Name: Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Synthese von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten zur Untersuchung ihrer antibakteriellen Eigenschaften. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle über Größe und Zusammensetzung.

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (NSF Awards CMMI-0922946 an DB, CMMI-1300920 an DB und S.O&#39;M. Und CMMI-1531789 an S.O&#39;M., DB und EAK) und a Busch Biomedical Research Grant an EAK und S.O&#39;M.

1. Fokussierung der Nanosekunden-Laser- und Messflüssigkeit <ol><li> Montieren Sie die Ablationsvorrichtung, indem Sie einen Magnetrührstab und eine poröse Ablationsstufe in ein 50 ml Glasbecher legen. HINWEIS: Die Ablationsstufe besteht aus einer 3.81 cm großen, 1,6 mm dicken Edelstahlplattform mit zehn Löchern mit 0,6 cm Durchmesser und sechs Bohrungen mit einem Durchmesser von 0,50 cm Durchmesser, die in dem in Abbildung 1 dargestellten Muster gebohrt wurden. Der Zweck dieser Löcher besteht darin, dass sich die Flüssigkeit über das Target bewegen kann, so dass sich Partikel nicht unmittelbar über dem Target ansammeln. Unzureichendes Mischen führt zu schädlichen Wechselwirkungen zwischen dem Laser und den bereits gebildeten Partikeln. Zusätzlich befinden sich drei # 29 (8-32) Gewindebohrungen in der Nähe des Umfangs der Plattform, um Stellschrauben zu akzeptieren, die als Beine dienen, um die Plattform zu heben und Platz für einen Magnetrührstab zu schaffen (Abbildung 1A ). <ol><li> Legen Sie den Becher auf eine magnetischeRühren Sie die Platte und stellen Sie die Rührplatte auf eine xy-Translationsstufe, um die Bewegung des Targets während der Ablation zu ermöglichen (Abbildung 1A ). </li></ol></li><li> Stellen Sie den Nd: YAG-Laser ein, um bei der Grundwellenlänge von 1.064 nm mit einer Pulsdauer von 5 ns und einer Pulswiederholrate von 10 Hz zu arbeiten. Messen Sie die Energie pro Puls mit einer Laserleistung und einem Energiezähler. Die benötigte Energie beträgt 240-250 mJ. </li><li> Fokussieren Sie den Strahl unter dem Target auf die Ablationsstufe unter Verwendung einer 250 mm Brennweite konvergierenden Linse (NA = 0,05). HINWEIS: Der eingehende Strahl hat einen Radius von 4,025 mm und eine Linsenhöhe von 161 mm ist erforderlich, um die gewünschte Punktgröße zu erreichen. Die optimale Spotgröße wird empirisch bestimmt. Eine größere Fleckgröße wird verwendet, um die Wirkung der Abschirmung durch in der Lösung vorhandene NPs zu verringern. Dies ist mit der Tatsache ausgeglichen, dass eine zunehmende Fleckgröße eine höhere Energie benötigt, um eine ausreichende Fluenz zu erhalten. </li><li> Bestimmen Sie die Spotgröße, indem Sie ein Metalltarget platzieren (siehe SektioN 2) auf der Bühne und Abtragen mit mehreren Laserpulsen. Betrachten Sie das ablatierte Ziel zusammen mit einer Mikrometer-Folie auf einem CCD-Kamera-ausgerüsteten Lichtmikroskop (4X-Objektiv), um die Punktgröße zu messen (Abbildung 1A ). HINWEIS: Für die Apparatur ergibt das Ablationssystem eine Spotgröße mit einer mittleren Fläche von 5,51 mm 2 . Die Punktgröße bleibt in diesem Bereich für jede Ablation. </li><li> Berechnen Sie die Fluenz durch Dividieren der Pulsenergie durch den Spotbereich. Für den Apparat hier ist die Fluenz 4,80 J / cm 2 . </li></ol> 2. Synthese von Silbernanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeit <ol><li> Wiegen Sie ein flaches silbernes Target mit einer Mikrowaage, um die