Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Das übergeordnete Ziel dieses konduktimetrischen Biosensor-Assays ist es, biomolekulare Wechselwirkungen unter Verwendung der hybriden Beta-Lactamase-Technologie zu detektieren. Wir beschreiben eine Methode zum Nachweis von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen unter Verwendung eines chimären Beta-Lactamase-Proteins. Das Prinzip dieser Methode beruht auf dem Nachweis der Bindung durch Messung der Protonenfreisetzung der Beta-Lactamase-Aktivität.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Immunsensoren ist die Verwendung einer chimären Beta-Lactamase, die billigere und schnellere sensorische Assays ermöglicht, indem ein Hybridprotein zum Nachweis der Analyten verwendet wird. Mathieu Dondelinger, ein Doktorand, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Proteinprobe und der Lösung, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie die wiederverwendbare Elektrode vor, indem Sie die Spitzen zwei Minuten lang in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 Mikrolitern Elektrodenvorbereitungslösung tauchen und vorsichtig bei Raumtemperatur mischen.

Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Spülen Sie dann die Elektroden, indem Sie die Spitzen zwei Minuten lang in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 Mikrolitern destilliertem Wasser tauchen, wobei Sie sie vorsichtig bei Raumtemperatur mischen. Um die Elektroden zu regenerieren, tauchen Sie die Spitzen über Nacht bei vier Grad Celsius oder eine Stunde bei Raumtemperatur in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 Mikrolitern Regenerationslösung pro Vertiefung.

Führen Sie dann drei Waschgänge der Elektroden durch, indem Sie die Spitzen in Vertiefungen mit einer 96-Well-Platte tauchen, die 300 Mikroliter pro Vertiefung phosphatgepufferte Kochsalzlösung enthält. Führen Sie jede Wäsche zwei Minuten lang unter sanftem Mischen bei Raumtemperatur durch. Hühnchen-Eiweiß-Lysozym wird auf die Polyanilinoberfläche der Elektrode aufgetragen, indem ein 15-Mikroliter-Tropfen von 40 Mikrogramm pro Milliliter HEWL, das in Phosphatpuffer hergestellt wurde, auf die Elektrodenoberfläche aufgebracht wird.

Inkubieren Sie die Elektrode eine Stunde bei Raumtemperatur. Führen Sie als Nächstes drei Waschgänge der Elektroden mit Phosphatpuffer durch, indem Sie die Elektrodenteile der Sensorchips in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte tauchen, die 300 Mikroliter Phosphatpuffer pro Vertiefung enthält. Führen Sie jede Wäsche zwei Minuten lang unter sanftem Mischen bei Raumtemperatur durch.

Tränken Sie die Elektroden, indem Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen der Blockierungslösung auf die Oberfläche der Elektrode geben. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dann wie zuvor dreimal waschen.

Verdünnen Sie die BlaP-cAb-Lys3- oder BlaP-Lösungen auf 20 Mikrogramm pro Milliliter in Bindungspuffer. Tragen Sie dann einen 15-Mikroliter-Tropfen dieser verdünnten Lösung auf die Elektroden auf. Inkubieren Sie die Elektroden eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nach der Antigen-Nanobody-Reaktion waschen Sie die Elektroden dreimal mit Waschlösung. Waschen Sie dann die Elektroden des Sensors in einem Detektionspuffer, indem Sie die Elektroden in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte tauchen, die 300 Mikroliter pro Vertiefung Detektionspuffer enthält. Und eine Minute lang kurz inkubieren.

Schließen Sie zur Erkennung das Digitalmultimeter an den Computer an. Stecken Sie dann den Sensorchip über den Kupferschaltungsteil in das Digitalmultimeter. Initiieren Sie die Sensorreaktion, indem Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen mit vier Millimolaren Benzylpenicillinlösung auf die positiv markierten Elektroden auftragen.

Tragen Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen der Detektionslösung auf die negativ markierten Elektroden auf, die als Negativkontrolle dienen. Überwachen Sie die konduktometrischen Werte mit dem angeschlossenen Digitalmultimeter 30 Minuten lang. Visualisieren Sie die Daten in Echtzeit direkt auf dem Bildschirm oder exportieren Sie die digitalen Daten als Textdatei.

Diese Rohdaten können grafisch dargestellt werden, um eine grafische Ausgabe zu erstellen, die die Messungen der Leitfähigkeitsänderungen zwischen der Referenz- und der Probenelektrode im Laufe der Zeit darstellt. Um das chimäre Protein zu konstruieren, wurde die Beta-Lactamase BlaP der Klasse A als Trägerprotein verwendet. Hier sind die katalytischen Rückstände rot dargestellt.

Die Einstichstelle, die sich in einer lösungsmittelfreigelegten Schleife befindet, ist gelb markiert. Das Kameliden-Antikörperfragment mit der Bezeichnung cAb-Lys3 wurde in BlaP eingefügt. Das resultierende chimäre Protein, BlaP-cAb-Lyse3, ist in der Lage, HEWL zu binden, während die Beta-Lactamase-Aktivität erhalten bleibt.

HEWL wurde vor dem Laden von BlaP-cAb-Lys3 auf eine Polyanilin-kodierte Elektrode immobilisiert. Die Freisetzung von Protonen bei der Benzylpenicillin-Hydrolyse durch das immobilisierte chimäre Protein induziert Leitfähigkeitsänderungen, die vom Anwender interpretiert werden können. Die Sensoren bestehen aus acht Chips, die in vier Paaren organisiert sind.

Jeder Chip besteht aus drei Elektroden, einer polyanilinbeschichteten Arbeitselektrode, einer Referenzelektrode und einer Gegenelektrode. Für jedes Paar entspricht der als negativ gekennzeichnete Chip einer negativen Kontrolle, während der positiv gekennzeichnete Chip der getesteten Probe entspricht. Hier sind Leitwertmessungen dargestellt, die die spezifische Wechselwirkung von BlaP-cAb-Lys3 zu HEWL zeigen.

Die Leitfähigkeitsänderungen resultieren aus der Protonenfreisetzung, die durch die Antibiotikahydrolyse durch die immobilisierte chimäre Beta-Lactamase induziert wird. Für die Negativkontrolle, die native Beta-Lactamase-BlaP, konnte keine Bindung nachgewiesen werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 1/2 pro Tag durchgeführt werden, wenn sie richtig funktioniert und die Versuchsbedingungen optimiert sind.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Einfügen eines Antikörperfragments in BlaP eine Herausforderung darstellt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist zu bedenken, dass die Qualität der generierten Daten von der Funktionalität der chimären Beta-Lactamase abhängt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden durchgeführt werden, die die Quantifizierung der detektierten Wechselwirkung ermöglichen, um die Gleichgewichtsassoziationskonstante dieser Wechselwirkung zu bestimmen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Immunbiosensors, um molekulare Wechselwirkungen in verschiedenen Proben zu untersuchen, die von lebenden Organismen bis hin zu verschiedenen Umgebungen reichen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf den Nachweis zahlreicher Biomoleküle, da die chimäre Beta-Lactamase-Technologie ein vielseitiges Werkzeug ist, um jeden Antikörper oder ein Proteinfragment im Netz zu funktionalisieren. Daher könnte es zur Entwicklung kostengünstiger und schneller Diagnoseinstrumente in zahlreichen Bereichen wie der Gesundheit von Mensch und Tier eingesetzt werden.