkennen der wallonischen Region Belgiens im Rahmen der SENSOTEM und NANOTIC Forschungsprojekte sowie die nationalen Fonds für die wissenschaftliche Forschung (F.R.S.-F.N.R.S) für ihre finanzielle Unterstützung.

(1) Protein Probenvorbereitung
<ol><li>Produzieren Sie und reinigen Sie das Hybrid-Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3 wie in unserer vorherigen Studie15berichtet. Speichern Sie das Protein in 50 mM Phosphat-Puffer pH 7.4 mit folgender Zusammensetzung: 0,24 g KH2PO4 in 800 mL destilliertem Wasser aufgelöst, 1,44 g Na2HPO4 , 8 g NaCl und 0,2 g KCl beheben den pH-Wert der Lösung auf 7,4 vor Anpassung der letzte Band der Lösung 1 sterilisieren L. Filter die Proteinlösung.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Henne Eiweiß Lysozym (HEWL) Stammlösung. Lösen Sie 100 mg (40.000 Einheiten/mg) im Handel erworbenen HEWL in 10 mL von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS siehe Schritt 2.1.1 auf). Sterilisieren Sie die Proteinlösung durch Filtration, die Verwendung von Filtern mit einem Cutoff von 0,22 μm.</li>
</ol>2. Biosensor-Assays
<ol><li>
Lösung und Puffer Vorbereitung
	<ol>
<li>Bereiten Sie 50 mM PBS durch 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na2HPO40,24 g KH2PO4 in 800 mL destilliertem Wasser auflösen. Passen Sie auf pH 7.4 mit 1 N HCl oder 1 N NaOH vor dem Einstellen der Lautstärke der Lösung 1 L. Filter sterilisieren und bei 4 ° c lagern</li>
		<li>Bereiten Sie eine Sättigung/blockieren Lösung durch Auflösen von 3 g Casein Hydrolysat in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie eine verbindliche Lösung durch Auflösen von 1 g Casein Hydrolysat in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>Vorbereiten eine Waschlösung (0,1 % Tween - PBS) durch Zugabe von 100 μl der Tween 20 (100 %) in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Shop bei 4 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Elektrode Vorbereitung Lösung (1 % Triton x-100-PBS) durch Zugabe von 1 mL der Triton x-100 (100 %) in 100 mL PBS zubereitet wie oben beschrieben (siehe Schritt 2.1.1). Shop bei 4 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Elektrode Regenerationslösung (3,5 M KCl) durch Auflösen von 26 g KCl in destilliertem Wasser zu einem Endvolumen 100 mL. Filtern Sie sterilisiert und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 5 mM NaCl-Lösung durch Auflösen von 0,29 g NaCl in destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L. Filter sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Dann bereiten Sie eine Erkennung-Lösung (4 mM Penicillium) durch Auflösen von 26,7 mg Penicillium in 20 mL 5 mM NaCl-Lösung. Filter zu sterilisieren und Lagerung bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sensor-Vorbereitung und regeneration Hinweis: Die Polyaniline beschichtete Sensor-Chips wurden entwickelt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität von Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Die Beschreibung des Sensors sowie die Polyaniline Elektro-Polymerisation-Protokolle verwendet, um diese Sensoren zu synthetisieren sind detailliert in ihrer vorherigen Arbeit17. Kurz, nutzt dieses System wiederverwendbare Sensoren von acht einzelnen Chips, die von klassischen Printed Circuit Board (PCB) Techniken hergestellt wurden. Einzelnen Chips bestehen aus drei Elektrode runden Flecken. Die oberste ist die Arbeitselektrode auf welche Polyaniline Electro synthetisiert wurde. Die Mitte ist die Bezugselektrode und die unteren Elektrode bildet die Gegenelektrode. Sowohl die Referenz und die Zähler-Elektroden sind funktionalisiert mit soliden Ag/AgCl Amalgam auf die CO2-Schicht.<ol>
<li>Führen Sie 3 Wäschen der Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well Elektrode Vorbereitung Lösung (1 % Triton x-100-PBS, siehe Schritt 2.1.5.). Führen Sie jedem Waschgang für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.</li>
		<li>Spülen Sie die Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well von destilliertem Wasser für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.</li>
		<li>Regenerieren Sie die Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well der Regenerationslösung (3,5 M KCl, siehe Schritt 2.1.6) über Nacht bei 4 ° C oder 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>3 Wäschen der Elektroden durch Eintauchen der Tipps in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well des Phosphat-Puffer Kochsalzlösung durchzuführen (siehe Schritt 2.1.1.). Durchführen Sie jedem Waschgang für 2 Minuten mit schonendes Mischen bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verbindliche Assay durchgeführt auf dem sensor
	<ol>
<li>HEWL Mantel auf die PANI (Polyaniline) Oberfläche der Elektrode durch die Hinterlegung einer 15 µL Drop von 40 µg/mL HEWL mit PBS-Puffer auf der Elektrodenoberfläche vorbereitet. Über Nacht bei 4 ° C oder 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie drei wäscht von Elektroden mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (siehe Schritt 2.1.1) durch die Elektrode Teile des Sensor-Chips in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 µL/Well des Phosphat-Puffer Kochsalzlösung eintauchen. Führen Sie jedem Waschgang für 2 min bei Raumtemperatur schonendes Mischen.</li>