Vorablationsmasse zu erhalten. </li><li> Haften Sie das silberne Target auf die poröse Bühne mit doppelseitigem Kohlenstoffband. Füge 40 ml Ablationsflüssigkeit dem Becher hinzu ( Abbildung 1A ). Die Flüssigkeitshöhe über dem Target beträgt 11 mm. HINWEIS: Typische Ablation liqUids sind wässrige Lösungen, die entweder 60 mM SDS oder 2 mM PVP enthalten, um die Monodispersität zu erhöhen. </li><li> Unter ständigem Rühren die computergesteuerte motorisierte xy-Stufe in einem elliptischen Muster (Abmessungen: Hauptachse = 2,09 cm, Nebenachse = 0,956 cm, Fläche = 1,57 cm 2 ) mit einer Geschwindigkeit von 0,42 cm / s bewegen und das Ziel ablösen Für 20-40 min. HINWEIS: Die Konzentration der NPs nimmt mit längeren Ablationszeiten zu. Sicherstellen, dass das Rühren ausreichend kräftig ist, um die NP-Konzentration während der gesamten Lösung gleichmäßig zu halten, um die Abschirmungseffekte zu minimieren 7 . </li></ol> 3. Charakterisierung von Metallnanopartikeln <ol><li> Sammle die Nanopartikellösung aus dem Becher, indem ich dekantiere. Bestätigen Sie die Anwesenheit von Nanopartikeln, indem Sie ihre UV-sichtbaren Lichtspektren (200-1.100 nm) messen. HINWEIS: Die NPs haben eine Peak-Absorption an der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) -Wellenlänge. Für Silber ist die SPR bei 400 nm zentriert. Hochkonzentriertes NPLösungen erfordern eine Verdünnung vor der Messung des UV-VIS-Spektrums, um sicherzustellen, dass die Absorptionswerte im linearen Bereich des Spektrophotometers liegen. </li><li> Messen Sie den hydrodynamischen Durchmesser der NPs durch dynamische Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung eines Zahlenverteilungsanalyseverfahrens 29 . <ol><li> Die NP-Lösung 1:40 in der Ablationslösung verdünnen und 1 ml in eine 1 cm Plastikküvette pipettieren. Unter Verwendung eines Messwinkels von 180 ° messen Sie die Lichtstreuung bei einer Wellenlänge von 633 nm, um den NP-Durchmesser gemäß der Stokes-Einstein-Gleichung zu bestimmen: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55416/55416eq1.jpg" /> Wobei d der hydrodynamische Radius ist, k die Boltzmannsche Konstante ist, T die absolute Temperatur, η die Viskosität und der d-Translationsdiffusionskoeffizient oder die Geschwindigkeit der Brownschen Bewegung ist. </li></ol></li><li> Bestätigen Sie NP Größe und Form mit ÜbertragungselektronenmikroScopy (TEM) 30 HINWEIS: Der hydrodynamische Durchmesser, der mit DLS gemessen wird, ist größer als die Größe, die unter Verwendung von TEM aufgrund der Lösungsmittelschicht, die die NPs umgibt, gemessen wird. <ol><li> Die NP-Lösung 1:40 in doppelt destilliertem Wasser verdünnen, um überschüssige Additive ( zB SDS oder PVP) zu entfernen, die die Bildgebung beeinträchtigen können. 2 &amp; mgr; l der Lösung auf ein Kupfer-TEM-Gitter auftragen, das mit lacey / dünnem Kohlenstofffilm vorbeschichtet ist (im Handel erhältlich, siehe Materialliste) und über Nacht bei Raumtemperatur unter Vakuum im Exsikkator trocknen. </li><li> Bild die NPs, um Größe und Form zu beurteilen, wie in Referenz 30 beschrieben. </li></ol></li><li> Um die NP-Konzentration zu berechnen, werden alle lose gebundenen NPs aus dem ablatierten Metalltarget entfernt (Schritt 2.3), indem das Target in ein kochendes Wasserbad gegeben wird, das destilliertes Wasser für 1 min enthält. <ol><li> Trocknen Sie das Target unter einem Druckluftstrom für 1 min. Messen Sie die Masse der TaRget auf einer Mikrowaage. Quantifizieren