Name: Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Erfahren Sie die automatische Kontraktionsanalyse von humanen Engineered Heart Tissues mittels hiPSC-Kardiomyozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Kontraktionskraft für Drug-Safety-Screening und kardiale Forschung.

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Die Autoren danken Alessandra Moretti und Dennis Schade für ihre Art Beitrag des Materials. Wir erkennen die große Unterstützung der iPS und EHT-Arbeitsgruppe am Institut für Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie des UKE. Die Arbeit der Autoren wird durch Zuschüsse aus dem DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 unterstützt / 5-1 ), British National Center für das Ersatz-Refinement &amp; Reduktion von Tieren in der Forschung (NC3Rs CRACK-IT 35.911-259.146 gewähren), die British Heart Foundation RM / 13/30157, der Europäischen Forschungsrat (Advanced Grant IndivuHeart), die deutsche Herzstiftung und die Freie und Hansestadt Hamburg.

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 <a target="_blank" href="http://www.eht-technologies.com">http://www.eht-technologies.com</a> Forthcoming.</li>
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IM, TE und AH sind Mitbegründer der EHT Technologies GmbH, Deutschland.

Ausgeführt Herzgewebe bieten eine wertvolle Option für den Werkzeugkasten der kardiovaskulären Forschung. EHTs in dem 24-Well - Format haben für Krankheit Modellierung 8, 14, Arzneimittelsicherheit Screening 7, 8, 10, 11, 15, oder basisches Cardiovascular Research 16,</sup...

Herznebenwirkungen wie die Arzneimittel-induzierte Long-QT-Syndrom haben Rücknahme aus dem Markt in den letzten Jahren geführt. Statistiken zeigen , dass etwa 45% aller Abhebungen fällig sind , um unerwünschte Auswirkungen auf das Herz - Kreislauf - System 1. Dieses Medikament Versagen nach dem teueren Entwicklungsprozess und die Genehmigung ist das Worst-Case-Szenario für Pharmaunternehmen. Forschungs- und Entwicklungsabteilungen konzentrieren sich daher auf dem Nachweis von solchen unerwünschten kardiovaskulären Wirkungen frühzeitig zu erkennen. Aus wirtschaftlichen und ethischen Bedenken, die Bemühungen um Tierversuche zu reduzieren und ersetzen sie durch neue in - vitro - Screening - Tests sind im Gange. Eine Reihe von etablierten Assays sind in den Vereinigten Staaten Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel - Agentur (EMA) Richtlinien für die präklinische Bewertung von proarrhythmischen Arzneimittelwirkungen 2 enthalten. Die Technologie von somatischen Zellen durch Differenzierung gefolgt Umprogrammierung vonmenschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) verstärkt dieses Forschungsgebiet 3. Es bietet nun die Möglichkeit , neue Medikamentenkandidaten auf dem menschlichen Kardiomyozyten in vitro zu screenen und vermeidet Probleme mit Wechselwirkungen zwischen den Arten Unterschieden. Aktuelle Herzdifferenzierungsprotokolle 4, 5 bieten unbegrenzte Versorgung von Kardiomyozyten ohne ethische Bedenken. Die Messung der Kontraktionskraft ist die wichtigste und am besten charakterisierte jedoch in vivo Parameter von Kardiomyozyten, nicht gut etabliert. Dies hängt mit der relativen Unreife 6 des menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) im Vergleich zu dem erwachsenen Kardiomyozyten. Eine mögliche Weiterentwicklung ist 3-dimensionale Herzgewebe aus einzelnen Zellen zu konstruieren , 7 (engineered Herzgewebe, EHT). Das EHT - Protokoll basiert auf einzelnen murinen oder humanen Kardiomyozyten Einbettung 8 </sup&gt;, 9, 10 in Fibrinhydrogel zwischen zwei flexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS) Pfosten 11 in 24-Well - Format. Innerhalb von wenigen Tagen beginnen die Kardiomyozyten spontan als einzelne Zellen zu kontrahieren und starten Mobilfunknetze zu bilden. Nach 7-10 Tagen sind makroskopische Kontraktionen des gesamten Gewebes sichtbar. Während dieses Prozesses wird die extrazelluläre Matrix umgestaltet, was zu einer Abnahme des Durchmessers und der Länge führt. Die Verkürzung der EHT Ergebnisse in der PDMS Biege Post auch während der Ruhe, Kardiomyozyten in der Entwicklung von EHT zu Dauerbelastung ausgesetzt wird. EHTs weiterhin auxotonisches Muskelkontraktionen über mehrere Wochen durchzuführen. Human EHTs zeigen Reaktionen auf physiologische und pharmakologische Stimulation anzeigt , deren Eignung für Wirkstoff - Screening und Krankheit 7 modellieren. In diesem Manuskript präsentieren wir ein robustes und einfaches Protokoll für die Generatiauf der menschlichen EHT, und die automatisierten Analyse von Kontraktilität konzentrationsabhängigen Veränderungen des Kontraktionsmusters in Gegenwart von hERG Kanalinhibitoren.