		<li>Die Elektroden durch Zugabe von 50 µL Tropfen die blockierende Lösung zu sättigen (siehe Punkt 2.1.2) auf der Elektrodenoberfläche. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dann waschen dreimal wie beschrieben in der vorherigen Schritt (siehe Punkt 2.3.2).</li>
		<li>Die BlaP-Kabine-Lys3-Lösung für 20 µg/mL in verbindlichen Lösung verdünnen (siehe Punkt 2.1.3) und einen 15 µL Tropfen verdünnte Lösung auf die Elektroden. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach Antigen-gemeinnützige Reaktion zu waschen dreimal wie beschrieben im vorherigen Schritt die Waschlösung verwenden (siehe Schritt 2.1.4). Spülen Sie die Elektrode einmal mit PBS (siehe Schritt 2.1.1).</li>
		<li>Schließen Sie für die Erkennung den Sensor-Chip über den Kupfer-Schaltung Teil, ein digital-Multimeter. Dann, die Sensor-Antwort durch die Anwendung eines Tropfen 50 µL Erkennung Lösung zu initiieren (siehe Schritt 2.1.7) auf den positiven Elektroden und Anwendung einen Tropfen 50 µL NaCl 5 mM Lösung auf den negativen Elektroden (siehe Schritt 2.1.7). 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Überwachen Sie den Leitwert mit einem digitalen Multimeter. Hinweis: Das Multimeter wurde durch Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität von Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. bereitgestellt. Diese Potentiostaten ist computergesteuert über einen USB-Port und die acht verschiedenen Chips des Sensors gleichzeitig analysiert. Die Software erstellt von Yunus und Kollegen17 erzeugt einen Echtzeit-Plot, der die Messungen der Leitfähigkeit unterscheiden sich die Referenz und Sample Elektroden gegen die Zeit darstellt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li>
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<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+conserved+cryptic+epitopes+of+infectious+agents+by+single+domain+antibodies.+African+trypanosomes+as+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm.</a> J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).</li>
<li>Thanongsaksrikul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+V+H+H+that+neutralizes+the+zinc+metalloproteinase+activity+of+botulinum+neurotoxin+type+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A.</a> J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+antigen+immunosensing+based+on+mixed+self-assembled+monolayers%2C+camel+antibodies+and+colloidal+gold+enhanced+sandwich+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).</li>
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<li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+easy+development+of+versatile+tools+to+study+protein%2Fligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions.</a> Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).</li>
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<li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test%2C+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li>
<li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li>
<li>Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+of+porous+polypropylene+membranes+with+polyaniline+for+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization.</a> Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).</li>
<li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay%22%5BJournal%5D)">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li>
<li>Worn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).</li>
<li>Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+allosteric+protein+switches+by+domain+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">Engineering allosteric protein switches by domain insertion.</a> Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).</li>
<li>Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+protein+switches+based+on+an+ensemble+model+of+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Design of protein switches based on an ensemble model of allostery.</a> Nat Commun. 6, 6968(2015).</li>
<li>Collinet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+accepted+insertions+of+proteins+within+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functionally accepted insertions of proteins within protein domains.</a> J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).</li>
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<li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li>
<li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.gsma.com/connectedliving/wp-content/uploads/2013/06/Socio-economic_impact-of-mHealth_EU_14062013V2.pdf">Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union</a>. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Arbeit präsentieren wir eine Methode, um eine gemeinnützige Verwendung der BlaP β-Lactamase als ein Trägerprotein funktionalisieren und wir zeigen, dass wir die daraus resultierende Hybrid-Protein in eine potentiometrische Sensor-Assay erfolgreich umsetzen können. Die wichtigste Neuerung Aspekt unserer Arbeit im Vergleich zu anderen Biosensor-Assays ist die kovalente Kupplung Teil der Antikörper, die enzymatische Aktivität, die das elektrische Signal generiert. Dieses so genannte Proteintechnologie Einfügung st...

