Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Makrophagen aus Geweben, die häufig von ernährungsbedingten Entzündungen betroffen sind, wie z. B. der Leber, effektiv zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Immunologie und Entzündung zu beantworten, wie der geweberesidente Makrophagen-Phänotyp das Fortschreiten chronischer Entzündungserkrankungen bestimmen kann. Der Hauptvorteil davon besteht darin, dass das Verfahren die Isolierungsschritte optimiert, die für die Gewinnung von Einzelzellsuspensionen erforderlich sind, die aus Geweben stammen, die von einer durch Fettleibigkeit vermittelten mindergradigen chronischen Entzündung betroffen sind.

Das Verfahren wird von Joselyn Allen, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um die Leber zu isolieren, legen Sie zunächst eine mit Ethanol getränkte Maus in Rückenlage auf ein Präparierbrett aus Styroporschaum und sichern Sie die Vorder- und Hinterpfoten. Fassen Sie als Nächstes mit einer Zange mit mittlerer Spitze die Bauchhaut in der Nähe der Harnröhrenöffnung und verwenden Sie eine scharfe Präparierschere, um einen kleinen Schnitt in der erhabenen Haut zu machen.

Führen Sie die untere Klinge der Schere in den Schnitt zwischen Haut und Bauchfell ein und machen Sie einen seitlichen Schnitt von der Leiste bis zum Kinn. Ziehen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die intakte Bauchhöhle und die Brustwand freizulegen, und machen Sie einen seitlichen Schnitt durch das Bauchfell. Hebe das Brustbein an und schneide das Zwerchfell vorsichtig ein.

Schieben Sie dann die gastrointestinalen Organe zur Seite und lokalisieren Sie die subhepatische untere Hohlvene oder IVC. Klemmen Sie mit einer hämostatischen Pinzette die suprahepatische IVC ein, um eine lokalisierte Perfusion aufrechtzuerhalten, und befestigen Sie eine mit vorgewärmtem Perfusionspuffer gefüllte Spritze an einem 23-Gauge-Blutentnahme- und Infusionsset. Drücken Sie den Kolben vorsichtig zusammen, bis der Schlauch und die Nadel mit Perfusionspuffer gefüllt sind, und führen Sie die Nadel parallel zur subhepatischen IVC ein.

Die richtige Kanülierung des IVC stellt sicher, dass der Dissoziationspuffer lokal in der Leber und im peripheren Gewebe verteilt wird, wodurch die Gewebeverdauung optimiert wird. Verwenden Sie eine vier Zentimeter lange hämostatische Klemme, um die Nadel an Ort und Stelle zu halten, und drücken Sie den Kolben vorsichtig nieder, um die Perfusion zu starten. Wenn die Nadel richtig positioniert ist, wird die Farbe schnell von der Leber gespült und die Lappen werden vergrößert.

Schneiden Sie sofort die Pfortader, damit der Perfusionspuffer frei durch die Leber fließen kann, und massieren Sie gelegentlich sanft die Lappen zwischen Daumen und Zeigefinger, um die Entnahme des Blutes zu erleichtern. Wenn nur noch fünf Milliliter Perfusionspuffer übrig sind, ersetzen Sie die Perfusionspufferspritze durch eine Spritze, die mit vorgewärmtem Dissoziationspuffer gefüllt ist, und massieren Sie die Lappen weiterhin sanft und perfundieren Sie die Leber, bis sie vollständig verdaut ist. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Verdauung, indem Sie den stumpfen Rand einer Pinzette vorsichtig in den linken Seitenlappen drücken.

Auf der Oberfläche sollte eine Vertiefung erscheinen, die sich langsam füllt, sobald die Pinzette entfernt wird. Entfernen Sie dann die Nadel und schneiden Sie mit einer kurzen geraden Klinge aus einer Präparierschere vorsichtig durch die Verbindungsbänder, um die gesamte Leber und die Gallenblase herauszuschneiden. Übertragen Sie die Leber in eine 10 Zentimeter große Schale, die 10 Milliliter eiskaltes DMEM enthält, und greifen Sie mit einer Zahnzange die durchtrennte suprahepatische IVC.

Üben Sie mit einer Pinzette mit mittlerer Spitze eine schnelle Streichbewegung auf jeden Lappen aus, um die Zellen aus der Glisson-Kapsel zu lösen und das gesättigte DMEM durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis zu leiten. Hohe Ausbeuten an lebensfähigen Zellen können nur durch die richtige Dissoziation der Leberzellen von der Glisson-Kapsel erreicht werden. Wenn alle Zellen gesammelt wurden, drehen Sie das Röhrchen um, um die Zellsuspension vorsichtig zu mischen und die Zellen durch Zentrifugation zu pelletieren.

Übertragen Sie den Überstand in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen für drei weitere Zentrifugationen mit niedriger Drehung. Nach der letzten Zentrifugation wird der Überstand in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und die Zellen noch einmal mit höherer Geschwindigkeit zentrifugiert. Dann resuspendieren Sie das nicht-parenchymale Zellpellet in FACS-Puffer zur Zählung und verdünnen Sie die Leberzellen auf die entsprechende Konzentration entsprechend ihrer nachgeschalteten Anwendung in markierten fünf Milliliter Polystyrolröhrchen mit rundem Boden.

Mäuse, die mit einer fettreichen Diät oder einer fettreichen Diät mit hohem Cholesterinspiegel gefüttert werden, zeigen eine vermehrte Infiltration von klassisch aktivierten M1-Makrophagen in betroffene Gewebe wie die Aorta. RON-Rezeptor-exprimierende CD45-positive F4/80-positive Makrophagen, die einen entzündungshemmenden Phänotyp aufweisen, sind bei Mäusen mit hohem Fettgehalt und hohem Cholesterinspiegel verringert, während proinflammatorische CD45-positive F4/80-positive CD11c-positive Makrophagen in erhöhter Zahl in Aorten gefunden werden, die von diesen Tieren isoliert wurden. Darüber hinaus zeigen sortierte RON-Rezeptor-exprimierende Makrophagen, die aus verdauten Aorten stammen, eine erhöhte Expression des Arginase-1-Gens, einem gut etablierten M2-Makrophagenmarker.

Tatsächlich zeigt die Charakterisierung leberresidenter Makrophagen, dass der vorherrschende Phänotyp von RON-Rezeptor-exprimierenden Subpopulationen mit CD11c-positiven proinflammatorischen Makrophagenpopulationen eine verminderte Expression von Genen zeigt, die stark mit dem anti-inflammatorischen M2-Phänotyp assoziiert sind. Ähnliche Trends werden in den Makrophagenpopulationen beobachtet, die aus verdautem weißem Fettgewebe isoliert wurden, wobei proinflammatorische Phänotyp-Makrophagenpopulationen eine verminderte Oberflächenexpression des RON-Rezeptors aufwiesen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 bis 30 Minuten pro Tier abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Durchflusszytometrie, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und/oder quantitative PCR durchgeführt werden, um den Phänotyp der isolierten leberabgeleiteten geweberesidenten Makrophagen weiter zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man geweberesidente Makrophagen aus erkrankten Lebern richtig isoliert. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.