Sie die Masse der NPs in Lösung als die Gewichtsdifferenz vor und nach der Ablation, die als das Ergebnis des Ausstoßes von Metallnanopartikeln in die Lösung angenommen wird. </li></ol></li></ol> 4. Nachbestrahlung <ol><li> Verdünnen Sie die NPs auf eine maximale Konzentration von 100 μg / ml in der gleichen Ablationslösung, die in 2.2 verwendet wird. Diese Konzentrationsgrenze ist entscheidend für eine gleichmäßige Bestrahlung. </li><li> Übertragen Sie 15-17 ml der verdünnten NPs in eine Quarzküvette, die einen Rührstab enthält (Abbildung 1B ). Legen Sie die Küvette auf eine magnetische Rührplatte, die parallel zum eingehenden Laser ausgerichtet ist. </li><li> Verwenden Sie ein Nd: YAG-Lasersystem, um 25 ps 532 nm Laserpulse und eine 75-mm-Brennweite zu erzeugen, um den Laser auf die Mitte der Lösung zu fokussieren. Bestrahlen Sie die Lösung für 30 Minuten bis zu mehreren Stunden, je nach gewünschter Größe. HINWEIS: Die Gesamtenergie ist abhängig von der Konzentration der Lösung und tIme der Bestrahlung und kann von 0,5 mJ bis 3,5 mJ reichen. Für die Apparatur liefert hier 30 min nach der Bestrahlung einer transparenten, niederkonzentrierten Probe (&lt;50 μg / mL) Silber-NPs mit einem Durchmesser von 10 nm. </li></ol> 5. Messung der antibakteriellen Eigenschaften der Nanopartikel HINWEIS: Die Toxizität von Silber-NPs gegen Gram-positiv ( Bacillus subtilis ) und Gram-negativ ( Escherichia coli ) wurde getestet 31 . Die Methode ist leicht an jede Art angepasst; Jedoch kann die wirksame Dosis von Nanopartikeln erheblich variieren und muss empirisch bestimmt werden. Hier wird E. coli als Modellsystem für die Beschreibung des Verfahrens verwendet. <ol><li> Wachsen Sie E. coli- Kulturen (Stamm MG1655) über Nacht bei 37 ° C in Luria Brühe (LB) mit 10 g / l Bacto-Trypton, 5 g / l Hefeextrakt und 10 g / l Natriumchlorid. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen auf eine optische Dichte (λ = 600Nm) von 0,01 in frischem LB. </li><li> Wenn die NPs in Ablationsmedien, die Additive enthalten ( zB SDS oder PVP), synthetisiert wurden, fügen Sie die jeweilige Chemikalie dem LB hinzu, so dass die Konzentration bei der Zugabe der NPs konstant bleibt. HINWEIS: Zum Beispiel wird in einem typischen Experiment ein Silber-Target in eine 60 mM SDS-Lösung abgeleitet, um eine 100 &amp; mgr; g / ml Lösung von NPs zu ergeben. Wenn die Endkonzentration an NPs im Kulturmedium 10 μg / ml beträgt, wird LB mit 6 mM SDS ( dh 1/10 der SDS-Konzentration in der Ablationsflüssigkeit) hergestellt. Es gibt keine negativen Auswirkungen auf das Wachstum der Bakterien bei der Verwendung dieser Konzentrationen. Dies ist in der -AgNP-Steuerung in Abbildung 3 dargestellt. </li><li> Fügen Sie die NPs zu den verdünnten Kulturen in Konzentrationen von 0-50 μg / ml hinzu und wachsen Sie die Kulturen unter Schütteln bei 37 ° C für weitere 2 h. Als Positivkontrolle für Toxizität behandeln E. coli mit einem Antibiotikum ( zB 30 μg / ml KanamYcin). </li><li> Nach der 2-stündigen Inkubation verdünnen die Kulturproben 1:10 in frische LB und verdünnen 10 μl Tropfen jeder Verdünnung auf LB-Agarplatten. Typischerweise reichen 10 4 -10 8- fache Verdünnungen aus, um einzelne Kolonien zu sehen. </li><li> Sobald die Tröpfchen absorbiert worden sind, inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 ° C und zählen Kolonie bildende Einheiten (cfu) am nächsten Morgen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Reproduzierbare