Biosensoren sind analytische Geräte, die eine Bio-molekulare Interaktion mit physikalischen oder chemischen Signalgeber als Wandler1kombinieren. Die aufgezeichneten Signale können dann interpretiert und umgewandelt, um die Wechselwirkungen zwischen den freien und immobilisierten Partnern zu überwachen. Die meisten der Biosensoren beinhalten die Verwendung eines Antikörpers Analyten wie Hormone oder andere Erreger Marker2zu erkennen. Anderen Sensor-Formate können verwendet werden und sind Masse-basierte, magnetische, optische oder elektrochemische Biosensoren. Letztere gehören zu den am häufigsten verwendeten Sensoren und Funktion durch eine verbindliche Veranstaltung in ein elektrisches Signal umwandeln. Die Aufführungen und Empfindlichkeiten aller Antikörper-basierten Biosensoren sind stark abhängig von im Wesentlichen zwei Parameter: (i) die Qualität des Antikörpers und (Ii) die Eigenschaften des Systems verwendet, um das Signal2zu generieren.
Antikörper sind hochmolekulare Masse dimeres Proteine (150 – 160 kDa), die aus zwei schweren Ketten und zwei leichten Ketten bestehen. Die Interaktion zwischen den leichten und schweren Ketten wird meist durch hydrophobe Wechselwirkungen sowie eine konservierte Disulfid Bindung stabilisiert. Jede Kette enthält eine Variable Domäne, die mit dem Antigen im Wesentlichen über drei hypervariablen Regionen benannt ergänzende Bestimmung Regionen (CDR1-2-3) interagiert. Trotz der zahlreichen Fortschritte auf dem Gebiet der großen Ausdruck in voller Länge Antikörper mit kostengünstigen Expressionssysteme (z. B. E. Coli) führt oft zu der Produktion von instabilen und aggregierte Proteine. Deshalb verschiedene Antikörperfragmente entwickelt haben, wie z. B. Single-Chain Variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa) Fragmente. Sie bestehen aus den Variablen Domänen von bzw. einem schweren und einem leichten Ketten, die durch eine synthetische Aminosäure-Sequenz kovalent verknüpft sind. Aber diese Fragmente häufig zeigen eine schlechte Stabilität und haben die Tendenz zu aggregieren, da sie einen Großteil ihrer hydrophoben Region zu Lösungsmittel4aussetzen. In diesem Zusammenhang scheinen einzelne Kette Kameliden Antikörperfragmente, genannt Nanobodies oder FHKW, hervorragende Alternativen zu ScFvs. Diese Domains entsprechen den Variablen Domänen der Kameliden Single-Kette Antikörper. Im Gegensatz zu herkömmlichen Antikörper Kameliden Antikörper sind frei von Lichterketten und enthalten nur zwei schwere Ketten5. Nanobodies sind daher die kleinste Monomeren Antikörperfragmente (12 kDa) Antigen ähnlich dem des herkömmlichen Antikörper6Affinität binden. Darüber hinaus präsentieren sie verbesserte Stabilität und Löslichkeit im Vergleich zu anderen Full-length Antikörper oder Antikörperfragmente. Zu guter Letzt lassen ihre kleine Größe und erweiterte CDR3 Schlaufen kryptische Epitope erkennen und binden Sie an Enzym aktiven Zentren7,8. Heute, diese Domains erhalten große Aufmerksamkeit und wurden auf die Biosensor-Technologie kombiniert. Z. B. Huang Et Al. entwickelten eine gemeinnützige-basierten Biosensor für die Erkennung und Quantifizierung von menschlichen Prostata-spezifischen Antigens (PSA)9.
