Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Größenbestimmung nicht chemisch vernetzter Schaumstoffe oder Mikroträger zu unterstützen, die aus gewebespezifischer extrazellulärer Matrix gewonnen wurden und für Anwendungen in 3D-In-vitro-Zellkultursystemen oder als pro-regenerative Gerüste in Zellapplikationssystemen dienen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen angewandte Zellbiologie und Gewebeengineering zu beantworten, beispielsweise wie die dreidimensionale zelluläre Mikroumgebung die Zellfunktion und Geweberegeneration beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Herstellung von Gerüsten mit einstellbaren Geometrien ermöglicht, die der nativen, gewebespezifischen ECM-Zusammensetzung nachempfunden sind und langfristig stabil im Kulturmedium bleiben, ohne zusätzliche Vernetzung.

Nachdem das aus dem Gewebe gewonnene ECM gemäß dem Textprotokoll lyophilisiert wurde, verwenden Sie scharfe chirurgische Scheren, um das entzelligte Gewebe fein zu zerkleinern. Um das verarbeitete Gewebe einzumahlen, füllen Sie eine 25 Milliliter fassende Mahlkammer aus rostfreiem Stahl eines Labor-Kugelmühlsystems mit dem zerkleinerten lyophilisierten ECM und geben zwei 10-Milliliter-Kugeln aus rostfreiem Stahl hinzu. Schließen Sie die beladene Mahlkammer und tauchen Sie sie vollständig für drei Minuten in flüssigen Stickstoff ein.

Danach die gefrorene Probe drei Minuten lang bei 30 Hertz mahlen. Wiederholen Sie das Eintauchen in flüssigen Stickstoff und das Mahlen, bis die ECM zu einem feinen Pulver gemahlen ist. Wiegen Sie 250 Milligramm der zerkleinerten oder kryogemahlenen ECM ab und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie fünf Milliliter Pufferlösung aus 22 molarem NaH2PO4 in ein Zentrifugenröhrchen und markieren Sie den Flüssigkeitsstand am Röhrchen. Bereiten Sie anschließend eine Stammlösung aus Alpha-Amylase vor, indem Sie 7,5 Milligramm Alpha-Amylase zu einem Milliliter 22 molarem NaH2PO4-Puffer hinzufügen. Geben Sie danach 100 Mikroliter der Alpha-Amylase-Stammlösung zur Probe hinzu.

Dann 22 molares NaH2PO4 hinzufügen, um ein Endvolumen von 10 Milliliter zu erhalten. Die Suspension 72 Stunden lang kontinuierlich bei 300 U/min und Raumtemperatur schütteln. Die Suspension bei 1500 × g 10 Minuten lang zentrifugieren.

Sammeln Sie den Überstand vorsichtig auf und entsorgen Sie ihn, ohne den pellettieren digested ECM-Stoff zu stören. Suspendieren Sie das Pellet anschließend in 10 Milliliter 5 %iger NaCl-Lösung, die in doppelt destilliertem Wasser verdünnt wurde, und rühren Sie 10 Minuten lang kontinuierlich bei 300 U/min. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zwei weitere Male, bevor Sie das Pellet in 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser erneut suspendieren.

Anschließend die Suspension kontinuierlich 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 U/min schütteln. Nach erneutem Zentrifugieren der Probe vorsichtig den Überstand abheben und verwerfen, ohne den verdauten ECM-Pellet zu stören. Essigsäure in zweifacher Molarität bis zur Fünf-Milliliter-Marke hinzufügen.

Und vortexen. Anschließend die Suspension über Nacht kontinuierlich bei 120 U/min und 37 Grad Celsius agitieren. Am folgenden Tag die ECM-Suspension bei Raumtemperatur mit einem Handhomogenisator, der mit einer 10 Millimeter breiten Sägezahnsonde ausgestattet ist, in Intervallen von 10 Sekunden homogenisieren, bis keine sichtbaren Fragmente mehr vorhanden sind.

Stellen Sie die Suspension zwischen den Homogenisierungsintervallen zur Vermeidung einer Überhitzung in ein Becherglas mit kaltem Wasser. Inkubieren Sie die ECM-Suspension bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Schüttelung bei 120 U/min, bis die Suspension warm ist. Verdünnen Sie dann die Probesuspension mit 2-molarer Essigsäure auf die gewünschte Konzentration.

Mit einer Dreimilliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel die gewünschte Form mit der ECM-Suspension füllen. Schaumstoffe können in einer Vielzahl von Geometrien hergestellt werden, abhängig von der Form der Gießform. Die Formen abdecken und bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius einfrieren.

Anschließend die Formen in ein Lyophilisator-Gefäß geben. Das Gefäß mit der Gefriertrocknungsanlage des Labors verbinden und die Formen 24 Stunden oder bis zur vollständigen Trocknung trocknen. Die kryogemahlene ECM-Suspension über Nacht unter kontinuierlicher Agitation bei 100 U/min inkubieren.

Geben Sie drei Milliliter der ECM-Suspension in eine Drei-Milliliter-Luer-Lock-Spritze und befestigen Sie ein Kanüleninfusionsset am Spritzenstutzen. Sichern Sie die Spritze in der Spritzenpumpe. Befestigen Sie anschließend die Nadel an einem Stativ und positionieren Sie die Nadelspitze senkrecht in einem Abstand von vier bis sechs Zentimetern über dem Boden eines flachen Dewar-Gefäßes.

Befestigen Sie als nächstes eine Krokodilklemmenelektrode an der Nadelspitze, wobei sichergestellt werden muss, dass die Krokodilklemme mit dem positiven Anschluss der Hochspannungsstromversorgung verbunden ist. Falten Sie einen Streifen Aluminiumfolie über die Kante des Vakuumkolbens. Befestigen Sie dann eine zweite Krokodilklemmenelektrode an der äußeren Kante der Folie.