antimikrobielle Effekte von NPs erfordern eine konsistente Produktion von NPs mit ähnlichen Größen und Konzentrationen. Daher ist es entscheidend, Laserparameter wie Fluenz, Wellenlänge und Pulsdauer zu standardisieren. Während die dynamische Lichtstreuung eine einfache und schnelle Methode zur Schätzung der NP-Größe ist, erfordert eine genaue Quantifizierung der Größenverteilung eine direkte Messung durch TEM. Da jeder Laserstrahl hinsichtlich des Modusprofils und der Divergenz unterschiedliche Eigensch...

Nanopartikel (NPs) sind allgemein als Partikel definiert, die mindestens eine Dimension haben, die weniger als 100 nm lang ist. Herkömmliche chemische NP-Syntheseverfahren erfordern typischerweise gefährliche Reduktionsmittel wie Borhydride und Hydrazine. Im Gegensatz dazu liefert die Laserablation von festen Metalltargets, die in ein flüssiges Medium eingetaucht sind (gepulste Laserablation in Flüssigkeiten - PLAL), einen umweltfreundlichen Weg für die NP-Synthese, der alle 12 der Grundlagen der Grünen Chemie 1 , 2 erfüllt. In PLAL wird ein untergetauchtes Metalltarget durch wiederholte Laserpulse bestrahlt. Wenn der Laser das Target abnimmt, wird eine dichte Feder von Atomclustern und Dampf in das flüssige Medium freigesetzt, wobei NPs schnell zusammenwachsen. NPs, die von PLAL hergestellt werden, werden in einem wässrigen Medium fein dispergiert, und die Grße, die Polydispersität und die Zusammensetzung der NPs können leicht durch Variieren der wßrigen Ablationsflüssigkeit sowie des Laserparameters gesteuert werdenAmeter 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Die Nanopartikelcharakteristiken können durch Einstellen einer Anzahl von Laserparametern abgestimmt werden, einschließlich: Fluenz, Wellenlänge und Pulsdauer (siehe Referenz 7 ). Die Laserfluenz wird als die Puls-Energie berechnet, die durch die Fläche des Laserspots auf der Zieloberfläche geteilt wird. Die präzisen Effekte von Fluenz auf die Größe und Polydispersität von NPs sind etwas umstritten. Im Allgemeinen hat sich gezeigt, dass bei &quot;langen&quot; und &quot;ultrakurzen&quot; gepulsten Lasersystemen niedrige und hohe Fluenzregelungen auftreten, die negative und positive Trends in der Größe bzw. 8 , 9 , 10 , 11 erzeugen. NP-GrößenverteilungOns können mit Hilfe von Techniken wie dynamischer Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) empirisch gemessen werden, wie nachfolgend beschrieben wird. Die Wahl der Laserwellenlänge kann die physikalischen Mechanismen beeinflussen, durch die die NPs gebildet werden. Bei kürzeren (ultravioletten) Wellenlängen sind hochenergetische Photonen in der Lage, interatomare Bindungen zu brechen 12 . Dieser Mechanismus der Photoablation ist ein Beispiel für eine Top-down-NP-Synthese, da es zur Freisetzung von ultra-kleinen Materialfragmenten führt, die bei der Abschreckung in der Eintauchflüssigkeit 12 , 13 , 14 dazu neigen, größere polydisperse Proben zu erzeugen. Im Gegensatz dazu ergibt die Nah-Infrarot-Ablation (λ = 1.064 nm) einen Bottom-up-Synthesemechanismus, der durch die Plasmaablation 12 dominiert wird. Die Laserabsorption durch das Ziel befreit Elektronen, die mit und anschließend freien, gebundenen Elektronen kollidieren. Als cOllionen steigen, das Material ionisiert wird, wodurch ein Plasma entzündet wird. Die umgebende Flüssigkeit begrenzt das Plasma, erhöht die Stabilität und erhöht die Absorption 12 weiter . Wenn