Wie bereits erwähnt-oben ist ein wichtiger Parameter in Biosensor-Assays die Effizienz des Systems verwendet, um das elektrische Signal zu erzeugen. Aus diesem Grunde Enzymbasis elektrochemische Biosensoren immer größer werdende Aufmerksamkeit erregt haben und für verschiedene Anwendungen wie Gesundheit, Lebensmittelsicherheit und Umweltüberwachung verbreitet. Diese Biosensoren verlassen sich auf die katalytische Hydrolyse eines Substrats durch ein Enzym, das elektrische Signal zu generieren. In diesem Zusammenhang β-Lactamases erwiesen sich bestimmten, sensiblen und einfacher umzusetzen experimentell als viele andere Enzyme z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettich Peroxidase10. Β-Lactamases sind Enzyme, die für bakterielle Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika sind durch sie hydrolysieren. Sie sind Monomere, sehr stabil, effizient, und klein. Darüber hinaus generieren Domäne/Peptid Einfügungen in β-Lactamases bifunktionale Chimäre Proteinen, die gezeigt wurden, und effiziente Werkzeuge, um Protein-Ligand-Interaktionen zu untersuchen. In der Tat, haben jüngste Studien gezeigt, dass Einfügen von Variablen Antikörperfragmente in TEM1 β-Lactamase Ergebnisse in ein chimäres Protein, die in der Lage, mit hoher Affinität zu ihren Ziel-Antigen gebunden bleibt. Interessanterweise zeigte die Antigen-Bindung allosterische Verordnung TEM1 katalytische Aktivität11,12zu induzieren. Darüber hinaus zeigten wir in mehreren Studien, dass Protein Domäne einführen in eine permissive Schleife des Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase Funktionsproteine Chimären erzeugt, die gut geeignet zur Überwachung von Protein-Ligand-Interaktionen13 ,14. Wir eingefügt vor kurzem eine gemeinnützige, Fahrerhaus-Lys3, in diesem freizügigen Insertionsstelle BlaP15benannt. Diese gemeinnützige zeigte an Henne-Ei-weiß Lysozym (HEWL) binden und seine enzymatische Aktivität16zu hemmen. Wir haben gezeigt, dass das erzeugte Hybrid-Protein, benannt BlaP-Fahrerhaus-Lys3, eine hohe Spezifität erhalten / Affinität gegen HEWL, während die β-Lactamase-Aktivität blieb unverändert. Dann haben wir erfolgreich kombiniert die β-Lactamase-Hybridtechnologie, eine elektrochemische Biosensor und zeigte, dass die Höhe der erzeugte elektrische Signal abhängig von der Interaktion zwischen BlaP-Fahrerhaus-Lys3 und HEWL auf einer Elektrode immobilisiert. Hydrolyse von β-Lactam-Antibiotika durch BlaP induziert in der Tat eine Proton-Release, die in einem quantitativen elektrisches Signal umgewandelt werden kann. Diese Kombination von β-Lactamase Hybridtechnik mit eine elektrochemische Biosensor ist schnell, empfindlich, quantitative und ermöglicht Echtzeit-Messung von das erzeugte Signal. Diese Methode wird hier beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>V000225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris&ndash; HCl</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Alanin</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>HClO4</td><td>Fluka</td><td>34288</td><td>1M HClO4 Lösung, Vertreiber : Sigma-Aldricht</td></tr><tr><td>Kaseinhydrolysat</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>22090</td><td></td></tr><tr><td>Benzylpenicillin Natrium</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>B0900000</td><td></td></tr><tr><td>Hühnereiweiß Lysozym</td><td>Roche</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxidlösung</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>380539</td><td>28% NH3&nbsp; in H2O, gereinigt durch Doppeldestillation (konzentriert?)</td></tr><tr><td>Labor-Verbrauchsmaterialien6-Well-Platte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>CELLSTAR 6-Well Plate</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>WTW</td><td>1AA110</td><td>Lab pH Meter inoLab pH 7110</td></tr><tr><td>Vakuum- und Filtersystem</td><td>Nalgene</td><td>NALG300-4100</td><td>Filterhalter mit Empfänger, Verteiler : VWR</td></tr><tr><td>potentiometrische Sensorchips</td><td></td><td></td><td>von Yunus und Kollegen (Ref 16)</td></tr><tr><td>PGSTAT30 Autolab</td><td>Metrohm Autolab</td><td></td><td>eingestellt, Nachfolger Autolab PGSTAT302N</td></tr><tr><td>Digitalmultimeter, METRAHit 22M</td><td>Gossen Metrawatt</td><td></td><td>abgekündigt, Nachfolger Metrahit Base</td></tr></tbody></table>

