Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Größe von nicht-chemisch vernetzten Schäumen oder Mikroträgern zu unterstützen, die aus gewebespezifischer extrazellulärer Matrix für Anwendungen in 3D-Invitro-Zellkulturmodellen oder als pro-regenerative Gerüste in Zellverabreichungssystemen gewonnen werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen der angewandten Zellbiologie und des Tissue Engineering zu beantworten, z. B. wie die zelluläre 3D-Mikroumgebung die Zellfunktion und die Geweberegeneration vermittelt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Herstellung von Gerüsten mit abstimmbaren Geometrien ermöglicht, die die native gewebespezifische EZM-Zusammensetzung nachahmen und in Langzeitkulturen ohne zusätzliche Vernetzung stabil sind.

Nach der Lyophilisierung der aus dem Gewebe gewonnenen EZM gemäß dem Textprotokoll wird das dezellularisierte Gewebe mit einer scharfen chirurgischen Schere fein zerkleinert. Um das verarbeitete Gewebe zu kryomillen, füllen Sie eine 25-Milliliter-Mahlkammer aus Edelstahl für ein Labor-Kugelmühlensystem mit gehackter lyophilisierter ECM und fügen Sie zwei 10-Milliliter-Mahlkugeln aus Edelstahl hinzu. Schließen Sie die beladene Mahlkammer und tauchen Sie sie drei Minuten lang vollständig in flüssigen Stickstoff.

Anschließend mahlen Sie die gefrorene Probe bei 30 Hertz für drei Minuten. Wiederholen Sie das Eintauchen in flüssigen Stickstoff und das Mahlen, bis das ECM zu einem feinen Pulver gemahlen ist. Wiegen Sie 250 Milligramm zerkleinertes oder kryogemahlenes ECM ab und geben Sie es in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie fünf Milliliter 22 molaren NaH2PO4-Puffer in das Zentrifugenröhrchen und markieren Sie den Flüssigkeitsstand auf dem Röhrchen. Bereiten Sie dann eine Alpha-Amylase-Stammlösung vor, indem Sie 7,5 Milligramm Alpha-Amylase zu einem Milliliter 22 molaren NaH2PO4-Puffer hinzufügen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Alpha-Amylase-Stammlösung in die Probe.

Fügen Sie dann 22 molare NaH2PO4 hinzu, um ein Endvolumen von 10 Millilitern zu erhalten. Bewegen Sie die Aufhängung 72 Stunden lang kontinuierlich bei 300 U/min und Raumtemperatur. Die Suspension wird 10 Minuten lang bei 1500 mal G zentrifugiert.

Sammeln Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn, ohne das verdaute ECM-Pellet zu stören. Verwenden Sie dann 10 Milliliter fünf Prozent NaCl, verdünnt in doppelt destilliertem Wasser, um das pelletierte Material wieder zu suspendieren, und rühren Sie 10 Minuten lang kontinuierlich bei 300 U/min. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei Mal, bevor Sie 10 Milliliter doppelt destilliertes Wasser verwenden, um das Pellet wieder zu suspendieren.

Rühren Sie dann die Federung 10 Minuten lang kontinuierlich bei 300 U/min bei Raumtemperatur. Nach erneuter Zentrifugation der Probe ist der Überstand vorsichtig zu sammeln und zu entsorgen, ohne das aufgeschlossene ECM-Pellet zu stören. Fügen Sie 2 molare Essigsäure zur Fünf-Milliliter-Marke hinzu.

Und Vortex. Bewegen Sie dann das Fahrwerk über Nacht kontinuierlich bei 120 U/min und 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag wird die ECM-Suspension mit einem Handhomogenisator, der mit einer 10 Millimeter breiten Sägezahnsonde ausgestattet ist, bei Raumtemperatur in 10-Sekunden-Intervallen homogenisiert, bis keine sichtbaren Fragmente mehr übrig sind.

Die Suspension zwischen den Homogenisierungsintervallen in ein Becherglas mit kaltem Wasser geben, um eine Überhitzung zu vermeiden. Die ECM-Suspension wird bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlichem Rühren bei 120 U/min inkubiert, bis die Suspension warm ist. Anschließend verwenden Sie 2 molare Essigsäure, um die Probensuspension auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen.

Füllen Sie mit einer Drei-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel die gewünschte Form mit der ECM-Suspension. Schaumstoffe können je nach Form der Form der Form in einer Reihe von Geometrien hergestellt werden. Die Förmchen abdecken und bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius einfrieren.

Geben Sie dann die Formen in einen Lyophilisatorkolben. Schließen Sie den Kolben an das Gefriertrocknersystem des Labors an und trocknen Sie die Formen 24 Stunden lang oder bis sie vollständig getrocknet sind. Inkubieren Sie die kryogemahlene ECM-Suspension unter kontinuierlichem Rühren bei 100 U/min über Nacht.

Geben Sie drei Milliliter ECM-Suspension in eine Drei-Milliliter-Luer-Lock-Spritze und befestigen Sie ein geflügeltes Infusionsset an der Bohrung der Spritze. Befestigen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe. Befestigen Sie dann die Nadel an einem Retortenständer und positionieren Sie die Nadelspitze senkrecht in einem Abstand von vier bis sechs Zentimetern zur Spitze eines niedrig geformten Dewarkolbens.

Befestigen Sie als Nächstes eine Krokodilklemme-Elektrode an der Spitze der Nadel und stellen Sie sicher, dass die Krokodilklemme mit dem Pluspol des Hochspannungsnetzteils verbunden ist. Falten Sie einen Streifen Alufolie über den Rand der Isolierflasche. Befestigen Sie dann eine zweite Krokodilklemmen-Elektrode an der Außenkante der Folie.

