Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening
15. April 2017
Hier zeigen wir die Herstellung von humanen konstruierte Herzgewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten. Wir stellen eine Methode Kontraktionskraft und beispielhafte Veränderung der Kontraktionsmuster durch den hERG-Kanal-Hemmer E-4031 zu analysieren. Dieses Verfahren zeigt hohe Robustheit und die Eignung für das Herz Wirkstoff-Screening.
Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, dreidimensionales, gewebetechnisch hergestelltes Herzgewebe zu erzeugen, das als Plattform für die Analyse der Kontraktion in vitro zur Arzneimittelscreening und Krankheitsmodellierung verwendet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardialen Bereich bezüglich der Krankheitsmodellierung, der Sicherheitspharmakologie sowie der Auswirkungen von Genvarianten oder Arzneimitteln auf die kontraktile Kraft zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die kontraktile Kraft in gewebetechnisch hergestelltem Herzgewebe aus verschiedenen Spezies unter sterilen Bedingungen über längere Zeiträume hinweg gemessen werden kann.
Wissenschaftler, die mit dieser Methode neu sind, könnten Schwierigkeiten mit der Zellqualität haben oder mit einem Mangel an Bestandteilen im Medium. Es ist wichtig, die eigene Vorbereitung zu optimieren und Zyklen zu vermeiden. Diese Prozedur demonstrieren Anika Benzin und Umber Saleem.
Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, geben Sie 1,6 Milliliter warmes zweiprozentiges Agarose in die Hilfsgele der Vertiefungen einer 24-Loch-Platte. Und platzieren Sie sofort Polytetrafluoroethylen-Abstandshalter in das Agarose. Nach etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur wird das Agarose trüb, was auf seine Verfestigung hinweist.
Entfernen Sie die Abstandshalter und platzieren Sie die PDMS-Racks in die Formen, sodass Paare von Rack-Stiften in jede Agaroseform hineinragen. Sobald alle Racks platziert sind, suspendieren wir die Kardiomyozyten in Medium mit einer Mindestkonzentration von 1,5 × 10⁷ Zellen pro Milliliter und dem frisch zubereiteten Rekonstitutionsgemisch mit Fibrinogen 10 bis 15 Mal mit der serologischen Pipette, bis das Fibrinogen-Gerinnungspräparat vollständig aufgelöst ist. Überprüfen Sie das Rekonstitutionsgemisch in der Pipette auf Homogenität.
Anschießend für jedes hergestellte Herzgewebe, oder EHT, 100 Mikroliter Rekonstitutionslösung mit drei Mikrolitern Thrombin in einem 200-Mikroliter-Röhrchen mischen. Unmittelbar danach 100 Mikroliter dieser EHT-Thrombin-Mischung in die Agarose-Nischen aliquotieren. Für jedes EHT eine neue Filterkappe verwenden.
Nachdem alle Vertiefungen mit Rekonstitutionslösung gefüllt wurden, schließen Sie den Deckel der Zellkulturschale und inkubieren Sie die Ansätze zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und sieben Prozent Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation stellen Sie die Platte in eine sterile Werkbank und überdecken jedes Loch mit 200 bis 500 Mikrolitern Medium. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und bringen Sie die EHTs zurück in den Inkubator.
Nach 10 Minuten die Gestelle vorsichtig in eine neue 24-Well-Platte überführen, die pro Mulde 1,5 Milliliter EHT-Medium enthält, und die Platte unter den geeigneten Kulturbedingungen in einen Zellkulturinkubator stellen. Die EHTs jeden Montag, Mittwoch und Freitag füttern, indem die PDMS-Gestelle in eine zweite Platte mit frischem Medium übertragen werden. Sieben bis 10 Tage nach dem Gießen sollten die EHTs spontane Kontraktionen aufweisen, die die Pfosten der PDMS-Gestelle ablenken.
Um die Kontraktionen des EHT zu analysieren, schalten Sie am Tag des Experiments die Heizvorrichtung im EHT-Analysesystem zwei Stunden vor der Messung ein. Unmittelbar vor der Analyse schalten Sie die Gas- und elektronischen Versorgung des Achssystems ein. Für eine Basislinienaufzeichnung platzieren Sie die EHT-Platte in das EHT-Analysesystem und starten die Software zur Kontraktionsanalyse gemäß den Herstelleranweisungen.