die verwendung eines β-lactamase-basierte conductimetric biosensor-assays, biomolekulare wechselwirkungen zu erkennen

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensoren werden immer wichtiger und implementierte in verschiedenen Bereichen wie Erregernachweis, molekulare Diagnostik, Umweltüberwachung und Kontrolle der Lebensmittelsicherheit. In diesem Zusammenhang wird β-Lactamases als effiziente Reporter Enzyme in mehreren Studien der Protein-Protein-Interaktion verwendet. Darüber hinaus fördert ihre Fähigkeit, Einfügungen von Peptiden oder strukturierte Proteine/Domains stark anzunehmen die Nutzung dieser Enzyme um Chimären Proteinen zu erzeugen. In einer aktuellen Studie einer einzelnen Domäne Antikörper-Fragment in der Bacillus Licheniformis BlaP β-Lactamase eingelegt werden. Diese kleinen Domänen, auch genannt Nanobodies, gelten als Antigen-bindenden Domänen einzelne Kette Antikörper von Camelids. Wie üblich Doppelkette Antikörper zeigen sie hohen Affinitäten und Besonderheiten für ihre Ziele. Das daraus resultierende Chimäre Protein ausgestellt eine hohe Affinität gegen sein Ziel unter Beibehaltung der β-Lactamase-Aktivität. Dies deutet darauf hin, dass die gemeinnützige und β-Lactamase Moieties funktionsfähig bleibt. In der vorliegenden Arbeit berichten wir ein detailliertes Protokoll, das unsere Hybrid-β-Lactamase-System der Biosensor-Technologie kombiniert. Die spezifische Bindung der gemeinnützige Ziel kann dank einer conductimetric Messung der Protonen durch die katalytische Aktivität des Enzyms freigegeben erkannt werden.