Schließen Sie es an die Erdungsleiterklemme des Netzteils an. Den Dewargefäß wird etwa einen Zentimeter von oben mit flüssigem Stickstoff gefüllt, so dass drei Viertel der Folie untergetaucht sind. Stellen Sie dann die Spritzenpumpe auf eine Infusionsrate von 30 Millilitern pro Stunde ein und sprühen Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll elektrosprühen.

Sobald die Infusion abgeschlossen ist, gießen Sie vorsichtig überschüssigen Flüssigstickstoff aus dem Dewar ab und lassen Sie den Mikroträger in etwa 25 Millilitern flüssigem Stickstoff schweben, um sicherzustellen, dass er gefroren bleibt. Übertragen Sie die Mikroträger sofort mit flüssigem Stickstoff in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie in einer gleichmäßigen Bewegung gießen. Verwenden Sie dann eine Scoopula, um alle gefrorenen Mikroträger einzusammeln, die im Dewar übrig geblieben sind.

Geben Sie sie ebenfalls in die Zentrifuge. Um die Gefriertrocknung vorzubereiten, decken Sie das Zentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie ab, die mit kleinen Löchern perforiert ist. Legen Sie die abgedeckten Zentrifugenröhrchen in einen Lyophilisatorkolben.

Verbinden Sie dann sofort den Kolben mit dem Gefriertrockner und trocknen Sie die Proben über Nacht. Den lyophilisierten Schaum vorsichtig in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit überschüssigem absolutem Ethanol überführen. In ähnlicher Weise werden die lyophilisierten Mikroträger mit überschüssigem absolutem Ethanol in dem ursprünglichen Zentrifugenröhrchen, das für die Entnahme verwendet wurde, wieder suspendiert.

Mit einer serologischen Pipette filtrieren Sie die Mikroträger durch ein Edelstahlsieb mit definierter Maschenweite in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um alle Aggregate zu entfernen und für die gewünschten Größenbereiche auszuwählen. Inkubieren Sie die Probe vier Stunden lang bei vier Grad Celsius oder bis sich der Schaum oder die Mikroträger am Boden des Zentrifugenröhrchens abgesetzt haben. Verwenden Sie dann unter einer Laminar-Flow-Haube mit aseptischer Technik eine serologische Pipette, um das absolute Ethanol von den Gerüsten zu entfernen, und fügen Sie überschüssiges 95%iges Ethanol hinzu, das mit sterilem PBS verdünnt ist.

Inkubieren Sie die Gerüste vier Stunden lang bei vier Grad Celsius oder bis die Gerüste auf den Boden des Rehydrationsgefäßes gesunken sind. Rehydrieren Sie die Gerüste nach und nach durch eine Ethanolserie. Inkubieren Sie die Gerüste bei jedem Schritt bei vier Grad Celsius, bis sie auf den Boden des Gefäßes sinken, bevor Sie die Lösung wechseln.

Ersetzen Sie das sterile PBS durch zwei zusätzliche Spülgänge, um Ethanolreste zu entfernen. Lagern Sie die Proben in 100 % sterilem PBS bei vier Grad Celsius, bis sie für die Zellkultur bereit sind. Verwenden Sie die Gerüste innerhalb von ein bis zwei Wochen nach der Rehydrierung.

Hier sind Beispiele für die Arten von EZM-abgeleiteten Schäumen und Mikrocarriern gezeigt, die aus dezellularisiertem Fettgewebe hergestellt werden. dezellularisiertes Hautgewebe von Schweinen und dezellularisierter linker Ventrikel von Schweinen. Es wird gezeigt, dass die Techniken zur Generierung gewebespezifischer Biogerüste unter Verwendung einer Vielzahl von dezellularisierten Geweben als EZM-Quellen angewendet werden können.

Nach dem Kryomahlen oder Zerkleinern, dem enzymatischen Aufschluss und der Homogenisierung können die Proben vor dem Einfrieren und der Gefriertrocknung in eine Schüssel gegeben werden. Diese Abbildung stellt rehydrierte DAT-, DDT- und DLV-gefräste Schäume dar, die in einer 48-Well-Gewebekulturplattenform synthetisiert wurden. Diese DAT-, DDT- und DLV-Schäume wurden mit kryogemahlenem ECM in einer Konzentration von 35 Milligramm pro Milliliter und einer Gefriertemperatur von minus 80 Grad Celsius hergestellt.

Zur Herstellung von ECM-abgeleiteten Mikroladungsträgern unter Verwendung einer Elektrosprühtechnik können für jede ECM-Quelle die Suspensionskonzentration, die Infusionsrate der Nadelstärke und die Spannung abgestimmt werden, um diskrete kugelförmige Mikroladungsträger mit einem Durchmesser von 350 bis 500 Mikrometern nach kontrollierter Rehydrierung zu erzeugen. Schließlich zeigen die hier gezeigten DAT-, DDT- und DLV-Mikrocarrier, dass die Größe der Ultrastruktur je nach dezellularisierter ECM-Quelle variieren kann. Die in diesem Video vorgestellten Methoden können verwendet werden, um eine Vielzahl von gewebespezifischen Mikrocarriern und Schäumen herzustellen, die aus reiner, nicht chemisch vernetzter EZM bestehen, wobei dezellularisiertes Gewebe als Matrixquelle verwendet wird.

Nach diesen Verfahren können die Schäume und Microcarrier unter statischen oder dynamischen Bedingungen mit Zellen besiedelt und als zellinstruktives Substrat für In-vitro-Zellkulturen und In-vivo-Anwendungen verwendet werden.