Befolgen Sie die Anweisungen im Softwarehandbuch, um einen neuen Durchlauf zu starten, und klicken Sie auf den Protokoll-Tab, um die relevanten Studieninformationen einzugeben. Öffnen Sie den Setup-Tab und wählen Sie die Vertiefungen für die Analyse aus. Aufgrund von Zeitbeschränkungen wird dies in diesem Video nur für zwei EHTs demonstriert.
Klicken Sie dann auf die Kameraansicht-Registerkarte und starten Sie den Kameramodus in Echtzeit mit automatischer Objekterkennung. Passen Sie die Kameraposition mit den xyz-Koordinaten für jede ausgewählte Vertiefung in der 24-Loch-Platte an, wobei darauf zu achten ist, dass sich jedes EHT in der Mitte des Fensters befindet und scharfgestellt ist. Stellen Sie sicher, dass sich die blauen Kreuze an den oberen und unteren Enden der EHTs befinden und sich bewegen, um den Kontraktionen der EHTs zu folgen.
Drücken Sie die Taste „Position bestätigen“, um die festgelegten Positionen für jede Vertiefung zu speichern. Klicken Sie nun auf den Reiter „Parameter“, um die Kriterien festzulegen, nach denen die Software einen Kontraktionspeak identifiziert, wobei die Peaks mit grünen Quadraten markiert werden. Speichern Sie alle eingegebenen Einstellungen, indem Sie die Schaltfläche „Parameter auf alle Vertiefungen anwenden“ betätigen.
Klicken Sie dann auf den Reiter „automatisch“ und auf die Schaltfläche „Start“, um die Grundlinien-Kontraktionen des EHT aufzuzeichnen und die spontane Grundlinien-Kontraktilität für jeden EHT zu berechnen. Die Echtzeit-Analyse der Kontraktionen wird im Reiter „Echtzeit“ angezeigt. Stellen Sie sicher, dass sich die blauen Kreuze nur vertikal bewegen, um den Kontraktionen des EHTs zu folgen.
Um die Wirkungen eines bestimmten Wirkstoffs auf die Kontraktionen zu analysieren, überführen Sie zunächst eine mit proteinfreier Thyreoidlösung gefüllte 24-Loch-Platte unter sterilen Bedingungen in einen sterilen Abzug und platzieren Sie Kohlenstoffelektroden in die Löcher. Überführen Sie die EHTs in ihren PDMS-Halterungen auf die Elektroden und bringen Sie die EHTs anschließend zurück in den Inkubator. Nach etwa einer halben Stunde platzieren Sie die EHTs in die Verriegelungseinheit des EHT-Analysesystems und nehmen Sie die spontane Grundkontraktionsfähigkeit jeweils 20 Sekunden pro EHT auf.
Als Nächstes verbinden Sie die Karbonelektroden mit dem Stimulationskabel und beginnen Sie, die EHTs elektrisch zu stimulieren. Registrieren Sie die stimulationsgesteuerte Grundlinie für 10 Sekunden pro EHT, wobei darauf zu achten ist, dass alle EHTs korrekt stimuliert werden. Das Stimulationsignal wird nun durch blaue vertikale Linien markiert, die in der Kontraktionskurve vor jedem Peak eingefügt sind.
Nach der Basislinienaufnahme überführen Sie die Elektroden und die PDMS-Gestelle in eine neue 24-Well-Platte, die die erste Wirkstoffkonzentration enthält, und bringen die EHTs unverzüglich in die Verriegelung des EHT-Analysesystems zurück, um eine 20-minütige Inkubation durchzuführen. Schließen Sie die Stimulationskabel erneut an, justieren Sie die Figurenerkennung und nehmen Sie die Kontraktionen der EHTs als Reaktion auf die erste Wirkstoffkonzentration auf. Nachdem alle Wirkstoffkonzentrationen getestet wurden, speichern Sie alle resultierenden PDF-Aufzeichnungen und überprüfen Sie jede Aufzeichnung hinsichtlich der Figurenerkennung sowie der korrekten Positionierung der Kontraktionspeak-Quadrate und Artefakte.
Klicken Sie zur Offline-Analyse im Laufdatenbank die Option „Lauf auswählen“ für den jeweiligen Lauf und wechseln Sie im Parameter-Tab den Parameter für die Kontraktionsanalyse. Wählen Sie anschließend im Offline-Tab die Offline-Analyse, um die Videos erneut zu analysieren. Um die Objekterkennung anzupassen und eine neue Videodatei aufzuzeichnen.