Design und Engineering von Chimären Protein BlaP-Fahrerhaus-Lys3
Abbildung 1 stellt das Einfügen der Fahrerhaus-Lys3 in eine permissive BalP Klasse A β-Lactamase-Schleife aus Bacillus Licheniformis. Die Aufnahme wurde zwischen Rückstände Asp198 und Lys199 durchgeführt. Ein Thrombin-Spaltstelle wurde auf jeder Seite der Kabine-Lys3 eingeführt. Zellen mit einer konstitutiven Expressionsplasmid Codierung der BlaP-Fahrerhaus-L...

Dabei berichten wir über eine neue Methode, um Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines conductimetric Biosensors basierend auf die β-Lactamase-Hybridtechnologie zu studieren. Diese Methode beruht auf der Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse des β--Lactame.

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Das allgemeine Ziel dieses leitfähigkeitsbasierten Biosensor-Assays besteht darin, biomolekulare Wechselwirkungen mithilfe der hybriden Beta-Lactamase-Technologie nachzuweisen. Wir beschreiben eine Methode zum Nachweis von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen unter Verwendung eines chimären Beta-Lactamase-Proteins. Das Prinzip dieser Methode beruht auf der Detektion der Bindung durch Messung der Protonenfreisetzung aus der Beta-Lactamase-Aktivität.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Immunosensoren liegt in der Verwendung einer chimären Beta-Lactamase, wodurch durch Einsatz eines Hybridproteins kostengünstigere und schnellere Nachweisverfahren ermöglicht werden. Das Verfahren wird von Mathieu Dondelinger, einem Doktorand, demonstriert. Beginnen Sie das Verfahren mit der Probenvorbereitung und Lösungsherstellung, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Bereiten Sie die wiederverwendbare Elektrode vor, indem Sie die Spitzen für zwei Minuten in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte eintauchen, die je Vertiefung 300 µL Elektrodenvorbereitungslösung bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen enthalten.Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Spülen Sie anschließend die Elektroden, indem Sie die Spitzen für zwei Minuten in Vertiefungen einer 96-Loch-Platte eintauchen, die je 300 µL destilliertes Wasser pro Vertiefung enthalten, bei sanfter Mischung bei Raumtemperatur. Um die Elektroden zu regenerieren, tauchen Sie die Spitzen über Nacht bei vier Grad Celsius oder eine Stunde bei Raumtemperatur in Vertiefungen einer 96-Loch-Platte ein, die je 300 µL Regenerationslösung pro Vertiefung enthalten.Danach erfolgen drei Waschungen der Elektroden, indem die Spitzen in Vertiefungen einer 96-Loch-Platte getaucht werden, die je 300 µL gepufferte Kochsalzlösung (phosphate-buffered saline) enthalten. Jede Waschung erfolgt zwei Minuten lang mit sanftem Mischen bei Raumtemperatur. Beschichten Sie das Hühnereiweiß-Lysozym auf der Polyanilin-Oberfläche der Elektrode, indem Sie einen 15-µL-Tropfen einer 40 µg/mL HEWL-Lösung in Phosphatpuffer auf die Elektrodenoberfläche aufbringen.Die Elektrode eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend führen Sie drei Waschschritte der Elektroden mit Phosphatpuffer durch, indem Sie die Elektrodenabschnitte der Sensorchips in eine Vertiefung einer 96-Loch-Platte eintauchen, die pro Vertiefung 300 µL Phosphatpuffer enthält. Führen Sie jeden Waschschritt zwei Minuten lang bei sanfter Mischung bei Raumtemperatur durch.Sättigen Sie die Elektroden, indem Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen der Blockierungslösung auf die Oberfläche der Elektrode geben. Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend dreimal wie zuvor waschen.Verdünnen Sie die BlaP-cAb-Lys3- oder BlaP-Lösungen auf 20 Mikrogramm pro Milliliter in Bindungspuffer. Geben Sie dann einen 15-Mikroliter-Tropfen dieser verdünnten Lösung auf die Elektroden. Inkubieren Sie die Elektroden eine Stunde bei Raumtemperatur.Nach der Antigen-Nanobody-Reaktion die Elektroden dreimal mit Waschlösung waschen. Anschließend die Elektroden des Sensors in Detektionspuffer waschen, indem die Elektroden in eine Vertiefung einer 96-Loch-Platte getaucht werden, die pro Vertiefung 300 µL Detektionspuffer enthält. Danach kurz für eine Minute inkubieren.Zur Detektion schließen Sie das digitale Multimeter an den Computer an. Anschließend stecken Sie den Sensorchip über den Kupferleiterbereich in das digitale Multimeter. Starten Sie die Sensorantwort, indem Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen einer viermillimolaren Benzylpenicillin-Lösung auf die positiv gekennzeichneten Elektroden auftragen.Geben Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen der Nachweislösung auf die negativ markierten Elektroden, um als negativer Kontrollansatz zu dienen. Überwachen Sie die konduktometrischen Werte mithilfe des angeschlossenen digitalen Multimeters über einen Zeitraum von 30 Minuten. Visualisieren Sie die Daten in Echtzeit direkt auf dem Bildschirm oder exportieren Sie die digitalen Daten als Textdatei.Diese Rohdaten können grafisch dargestellt werden, um eine Abbildung der Messungen der Leitfähigkeitsänderungen zwischen der Referenz- und der Probenelektrode über die Zeit zu erstellen. Zur Konstruktion des chimären Proteins wurde die Klasse-A-Beta-Lactamase BlaP als Trägerprotein verwendet. Hier sind die katalytischen Reste in Rot dargestellt.Die Insertionsstelle, die sich in einer lösungsmittelzugänglichen Schleife befindet, ist gelb markiert. Das auf ein Kamelidenantikörperfragment namens cAb-Lys3 basierende Fragment wurde in BlaP eingefügt. Das resultierende chimäre Protein, BlaP-cAb-Lyse3, kann HEWL binden, während die Beta-Lactamase-Aktivität erhalten bleibt.HEWL wurde auf eine mit Polyanilin codierte Elektrode immobilisiert, bevor BlaP-cAb-Lys3 aufgebracht wurde. Die Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse von Benzylpenicillin durch das immobilisierte chimäre Protein induziert Leitfähigkeitsänderungen, die vom Anwender interpretiert werden können. Die Sensoren enthalten acht Chips, die als vier Paare angeordnet sind.Jeder Chip umfasst drei Elektroden: eine mit Polyanilin beschichtete Arbeitselektrode, eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode. Bei jedem Paar entspricht der mit „negativ“ gekennzeichnete Chip einer negativen Kontrolle, während der mit „positiv“ gekennzeichnete Chip der getesteten Probe entspricht. Dargestellt sind Leitfähigkeitsmessungen, die die spezifische Wechselwirkung von BlaP-cAb-Lys3 mit HEWL zeigen.Die Leitfähigkeitsänderungen resultieren aus der Freisetzung von Protonen, die durch die Hydrolyse von Antibiotika durch die immobilisierte chimäre Beta-Lactamase hervorgerufen wird. Für die negative Kontrolle, die native Beta-Lactamase BlaP, konnte keine Bindung nachgewiesen werden. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in einem halben Tag durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt und die experimentellen Bedingungen optimiert sind.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Insertion eines Antikörperteilstücks in BlaP herausfordernd ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Qualität der gewonnenen Daten von der Funktionalität der chimären Beta-Lactamase abhängt. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden durchgeführt werden, die eine Quantifizierung der nachgewiesenen Wechselwirkung ermöglichen, um die Gleichgewichtsassoziationskonstante dieser Wechselwirkung zu bestimmen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Immunbiosensoren den Weg, molekulare Wechselwirkungen in verschiedenen Proben zu untersuchen, die von lebenden Organismen bis hin zu unterschiedlichen Umgebungen reichen. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf den Nachweis zahlreicher Biomoleküle, da die chimäre Beta-Lactamase-Technologie ein vielseitiges Werkzeug darstellt, um beliebige Antikörper oder Proteinfragmente funktional zu gestalten. Daher könnte sie zur Entwicklung kostengünstiger und schneller diagnostischer Werkzeuge in zahlreichen Bereichen, wie der Human- und Tiergesundheit, eingesetzt werden.