<table><tbody><tr><td>EHT Analysegerät</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>A0001</td><td>Software ist im Lieferumfang enthalten</td></tr><tr><td>EHT PDMS Rack</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT PTFE Abstandhalter</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0002</td><td></td></tr><tr><td>EHT Elektrode</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT Stimulationsadapter/Kabel</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0002</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon-Röhrchen, graduiert&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Sarstedt</td><td>831.830</td><td></td></tr><tr><td>Spinnerkolben</td><td>Integra</td><td>182 101</td><td></td></tr><tr><td>Rührer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>70101</td><td>Rotordrehzahl auf 40 U/min</td></tr><tr><td>einstellen T175 Zellkulturflasche</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>831.812.002</td><td></td></tr><tr><td>V-förmiges Sedimentationsgestell&nbsp;</td><td>Sonderanfertigung am UKE Hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>10&mal; DMEM</td><td>Gibco</td><td>52100</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2-Phospho-L-ascorbinsäure-Trinatriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activin-A&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systeme</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-019</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Baxter GmbH</td><td>1428</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS Insulin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase II&nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom</td><td>F0415</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DNase II, Typ V (aus Rindermilz)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab120843</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-921</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen (Rind)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Für die Beschichtung: 1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>HBSS ohne Ca2+/Mg2+&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Lebenstechnologien</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Humanserumalbumin&nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>05-720-1B</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, human</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipidmix&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5146</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Für EHT-Rekonstitutionmix.</td></tr><tr><td>N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid</td><td>TCI</td><td>B3082-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne MgCl2/CaCl2</td><td>Biochrom</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pluronsäure F-127&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>TGF&szlig; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biorbyt</td><td>orb6014</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Custom made at UKE hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>iCell Kardiomyozyten Kit</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>CMC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Pluricyte Kardiomyozyten Kit</td><td>Pluriomics</td><td>PCK-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cor.4U - HiPSC Kardiomyozyten Kit</td><td>Axiogenesis AG</td><td>Ax-C-HC02-FR3</td><td></td></tr><tr><td>Cellartis Kardiomyozyten</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>Nr. Y10075</td><td></td></tr></tbody></table>

automatische kontraktions analyse menschlicher engineered herzgewebe für herz drug safety screening