Passen Sie die Erkennung der Form im Reiter Echtzeit an und wählen Sie die Beispielüberprüfung aus. Das EHT wird nun entsprechend der neuen Positionen analysiert. Die Analyse jedes EHT basiert auf der Formerkennung an den oberen und unteren Enden des Gewebes.
Die aufgezeichneten EHT-Kontraktionen werden anschließend automatisch durch den Softwarealgorithmus des EHT-Analysesystems ausgewertet, wobei die Peaks gemäß den entsprechenden vordefinierten Kriterien bestimmt werden. Die Langzeitmessung der EHT-Kontraktionsanalyse zeigt, dass innerhalb von bis zu 20 Stunden keine offensichtlichen zeitabhängigen Veränderungen in der Kontraktionskraft, Schlagfrequenz oder den Zeiten T1 (Kontraktion) bzw. T2 (Relaxation) auftreten. Dies weist auf ein hohes Maß an Stabilität der Konstrukte hin.
Tatsächlich sind die Ergebnisse für jedes Signal EHT mit einer geringen Variabilität reproduzierbar. Eine Exposition gegenüber einem hERG-Kanalblocker führt hingegen zu einer signifikanten Verlängerung der T2-Relaxationszeit, beginnend bei der Konzentration, sowie zu einem unregelmäßigen Schlagmuster bei höheren Konzentrationen.
Wenn die Methode einmal beherrscht ist, können 24 EHTs innerhalb von 30 Minuten erzeugt werden, sofern die Vorbereitung ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des Krankheitsmodellierens den Weg, um die Wirkung von Genvarianten in vitro zu untersuchen. Die Vielseitigkeit dieses Modells ermöglicht es, es mit humanen induzierten Stammzellen oder der Genom-Editierungstechnologie zu kombinieren.
Nach Durchführung dieses Verfahrens können zusätzliche Methoden wie Histologie oder RNA- und Proteinanalysen verwendet werden, um weitere Fragen zur Gen-Transkription und -Expression zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man EHTs herstellt und analysiert. Falls Sie Fragen zu diesem Verfahren haben, zögern Sie nicht und kontaktieren Sie uns direkt.
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Übersicht
Diese Studie demonstriert die Erzeugung dreidimensionaler hergestellter Herzgewebe aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zur in-vitro-Analyse der Kontraktion. Die Methode ermöglicht die Beurteilung der Kontraktionskraft sowie der Wirkung pharmakologischer Substanzen, wie beispielsweise des hERG-Kanal-Inhibitors E-4031, auf die Kontraktionsmuster.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiales Gewebeengineering
- Pharmakologie
- Stammzellforschung
Hintergrund
- Herstellungsverfahren für Herzgewebe können Herzerkrankungen modellieren.
- In-vitro-Plattformen sind entscheidend für die Wirkstoffprüfung und die Sicherheitspharmakologie.
- Das Verständnis der Kontraktionskraft ist entscheidend, um die Herzfunktion zu bewerten.
- Zu den Herausforderungen zählen die Aufrechterhaltung der Zellqualität und die Optimierung der Kulturbedingungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer robusten Methode zur Herstellung von künstlichem Herzmuskelgewebe.
- Untersuchung der Wirkung von Arzneimitteln auf die Herzmuskulatur.
- Schaffung einer Plattform zur Erforschung von Genvarianten und deren Auswirkungen auf die Herzfunktion.
Verwendete Methoden
- Herstellung von künstlichem Herzmuskelgewebe aus hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten.
- Bestimmung der Kontraktionskraft unter sterilen Bedingungen.
- Beurteilung der Kontraktionsmuster als Reaktion auf pharmakologische Substanzen.
- Optimierung der Kulturbedingungen für die zelluläre Qualität.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung funktioneller, künstlich hergestellter Herzgewebe.
- Nachgewiesene Veränderung der Kontraktionsmuster durch E-4031.
- Die Robustheit der Methode unterstützt deren Anwendung in der Wirkstoffscreening.
- Potenzial für Langzeitstudien zur Herzfunktion.
Schlussfolgerungen
- Die Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für die kardiologische Forschung dar.
- Sie ermöglicht die Untersuchung von Arzneimittelwirkungen an Herzmuskelgewebe in vitro.
