Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Quantifizierung von Muskelfasern in gesamten Rattenmuskeln auf schnelle und zuverlässige Weise automatisch und unabhängig vom Anwender mithilfe einer Open-Source-Plattform zu unterstützen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im neuromuskulären Forschungsbereich bezüglich altersbedingter, krankheitsbedingter oder traumatischer Defekte an Skelettmuskeln zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur verlässlichen Analyse von Muskel-Faser-Populationen und zur Erzeugung hochwertiger Bilder von Muskelquerschnitten verwendet werden kann.

Nach ausreichendem Auftauen spülen Sie die Proben vorsichtig mit PBS, ergänzt durch Triton X, oder PBST, für eine 10-minütige und eine fünfminütige Wäsche aus. Nach der zweiten Wäsche lassen Sie die Schnitte zwei Minuten lang an der Luft trocknen. Umkreisen Sie dann mithilfe eines hydrophoben Stifts die einzelnen Querschnitte.

Nach weiteren 15 Minuten Trocknen an der Luft blockieren Sie unspezifische Bindungen durch Zugabe von PBST, ergänzt mit Ziehenserum, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie danach die Objektträger und geben Sie die geeignete Primärantikörpermischung zu jeder Probe für eine einstündige Färbung bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Objektträger mit einer zehnminütigen und einer fünfminütigen PBST-Waschung ab.

Dann die Muskelproben mit dem entsprechenden Sekundärantikörper-Cocktail für eine Stunde im Dunkeln inkubieren. Nach zweimaligem Waschen der Objektträger in PBST wie gezeigt, die Objektträger abtrocknen und anschließend die Kerne mit einem DAPI-Kernfärbe-Kit gemäß den Herstelleranweisungen anfärben. Überschüssiges DAPI durch einminütiges Waschen mit PBST entfernen, gefolgt von kurzem Lufttrocknen.

Danach die Proben mit fluoreszierendem Eindeckmedium und Deckgläsern abdecken und die Objektträger bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt lagern. Innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach der Färbung die Objektträger in einen Objektträgerscanner laden und ein neues Projekt in der Programmmsoftware öffnen. Für die Objektträgervorschau den DAPI-Kanal und das 2,5x-Objektiv auswählen und manuell auf das erste Präparat fokussieren.

Umreißen Sie jeden Querschnitt, der für den detaillierten Erfassungsprozess enthalten sein soll, und stellen Sie die Belichtungszeiten für jeden Kanal ein. Führen Sie nun die automatische Bildaufnahme durch und überprüfen Sie die korrekte Erfassung des ersten Sichtfelds, um frühzeitige Fehler im automatisierten Prozess zu vermeiden. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, überprüfen Sie manuell, ob die Autofokus-Einstellung der Querschnitte korrekt ist und ob die einzelnen Fasern klar unterscheidbar sind.

Es ist entscheidend, dass die Autofokusfunktion bei jedem Bild nach Bedarf manuell überprüft und korrigiert wird. Der automatisierte Prozess zur Quantifizierung von Muskelfasern erfordert hochwertige Bilder, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Anschließend jedes Kanalbild – mit Ausnahme von DAPI – für jeden Querschnitt, der in die endgültige Analyse einbezogen werden soll, separat als JPEG-Dateien exportieren und die Dateien entsprechend den dargestellten Kanälen benennen und in passend benannte Ordner sortieren.

Bevor Sie mit dem Prozess der Muskelzellfaser-Quantifizierung beginnen, überprüfen Sie jedes Bild in einer geeigneten Bildbearbeitungssoftware, um einen ausreichenden Kontrast zwischen den gefärbten Fasern und dem Hintergrund sicherzustellen. Öffnen Sie anschließend in ImageJ den Befehl Plugins > Macros > Edit, um den Makro-Quellcode anzuzeigen, und ändern Sie das Ordnerverzeichnis für jeden Kanal im Quellcode des Makros. Führen Sie nun den Makro mithilfe des Run-Befehls aus.

Alle Bilder im Ordner werden nacheinander in das Makro geladen und quantifiziert. Am Ende der Quantifizierung werden die Ergebnisse in eine geeignete Tabellenkalkulationssoftware exportiert und die Werte für die positiv gezählten langsamen, intermediären und schnellen Fasern identifiziert. Die Gesamtanzahl der Fasern kann anschließend berechnet werden.

Die immunfluoreszenzfarbliche Markierung von Muskel­fasern ist schnell und weist nur geringe Kreuzreaktivitäten auf; die resultierenden Bilder zeigen einen hohen Kontrast zwischen den gefärbten Fasern und dem umgebenden Gewebe sowie eine klare Unterscheidung zwischen den verschiedenen Faser­typen. Die automatische Analyse ermöglicht die Bestimmung der relativen Muskel­faser­populationen mit einer Genauigkeit von ±4 % im Vergleich zur manuellen Analyse, wobei die absoluten Gesamtzahlen im Vergleich zur manuellen Analyse höher ausfallen. Die relativen Anteile hingegen bleiben ähnlich und liegen innerhalb eines Bereichs von ±4 %.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Methode zur Automatisierung der Muskelzellfaser-Quantifizierung anwenden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DAPI gefährlich sein kann. Tragen Sie daher die geeignete Schutzausrüstung, während Sie die Färbung durchführen.