das expandierende Plasma durch die Begrenzungsflüssigkeit abgeschreckt wird, werden NPs mit verschiedenen Geometrien 4 , 12 , 15 kondensiert. Die Wahl der Laserpulsdauer kann den NP-Bildungsprozess weiter beeinflussen. Häufig verwendete Langpulslaser mit Pulsdauern, die größer als einige Pikosekunden sind, umfassen alle Milli, Mikro-, Nano- und einige Pikosekunden-Pulslaser. Bei diesem Pulsbreitenregime ist die Laserpulsdauer länger als die Elektronenphonon-Äquilibrierungszeit, die typischerweise in der Größenordnung von einigen Pikosekunden 4 , 16 , 17 , 18 , 19 liegt. Dies führt zu einer Leckage von Energie in das umgebende Ablationsmedium und die Bildung von NPs durch thermische Mechanismen wie thermionische Emission, Verdampfung, Kochen und Schmelzen 1 , 20 . Die antibakterielle Aktivität von NPs wird stark durch die Partikelgröße 21 , 22 , 23 , 24 beeinflusst. Um die Größenverringerung und die Monodispersität zu verbessern, können die NPs ein zweites Mal mit einem Laser einer Wellenlänge nahe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) des NP bestrahlt werden. Die einfallende Laserstrahlung wird durch die NP durch Anregung des SPR absorbiert. Die Fragmentierung des NP kann entweder durch thermische Verdampfung 25 , 26 oder Coulomb Explosion 27 , 28 erfolgen . Die Fotoanregung hebt t anDie Temperatur des NP über dem Schmelzpunkt, was zu dem Ausscheiden der äußeren Schicht des Teilchens führt. Es wurde gezeigt, dass die Zugabe von Mitteln wie Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Natriumdodecylsulfat (SDS) zu der Lösung die Nachbestrahlungseffekte 5 stark verbessern kann. Die Auswirkungen der Addition von verschiedenen gelösten Stoffen wurden in mehreren Berichten 1 , 4 , 6 beschrieben. Die Leichtigkeit der Manipulation von NP-Eigenschaften durch PLAL bietet eine neuartige Methode, um neue NP-basierte Antibiotika zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>Nanosekunden-Nd:YAG-Laser</td><td>Ekspla</td><td>NL303</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter XY-Scanning-Tisch</td><td>Standa</td><td>8MTF</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS-Spektralphotometer</td><td>Agilent</td><td>Cary 60</td><td></td></tr><tr><td>Dynamische Lichtstreueinheit</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer ZS 90</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowaage</td><td>Maktek</td><td>TM 400</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>EM 902</td><td></td></tr><tr><td>Silberfolien-Target</td><td>Alfa Aesar</td><td>12127</td><td></td></tr><tr><td>250 mm Brennweitenobjektiv</td><td>Edmund Optics</td><td>69-624</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer TEM Gitter</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-400LD</td><td>Lacey/dünnschichtbeschichtetes Gitter</td></tr><tr><td>E. coli MG1655</td><td>ATCC</td><td>47076</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Trypton</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlscheibe (für Ablationstisch)</td><td>Metal Remnants, Inc.</td><td>N/A</td><td>1,5 Zoll Durchmesser, 16 Gauge</td></tr><tr><td>Becher</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540G</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührstab</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-57</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49SH</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Energie- und Leistungsmesser</td><td>Coherent</td><td>1098579</td><td></td></tr><tr><td>Kohlenstoffband</td><td>Shinto Chemitron Co., Ltd.