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac Tissue Engineering beschreibt Techniken dreidimensionale Krafterzeugungs engineered Gewebe zu bilden. Für die Umsetzung dieser Verfahren in der Grundlagenforschung und die präklinische Entwicklung von Medikamenten, ist es wichtig, Protokolle zur automatisierten Generierung und Analyse unter standardisierten Bedingungen zu entwickeln. Hier präsentieren wir eine Technik Engineered Herzgewebe (EHT) von Kardiomyozyten verschiedener Spezies zu erzeugen (Ratte, Maus, Mensch). Die Technik beruht auf der Anordnung eines Fibrin-Gel, das dissoziiert Kardiomyozyten zwischen elastischer Polydimethylsiloxan (PDMS) Einträgen in einem 24-Well-Format. Dreidimensionale, krafterzeugende EHTs bilden innerhalb von zwei Wochen nach dem Gießen. Dieses Verfahren ermöglicht die Erzeugung von mehreren hundert EHTs pro Woche und ist technisch nur durch die Verfügbarkeit von Kardiomyozyten (0,4-1,0 × 10 6 / EHT) begrenzt. Bewertung der auxotonisches Muskelkontraktionen in einem modifizierten Inkubationskammer mit einem mechan durchgeführtische Verriegelung für 24-Well-Platten und eine Kamera auf der Oberseite dieser Kammer angeordnet. Eine Software steuert eine Kamera auf einem XYZ-Achsensystem an jede EHT bewegt. EHT Kontraktionen werden durch eine automatisierte Figur Erkennungsalgorithmus erkannt wird, und wird eine Kraft berechnet, basierend auf Verkürzung der EHT und die elastische Neigung und die Geometrie der PDMS Beiträge. Dieses Verfahren ermöglicht die automatisierte Analyse von hohen Zahl von EHT unter standardisierten und sterilen Bedingungen. Die zuverlässige Erkennung von Arzneimittelwirkungen auf Kardiomyozyten Kontraktion ist von entscheidender Bedeutung für die Herzarzneimittelentwicklung und Sicherheitspharmakologie. Wir zeigen, mit dem Beispiel der hERG Kanalinhibitor E-4031, dass das menschliche EHT System Arzneimittelantworten auf der Kontraktion Kinetik des menschlichen Herzens nachbildet, angibt, dass es ein vielversprechendes Werkzeug für die kardialen Arzneimittelsicherheit Screening sein.

Herzdifferenzierung und Herstellung von EHT HiPSC wurde auf reduziertem Wachstumsfaktor Basalmembranmatrix erweitert, dissoziiert mit EDTA und embryoid bodies (EBs) über Nacht in Spinnerflaschen gebildet. Nach mesodermalen Induktion für drei Tage wurde kardiale Differenzierung mit dem Wnt-Inhibitor ausgelöst. Nach ~ 17 Tagen Differenzierung Protokoll wurde schlagen EBs in einzelne Zellen dissoziiert mit Kollagenase Typ II <strong...

Hier zeigen wir die Herstellung von humanen konstruierte Herzgewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten. Wir stellen eine Methode Kontraktionskraft und beispielhafte Veränderung der Kontraktionsmuster durch den hERG-Kanal-Hemmer E-4031 zu analysieren. Dieses Verfahren zeigt hohe Robustheit und die Eignung für das Herz Wirkstoff-Screening.

