SNP-Genotypisierung

Genetischer Variation tritt sowohl innerhalb als auch zwischen verschiedenen Populationen und trägt zur Veränderung Merkmale, einschließlich Krankheitsanfälligkeit, zwischen den Individuen. Die häufigsten Varianten sind Einzel-Nukleotid-Polymorphismen, oder SNPs. SNP Genotyping beinhaltet bestimmen, die bestimmten Gruppen von Varianten, in diesem Fall SNPs in Individuum vorhanden.

Dieses Video wird diskutieren einige der Grundregeln hinter SNP-Genotypisierung, geben Sie eine Einführung in mehreren gemeinsamen SNP-Identifikations-Methoden, und zu guter Letzt einige Anwendungen dieser Techniken.

Zuerst lassen Sie uns besprechen, was ein SNP ist und wie es in Genotypisierung verwendet werden kann.

"Polymorphismen" sind Allele oder verschiedene Versionen von einer genetischen Locus, mit nennenswerter Häufigkeit innerhalb einer Population gefunden und umfassen base Auswechslungen sowie Insertionen oder Deletionen. Einzel-Nukleotid-Polymorphismen sind Abweichungen bei einer einzigen DNA-Basis. SNPs können während des gesamten Genoms auftreten, und die meisten Protein-Struktur oder gen-Expression nicht verändern. Jedoch können sie nach wie vor Erkrankungen, die durch ihre räumliche Nähe oder "Bindung" zu einer krankheitsverursachenden genetischen Variante zugeordnet werden. Auf der anderen Seite gibt es mehrere prominente SNPs, die bekanntermaßen direkt verursachen Krankheiten wie Mukoviszidose, Sichelzell-Anämie und β-Thalassämie.

Eine praktische Anwendung für die SNP-Genotypisierung ist personalisierte Medizin, wo helfe Identifizierung von SNPs, die verbunden mit Krankheiten oder differenzierte Antworten auf ein Medikament oder Therapie, sind, Ärzte besser zu diagnostizieren und behandeln Patienten.

SNPs sind auch nützlich für genomweite Assoziationsstudien, die Hunderttausende von SNPs, über das gesamte Genom untersuchen, diejenigen zu identifizieren, die Merkmale oder Krankheiten zugeordnet sind. GWAS nutzt Gruppen von SNPs, bekannt als "Haplotypen." SNPs innerhalb einer Haplotyp sind in "Verknüpfung Ungleichgewicht", was bedeutet, dass die besondere Kombination von Varianten sind eher zusammen, als durch Zufall erwartet auftreten, oft das Ergebnis von ihrer physischen Nähe auf einem Chromosom. Dies bedeutet, dass Haplotypen durch Genotypisierung unterschieden werden können, nur eine kleine Anzahl von einzelnen SNPs, dass genetische Assoziation weniger Kosten- und arbeitsintensive Studien.

Nach einem Blick auf was SNPs sind und wie sie verwendet werden können, lassen Sie uns einige der zahlreichen Methoden, die zum Genotyp SNPs entwickelt wurden. Dazu gehören direkte Hybridisierung, PCR-basierte Methoden, Fragment Analyse und Sequenzierung.

Direkte Hybridisierung Techniken wie SNP-Arrays kurze Oligonukleotid Sonden mit einzelnen SNPs direkt bestimmt werden. Hunderttausende von SNPs können auf einen einzigen Biochip getestet werden. Die Sonden sind chemisch an die Chipmatrix, in der Regel einen Objektträger befestigt. Um SNPs in einer Probe zu erkennen, ist die isolierter genomischer DNA durch PCR verstärkt und zersplittert, um die Sonde Bindung-Effizienz zu verbessern. Die DNA ist in der Regel mit einem fluoreszierenden Marker, gefolgt von Hybridisierung mit dem Chip dann beschriftet. Nachdem die Probe DNA binden an die Sonden erlaubt ist, ist alle ungebundenen oder unspezifisch gebundene DNA weggespült. Durch die Messung der Signal an jeder Stelle, Sonde, kann das Vorhandensein des Ziel-Allels in der Probe bestimmt werden.