- Zukünftige Anwendungen umfassen die Modellierung von Erkrankungen und die Sicherheitspharmakologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die automatisierte Kontraktionsanalyse von humanem engineeringbasiertem Herzmuskelgewebe bietet eine skalierbare, standardisierte Plattform für die frühe kardiologische Arzneimittelsicherheitsprüfung und ermöglicht die quantitative Beurteilung der kontraktilen Kraft sowie des arzneimittelinduzierten Arrhythmierisikos. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem er menschliche kardiale Reaktionen auf pharmakologische Wirkstoffe wie hERG-Hemmer nachbildet und somit das Vertrauen in die Zielvalidierung erhöht. Die Methode verbessert den prädiktiven Wert bei der Leitsubstanzidentifizierung, indem sie Modelle aus Stammzellen mit funktionellen Messgrößen verknüpft, die für klinische Sicherheitsausgänge relevant sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen mithilfe kraftgenerierender menschlicher Herzgewebemodelle, die krankheitsrelevante kontraktile Physiologie widerspiegeln.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem Wirkstoffeffekte auf Kontraktionskinetik und Relaxationszeiten in einem menschlichen System detektiert werden.
- Prädiktiver Wert: Generiert quantitative Daten zu T2-Verlängerung und Schlagrhythmusunregelmäßigkeiten, um Zielstrukturen mit verbessertem kardialem Sicherheitsprofil zu priorisieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, sterile 3D-Gewebestrukturen im 24-Well-Format, die mit automatisierten Bildgebungs- und Kontraktionsanalysen-Workflows kompatibel sind.
- Quantitative Ausgabe: Misst die auf Verkürzung basierende Kraft über die Ablenkung von PDMS-Säulen, wodurch die Dosis-Wirkungs-Beurteilung von Substanzen wie E-4031 ermöglicht wird.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Herstellung von mehreren hundert gewebetechnisch hergestellten Herzmuskeln pro Woche, begrenzt lediglich durch die Verfügbarkeit von Kardiomyozyten, und unterstützt Screening-Verfahren mit mittlerer Durchsatzleistung.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verwendung menschlicher Kardiomyozyten zur Modellierung der Kontraktionsdynamik, wodurch die Übertragbarkeit auf die menschliche Herzfunktion verbessert wird.
- Mechanistische Kontinuität: Erfassung von auxotonischen Kontraktionen und Relaxationsparametern, die die elektromechanische Kopplung widerspiegeln, und damit Unterstützung der präklinischen Risikobewertung.
- Entscheidungsunterstützung: Ermöglicht die Reproduktion von arzneimittelinduzierten kontraktilen Veränderungen und unterstützt somit Go/No-Go-Entscheidungen in der Leitstruktur-Optimierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Sicherheitsbewertung ein und liefert eine funktionelle Validierung molekularer Targets im Kontext menschlichen Gewebes.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zu Genvarianten und Arzneimittelwirkungen durch die Messung der kontraktilen Kraft in Echtzeit in humanem Herzmuskelgewebe.
- Screening: Liefert reproduzierbare, automatisierte Kontraktionsmessungen, die die Standardisierung von Assays und das Screening von Substanzen unter kontrollierten Bedingungen unterstützen.
- Analytik: Erzeugt quantifizierbare Parameter wie Kontraktionsamplitude, Schlagfrequenz und T2-Relaxationszeit für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verwendet aus menschlichem Gewebe hergestellte Modelle, um Ergebnisse aus In-vitro-Studien mit klinischen Sicherheitserwartungen zu verknüpfen, insbesondere hinsichtlich von Ionenkanal-Toxizitäten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die kardiale Sicherheitsprüfung, die in mehreren Projekten und bei verschiedenen Wirkstoffklassen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in der kardialen Arzneimittelwirkung verringert werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch automatisierte Bilderkennung und kontrollierte Umgebungsbedingungen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem kardiotoxische Verbindungen frühzeitig identifiziert werden und das Risiko von Ausfällen in späteren Entwicklungsstadien sinkt.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch quantitative Sicherheitssignale, die aus humanen Herzgewebemodellen abgeleitet sind.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herztissue-Engineering, sterilen Zellkultur und im Umgang mit Kardiomyozyten.
- Hängt von einer Bildgebungs-Hardware mit XYZ-Achsen-Steuerung und automatischer Bilderkennungssoftware zur Detektion von Kontraktionen ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Gewebeherstellung, der Exposition gegenüber Wirkstoffen und den Analyseprotokollen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn verschiedene Zellquellen oder genetische Modelle verwendet werden, wobei die Gewebeintegrität und -funktion erhalten bleiben müssen.
- Ist durch die Verfügbarkeit und den Reifegrad der Kardiomyozyten begrenzt, was die kontraktile Leistungsfähigkeit und die Konsistenz des Assays beeinträchtigt.