</td><td>STR Tape</td><td></td></tr><tr><td>Beschallungswasserbad</td><td>Branson</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Luftkompressor</td><td>GMC</td><td>Syclone 3010</td><td>Zum Trocknen des Ablationsziels</td></tr><tr><td>75 mm Brennweitenobjektiv</td><td>Edmund Optics</td><td>34-096</td><td>Fokussierlinse für die Nachbestrahlung</td></tr><tr><td>Quarzküvette</td><td>Precision Cells Inc</td><td>21UV40</td><td>50 mm Strahlengang (für Nachbestrahlung)</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Nikon</td><td>50i</td><td>Dieses Mikroskop wird verwendet, um den Laser auf den Ablationstisch zu fokussieren. Dieses spezielle Modell ist nicht mehr erhältlich, aber jedes Lichtmikroskop mit einem 4X-Objektiv funktioniert.</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>AmScope</td><td>MT5000-CCD</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometer Schlitten</td><td>Ted Pella</td><td>2280-70</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von metallnanopartikeln durch gepulste laserablation in flüssigkeiten: ein werkzeug zum studium der antibakteriellen eigenschaften von nanopartikeln

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Die Entstehung von multidrugresistenten Bakterien ist eine globale klinische Sorge, die einige dazu veranlasst, über unsere Rückkehr zu einer &quot;Antibiotika-Ära&quot; der Medizin zu spekulieren. Zusätzlich zu den Bemühungen, neuartige antimikrobielle Mittelmoleküle zu identifizieren, hat es großes Interesse an der Verwendung von Metallnanopartikeln als Beschichtungen für medizinische Geräte, Wundverbände und Verbraucherverpackungen aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften gegeben. Die vielfältigen Methoden der Nanopartikel-Synthese ergeben ein breites Spektrum an chemischen und physikalischen Eigenschaften, die die antibakterielle Wirksamkeit beeinträchtigen können. Dieses Manuskript beschreibt die gepulste Laser-Ablation in Flüssigkeiten (PLAL) -Methode, um Nanopartikel zu erzeugen. Dieser Ansatz ermöglicht die Feinabstimmung von Nanopartikelgröße, Zusammensetzung und Stabilität unter Verwendung von Nachbestrahlungsmethoden sowie die Zugabe von Tensiden oder Volumenausschlüssen. Durch die Kontrolle der Partikelgröße und Zusammensetzung, eine große Palette von physikalischen und chemischen Eigenschaften von Metall NanopaRtikel können erforscht werden, die zu ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit beitragen können, wodurch neue Wege für die antibakterielle Entwicklung entstehen.

Unter Verwendung von Silber-Targets werden die oben beschriebenen Laserparameter und 60 mM SDS in der Ablationsflüssigkeit Silber-NPs mit der charakteristischen UV-VIS-Extinktion am SPR erzeugt ( 2A ). TEM- und DLS-Messungen zeigen einen mittleren NP-Durchmesser von ca. 25 nm vor der Nachbestrahlung (Abbildung 2B ). Die Ablation des Silber-Targets für 30 min ergibt typischerweise eine NP-Konzentration von 200 &amp; mgr; g / ml. ...

Die antimikrobiellen Eigenschaften von Metallen wie Kupfer und Silber wurden seit Jahrhunderten erkannt. Dieses Protokoll beschreibt die gepulste Laserablation in Flüssigkeiten, ein Verfahren zur Synthese von Metallnanopartikeln, das die Fähigkeit zur Feinabstimmung der Eigenschaften dieser Nanopartikel zur Optimierung ihrer antimikrobiellen Effekte bietet.