Ein weiteres SNP-Eingabe Methode ist Allel-spezifische PCR, wo Primer gegen SNP-haltigen Sequenzen so konzipiert sind, dass sie nur auf das perfekt ergänzende Allel hybridisieren. Die PCR-Produkte können durch Methoden wie fluoreszierende Tags erkannt werden. Alternativ können PCR Primer flankieren die SNP-Ort von Interesse in Verbindung mit einem SNP-spezifische Fühler, wie in der TaqMan PCR-Assay gestaltet werden. Hier enthält die Sonde einen fluoreszierenden Marker sowie ein Quencher-Molekül, das die Fluoreszenz von der nahe gelegenen Marker unterdrückt. Während der PCR wird nur die spezifisch gebundenen Sonde Sequenz von 5 ' Exonuclease Tätigkeit der Polymerase, der Quencher das fluoreszierende Tag trennt und was ein Fluoreszenzsignal, der angibt, das Vorhandensein von bestimmten Variante abgebaut werden.

Eine dritte Kategorie von Methoden, als Fragment Analyse beinhaltet die Erstellung von DNA-Fragmenten verschiedener Größen oder Etiketten, basierend auf das Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten SNP. Beschränkung Fragment-Länge Polymorphie Analyse nutzt die strengen Spezifität der Beschränkung Endonucleases für ihre Ziel-Sequenzen, wo ein Allel ist gespalten und die andere nicht. Ligatur-Assay verwendet zwei Sonden direkt neben einander, von denen an die Ziel-SNP-Länge endet. Wenn die SNP-haltigen Sonde perfekt bindet, kann Ligatur auftreten. Primer-Extension-Assay beinhaltet Grundierungen, die ein Nukleotid unter dem Ziel SNP zu binden. Diese Grundierung wird dann variabel erweitert basierend auf den einzelnen Allel vorhanden. Die Fragmente generiert durch diese Methoden können dann mit Gel oder Kapillarelektrophorese oder Massenspektrometrie unterschieden werden.

Zu guter Letzt kann Sequenzierung SNPs sehr spezifisch zu erkennen, sowie Roman SNPs mit unbekannten Sequenzen zu identifizieren. Allerdings müssen besonders vorsichtig und zusätzliche experimentelle Wiederholungen durchgeführt werden, um tatsächliche SNPs Sequenzierung Lesefehler unterscheiden. Sequenziertechnologien billiger und leichter zugänglich werden, nutzen Forscher zunehmend Sequenzierung für die Genotypisierung.

Gesehen zu haben wie SNPs genotypisiert sein können, betrachten wir einige spezifischen Anwendungen für diese Techniken.

Genotypisierung lässt sich unterscheiden zwischen Varietäten einer Art mit nahezu identisch aussehen. Dies geschieht durch erste Isolierung genomischer DNA, gefolgt von PCR unter Verwendung Zündkapseln Sequenzen mit bekannten SNPs oder andere genetische Varianten binden soll. Diese Primer werden nur DNA der Sorte mit den spezifischen Polymorphismus verstärken und dadurch können zur Unterscheidung zwischen diesen Look-alikes.

Forscher verwenden auch Genotypisierung, um Pathogene Bakterien beherbergen bestimmte Resistenzen Mutationen zu identifizieren. Eine optimierte SNP Array Protokoll für ressourcenschonende Einstellungen erfolgt durch Hinzufügen von genomischer DNA und PCR-Master-Mix direkt auf einen Chip. Probe-Verstärkung und Hybridisierung auftreten in einem Schritt. Die Arrays werden dann gewaschen, abgebildet, und Ergebnisse werden analysiert, um das Vorhandensein oder Fehlen von Tuberkulose-Bakterien, sowie resistenten Mutationen zu bestimmen.

SNPs ist zu guter Letzt lässt sich die Funktion der Genvarianten gefunden, um Krankheitsrisiken erhöhen durch Assoziationsstudien zu beurteilen. Hier experimentierten Wissenschaftler mit einer Zelllinie, die heterozygot für eine neutrale "Marker" SNP befindet sich in der transkribierten Teil eines Gens von Interesse, sowie einen untranscribed Test SNP, die Krankheit verbunden ist. Eine Negativkontrolle Zelllinie wird gewählt, ist heterozygot für die Markierung SNP, aber homozygot für die nicht-Krankheit assoziierten Variante des SNP-Tests. Allel-spezifische Primer Extension erfolgte auf genomischer DNA sowie cDNA reverse von ausgedrückt mRNA transkribiert. Die Primer Extension Produkte wurden dann quantitated mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Durch den Vergleich der relativen Fülle der Fragmente mit zwei Marker SNP Allele verbunden, können Forscher feststellen, ob die krankheitsassoziierten SNP verringerte Genexpression führt.

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