the-use-lactamase-based-conductimetric-biosensor-assay-to-detect

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Dieses Video zeigt einen konduktimetrischen Biosensor-Assay, um die Interaktion eines Antikörpers mit einem Zielantigen zu untersuchen, das auf einem Schallkopfchip immobilisiert ist. Der Biosensor ist so konstruiert, dass er ein bifunktionelles chimäres Protein enthält – ein β-Lactamase-Enzym mit einer funktionellen katalytischen Stelle, die mit einem Nanobody fusioniert ist, um an das immobilisierte Zielantigen zu binden. Bei der Bindung erzeugt die katalytische Hydrolyse eines...

β-Laktamase-basierter konduktimetrischer Biosensor-Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen

Erworbene Resistenz gegen Antibiotika ist ein großes öffentliches Gesundheitsproblem und wird derzeit von der WHO als eine der größten Bedrohungen des menschlichen Lebens rangiert. Hier beschreiben wir die Verwendung von Cantilever-Technologie antibakterielle Widerstand, kritisch für die Entwicklung neuartiger leistungsfähige Mittel gegen Multidrug-resistente Bakterien zu quantifizieren.

Nanomechanics von Drug-Target-Interaktionen und Antibakterielle Widerstand Erkennung

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Wir beschreiben hier Protokolle zur Messung der Antikörper-Antigen-Bindungsaffinität und Kinetik vier häufig verwendete Biosensor-Plattformen.

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Eine mikrofluidischen Biosensor-Plattform wurde entworfen und hergestellt mit kostengünstigen trocken Photoresist Filmtechnik für die rasche und sensible Quantifizierung der verschiedenen Analyten. Diese Einweg-System ermöglicht das elektrochemische Auslesen der Enzym-linked-Assays auf den Chip immobilisiert mittels der Stop-Flow-Technik.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von niedrigen reichlich Moleküle in komplexe Lösungen mit molekularen Prägung in Kombination mit einer Kapazität Biosensor.

Gromer Nachweis von Biomarkern mithilfe einer molekularen Prägung basierte kapazitive Biosensor

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Diese Studie zielte darauf ab, eine Strategie zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Peptid zu präsentieren. Die Strategie umfasst die Biopanierung von medikamentenerkennenden kurzinomischen Kurzpeptiden auf der Grundlage eines Mikrobilanzsensors (QCM) in Quarzkristall, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur quantitativen Bewertung der für die Arzneimittelerkennung und Anmerkung der Arzneimittelbindungsstellen auf Proteinen erhaltenen Informationen.

Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Hochdurchsatz-Screening-Workflow für industrielle Mikroorganismen. Dabei wird eine mutierte Bibliothek mittels ARTP-Mutagenese erstellt, ein positives Tröpfchenscreening mit automatisierter Mikrofluidik durchgeführt und anschließend die Ergebnisse überprüft. Die Zuverlässigkeit des Workflows wurde durch das Screening von Hochleistungs-B . coagulans-Stämmen bestätigt.

Hochdurchsatz-Screening von L-Milchsäure-hyperproduzierenden Bacillus-Coagulans-Mutanten mittels einer automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform

Lernen Sie einen leitfähigen Biosensor-Assay mit hybridem β-Lactamase zur Detektion von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht schnelle biomolekulare Analysen.

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

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