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Nanopartikel-Kolloide mit kontrollierter Größe und Zusammensetzung herzustellen, um deren antibakterielle Eigenschaften zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Entwicklung antimikrobieller Nanopartikel zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss bestimmte Eigenschaften der Nanopartikel – wie Größe, Form und Zusammensetzung – auf die Toxizität haben. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der einfachen Herstellung von Nanopartikeln aus verschiedenen Materialsystemen, und zwar ohne die Bildung potenziell gefährlicher chemischer Nebenprodukte.Den Versuch demonstrieren Matthew Ratti, ein Studierender, und Julianne Griepenburg, eine Dozentin an der Rutgers Camden. Bauen Sie die Ablationsapparatur auf, indem Sie einen magnetischen Rührstab und eine poröse Ablationsstufe in einen 50-Milliliter-Glasbecher geben. Stellen Sie den Becher auf einen magnetischen Rührer und setzen Sie diesen auf ein XY-Translationsstadium, um eine Bewegung des Targets während der Ablation zu ermöglichen.Stellen Sie den Nd:YAG-Laser so ein, dass er bei der Grundwellenlänge von 1.064 Nanometern mit einer Impulsdauer von fünf Nanosekunden und einer Impulswiederholrate von 10 Hertz arbeitet. Messen Sie die Energie pro Impuls mit einem Laserleistungs- und Energiemessgerät. Fokussieren Sie den Strahl mithilfe einer Sammellinse mit einer Brennweite von 250 Millimetern unterhalb des Targets auf der Ablationsstufe.Wiegen Sie für die Synthese von Silber-Nanopartikeln zunächst ein flaches Silberziel mithilfe einer Mikrowaage, um die Masse vor der Ablation zu bestimmen. Befestigen Sie anschließend das Silberziel mit doppelseitigem Kohlenstoffklebeband auf der porösen Halterung. Geben Sie 40 Milliliter Ablationsflüssigkeit in den Becher.Die Flüssigkeitshöhe über dem Target beträgt 11 Millimeter. Bestimmen Sie die Fleckgröße, indem Sie das Silbertarget mit mehreren Laserimpulsen abtragen. Um die Fleckgröße zu messen, betrachten Sie das abgetragene Target zusammen mit einer Mikrometerskala unter einem Lichtmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.Um die Silbernanopartikel zu synthetisieren, bewegen Sie den computerkontrollierten, motorisierten XY-Tisch unter ständigem Rühren in einer elliptischen Bahn mit einer Geschwindigkeit von 0,42 Zentimetern pro Sekunde und ablatieren das Target für 20 bis 40 Minuten. Sammeln Sie die Nanopartikellösung aus dem Becherglas durch Dekantieren. Bestätigen Sie das Vorhandensein der Nanopartikel durch Messung ihrer UV-sichtbaren Lichtspektren.Messen Sie den hydrodynamischen Durchmesser der Nanopartikel mittels dynamischer Lichtstreuung, indem Sie die Nanopartikellösung 1 zu 40 in der Ablationslösung verdünnen. Es wird ein Gesamtvolumen von einem Milliliter der verdünnten Lösung benötigt, wenn eine Kunststoffküvette mit einem Weglänge von einem Zentimeter verwendet wird. Unter Verwendung eines Messwinkels von 180 Grad wird die Lichtstreuung bei einer Wellenlänge von 633 Nanometern gemessen, um den Nanopartikeldurchmesser gemäß der Stokes-Einstein-Gleichung zu bestimmen.Überprüfen Sie die Größe und Form der Nanopartikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie, indem Sie die Nanopartikellösung zunächst 1:40 in doppelt destilliertem Wasser verdünnen, um überschüssige Zusatzstoffe zu entfernen, die die Bildgebung stören könnten. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter der Lösung auf ein Kupfer-TEM-Gitter, das zuvor mit einem dünnen Lacey-Kohlefilm beschichtet wurde. Trocknen Sie das Gitter über Nacht bei Raumtemperatur unter Vakuum in einem Exsikkator, bevor Sie die Nanopartikel gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll abbilden.Um die Nanopartikelkonzentration zu berechnen, lösen Sie lose angeheftete Nanopartikel vom ablatierten Metalltarget, indem Sie das Target eine Minute lang in ein ultraschallgereinigtes Wasserbad mit destilliertem Wasser geben. Trocknen Sie das Target anschließend eine Minute lang unter einem Strom von Druckluft. Messen Sie danach die Masse des Targets mit einer Mikrowaage.Verdünnen Sie die Nanopartikel in derselben Ablöselösung auf eine maximale Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie 15 bis 17 Milliliter der verdünnten Nanopartikel in eine Quarzküvette, die einen Rührstab enthält. Verwenden Sie ein Nd-YAG-Lasersystem, um 25 Pikosekunden lange Laserpulse mit einer Wellenlänge von 532 Nanometern zu erzeugen.Verwenden Sie außerdem ein Objektiv mit einer Brennweite von 75 Millimetern, um den Laser auf die Mitte der Lösung zu fokussieren. Bestrahlen Sie die Lösung zwischen 30 Minuten und mehreren Stunden, abhängig von der gewünschten Größe. Um die antibakteriellen Eigenschaften der Nanopartikel zu messen, kultivieren Sie zunächst E.coli-Kulturen über Nacht und verdünnen Sie diese anschließend auf eine optische Dichte von 0,01 in frischem LB. Falls die Nanopartikel in Ablationsmedien mit Zusatzstoffen synthetisiert wurden, geben Sie die jeweilige Chemikalie zum LB hinzu, sodass die Konzentration konstant bleibt, wenn die Nanopartikel zugegeben werden.Fügen Sie anschließend die Nanopartikel den verdünnten Kulturen in Konzentrationen von null bis 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Kultivieren Sie die Ansätze unter Schütteln bei 37 Grad Celsius für zusätzliche zwei Stunden. Nach der zweistündigen Inkubation verdünnen Sie die Kulturproben seriell im Verhältnis eins zu zehn in frischem LB. Geben Sie jeweils 10-Mikroliter-Tropfen jeder Verdünnung auf LB-Agarplatten. Sobald die Tropfen absorbiert wurden, inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen zählen Sie die koloniebildenden Einheiten. Hier werden Nanopartikel, die durch Puls-Laserablation in Flüssigkeiten erzeugt wurden, anhand ihrer Absorptionsspektren charakterisiert.Das ultraviolette sichtbare Lichtspektrum von Silber-Nanopartikeln zeigt ein charakteristisches Maximum bei der Wellenlänge der Oberflächenplasmonenresonanz von 400 Nanometern. Zur weiteren Charakterisierung der Nanopartikel wird ihre Größenverteilung mittels Transmissionselektronenmikroskopie gemessen. Die Behandlung von Bakterien wie E. coli mit Nanopartikeln verringert die Lebensfähigkeit, wie durch die Bestimmung von koloniebildenden Einheiten ermittelt wurde.Die Zellen wurden als positiver Kontrollversuch mit Kanamycin behandelt. Beachten Sie, dass die Zellen, die keine Silber-Nanopartikel erhielten, in Gegenwart von sechs Millimolar SDS kultiviert wurden, um sicherzustellen, dass die Tenside nicht unabhängig toxisch wirkten. Sobald die Methode beherrscht ist, können Nanopartikel innerhalb von vier bis fünf Stunden hergestellt und charakterisiert werden.Die Überprüfung der antibakteriellen Toxizität der Nanopartikel erfordert zusätzliche 24 Stunden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Konsistenz zwischen Chargen eine sorgfältige Beachtung von Details wie Pulsenergie und Linsenpositionierung erfordert. Vergessen Sie nicht, dass diese Arbeit äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie beispielsweise ein geeigneter Augenschutz, stets getroffen werden sollten, während das Verfahren durchgeführt wird.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln (Video) | JoVE Journal

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

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