Verbinden Sie es mit dem Erdungskontakt der Stromversorgung. Füllen Sie das Dewargefäß mit flüssigem Stickstoff bis etwa einen Zentimeter unter den Rand, sodass drei Viertel der Folie eingetaucht sind. Stellen Sie dann die Spritzenpumpe auf eine Infusionsgeschwindigkeit von 30 Milliliter pro Stunde ein und elektrosprühen Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll.

Nach Abschluss der Infusion gießen Sie vorsichtig die überschüssige flüssige Stickstoffmenge aus dem Dewar ab, wobei der Mikroträger in etwa 25 Milliliter flüssigem Stickstoff suspendiert bleibt, um sicherzustellen, dass sie weiterhin gefroren bleiben. Überführen Sie die Mikroträger unverzüglich mit flüssigem Stickstoff in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie sie in einer einzigen, fließenden Bewegung umgießen. Anschließend sammeln Sie mithilfe einer Scoopula alle im Dewar verbliebenen gefrorenen Mikroträger ein.

Fügen Sie sie ebenfalls zur Zentrifuge hinzu. Um die Lyophilisierung vorzubereiten, bedecken Sie das Zentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie, die mit kleinen Löchern perforiert ist. Stellen Sie die abgedeckten Zentrifugenröhrchen in einen Lyophilisierkolben.

Verbinden Sie das Kolben unverzüglich mit dem Lyophilisator und trocknen Sie die Proben über Nacht. Überführen Sie den lyophilisierten Schaum vorsichtig in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das überschüssiges absolutes Ethanol enthält. Suspenderen Sie die lyophilisierten Mikroträger auf die gleiche Weise in überschüssigem absolutem Ethanol im ursprünglichen Zentrifugenröhrchen, das für die Sammlung verwendet wurde.

Unter Verwendung einer serologischen Pipette filtrieren Sie die Mikroträger mithilfe eines Edelstahlsiebs mit definierter Maschenweite in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um Aggregate zu entfernen und die gewünschten Größenbereiche auszuwählen. Inkubieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius für vier Stunden oder bis der Schaum oder die Mikroträger am Boden des Zentrifugenröhrchens abgesetzt haben. Entfernen Sie anschließend unter einer laminaren Flusswerkbank mit aseptischer Technik mittels einer serologischen Pipette das absolute Ethanol von den Gerüsten und geben Sie überschüssiges mit steriler PBS verdünntes 95 % Ethanol hinzu.

Die Gerüste vier Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubieren oder bis die Gerüste auf den Boden des Rehydratisierungsgefäßes gesunken sind. Die Gerüste schrittweise durch eine Ethanolreihe wieder befeuchten. Bei jedem Schritt die Gerüste bei vier Grad Celsius inkubieren, bis sie auf den Boden des Gefäßes sinken, bevor die Lösung gewechselt wird.

Ersetzen Sie das sterile PBS durch zwei zusätzliche Spülgänge, um restliches Ethanol zu entfernen. Lagern Sie die Proben in 100 % steriler PBS-Lösung bei vier Grad Celsius, bis sie für die Zellkultur verwendet werden. Verwenden Sie die Scaffolds innerhalb von einer bis zwei Wochen nach der Rehydratisierung.

Hier sind Beispiele für die Arten von aus ECM abgeleiteten Schaumstoffen und Mikroträgern gezeigt, die unter Verwendung von dezellularisiertem Fettgewebe hergestellt wurden. Schweinespezifisches dezellularisiertes Hautgewebe und Schweinespezifisches dezellularisiertes linkes Ventrikelgewebe. Die Techniken verdeutlichen, dass sie zur Herstellung gewebespezifischer Bioscaffolds unter Verwendung einer Vielzahl von dezellularisierten Geweben als ECM-Quellen angewendet werden können.

Nach kryomikrotrituration oder Zerkleinerung, enzymatischer Verdauung und Homogenisierung können die Proben vor dem Einfrieren und Lyophilisieren in eine Schale abgefüllt werden. Diese Abbildung zeigt rehydrierte DAT-, DDT- und DLV-Mehlschäume, die in einer 48-Loch-Zellkulturplattenform synthetisiert wurden. Diese DAT-, DDT- und DLV-Schäume wurden aus kryogemahlenem ECM mit einer Konzentration von 35 Milligramm pro Milliliter und einer Gefriertemperatur von minus 80 Grad Celsius hergestellt.

Um aus der ECM abgeleitete Mikroträger mittels einer Elektrosprüh-Technik herzustellen, können für jede ECM-Quellsuspendierung die Konzentration, die Nadelgröße, die Infusionsgeschwindigkeit und die Spannung angepasst werden, um nach kontrollierter Rehydratation diskrete sphärische Mikroträger mit einem Durchmesser von 350 bis 500 Mikrometern zu erzeugen. Schließlich zeigen die hier mittels REM dargestellten DAT-, DDT- und DLV-Mikroträger, dass die Ultrastruktur hinsichtlich der Größe je nach entzellulierter ECM-Quelle variieren kann. Die in diesem Video vorgestellten Methoden können verwendet werden, um eine Vielzahl an gewebespezifischen Mikroträgern und Schaumstoffen herzustellen, die aus reiner, nicht-chemisch vernetzter ECM bestehen und entzelliges Gewebe als Matrixquelle nutzen.

Mit diesen Verfahren können die Schäume und Mikroträger unter statischen oder dynamischen Bedingungen mit Zellen besiedelt werden und als zellanleitendes Substrat für die Zellkultur in vitro sowie für Anwendungen in vivo eingesetzt werden.