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, dreidimensionales, gewebetechnisch hergestelltes Herzgewebe zu erzeugen, das als Plattform für die Analyse der Kontraktion in vitro zur Arzneimittelscreening und Krankheitsmodellierung verwendet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardialen Bereich bezüglich der Krankheitsmodellierung, der Sicherheitspharmakologie sowie der Auswirkungen von Genvarianten oder Arzneimitteln auf die kontraktile Kraft zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die kontraktile Kraft in gewebetechnisch hergestelltem Herzgewebe aus verschiedenen Spezies unter sterilen Bedingungen über längere Zeiträume hinweg gemessen werden kann.Wissenschaftler, die mit dieser Methode neu sind, könnten Schwierigkeiten mit der Zellqualität haben oder mit einem Mangel an Bestandteilen im Medium. Es ist wichtig, die eigene Vorbereitung zu optimieren und Zyklen zu vermeiden. Diese Prozedur demonstrieren Anika Benzin und Umber Saleem.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, geben Sie 1,6 Milliliter warmes zweiprozentiges Agarose in die Hilfsgele der Vertiefungen einer 24-Loch-Platte. Und platzieren Sie sofort Polytetrafluoroethylen-Abstandshalter in das Agarose. Nach etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur wird das Agarose trüb, was auf seine Verfestigung hinweist.Entfernen Sie die Abstandshalter und platzieren Sie die PDMS-Racks in die Formen, sodass Paare von Rack-Stiften in jede Agaroseform hineinragen. Sobald alle Racks platziert sind, suspendieren wir die Kardiomyozyten in Medium mit einer Mindestkonzentration von 1,5 × 10⁷ Zellen pro Milliliter und dem frisch zubereiteten Rekonstitutionsgemisch mit Fibrinogen 10 bis 15 Mal mit der serologischen Pipette, bis das Fibrinogen-Gerinnungspräparat vollständig aufgelöst ist. Überprüfen Sie das Rekonstitutionsgemisch in der Pipette auf Homogenität.Anschießend für jedes hergestellte Herzgewebe, oder EHT, 100 Mikroliter Rekonstitutionslösung mit drei Mikrolitern Thrombin in einem 200-Mikroliter-Röhrchen mischen. Unmittelbar danach 100 Mikroliter dieser EHT-Thrombin-Mischung in die Agarose-Nischen aliquotieren. Für jedes EHT eine neue Filterkappe verwenden.Nachdem alle Vertiefungen mit Rekonstitutionslösung gefüllt wurden, schließen Sie den Deckel der Zellkulturschale und inkubieren Sie die Ansätze zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und sieben Prozent Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation stellen Sie die Platte in eine sterile Werkbank und überdecken jedes Loch mit 200 bis 500 Mikrolitern Medium. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und bringen Sie die EHTs zurück in den Inkubator.Nach 10 Minuten die Gestelle vorsichtig in eine neue 24-Well-Platte überführen, die pro Mulde 1,5 Milliliter EHT-Medium enthält, und die Platte unter den geeigneten Kulturbedingungen in einen Zellkulturinkubator stellen. Die EHTs jeden Montag, Mittwoch und Freitag füttern, indem die PDMS-Gestelle in eine zweite Platte mit frischem Medium übertragen werden. Sieben bis 10 Tage nach dem Gießen sollten die EHTs spontane Kontraktionen aufweisen, die die Pfosten der PDMS-Gestelle ablenken.Um die Kontraktionen des EHT zu analysieren, schalten Sie am Tag des Experiments die Heizvorrichtung im EHT-Analysesystem zwei Stunden vor der Messung ein. Unmittelbar vor der Analyse schalten Sie die Gas- und elektronischen Versorgung des Achssystems ein. Für eine Basislinienaufzeichnung platzieren Sie die EHT-Platte in das EHT-Analysesystem und starten die Software zur Kontraktionsanalyse gemäß den Herstelleranweisungen.Befolgen Sie die Anweisungen im Softwarehandbuch, um einen neuen Durchlauf zu starten, und klicken Sie auf den Protokoll-Tab, um die relevanten Studieninformationen einzugeben. Öffnen Sie den Setup-Tab und wählen Sie die Vertiefungen für die Analyse aus. Aufgrund von Zeitbeschränkungen wird dies in diesem Video nur für zwei EHTs demonstriert.Klicken Sie dann auf die Kameraansicht-Registerkarte und starten Sie den Kameramodus in Echtzeit mit automatischer Objekterkennung. Passen Sie die Kameraposition mit den xyz-Koordinaten für jede ausgewählte Vertiefung in der 24-Loch-Platte an, wobei darauf zu achten ist, dass sich jedes EHT in der Mitte des Fensters befindet und scharfgestellt ist. Stellen Sie sicher, dass sich die blauen Kreuze an den oberen und unteren Enden der EHTs befinden und sich bewegen, um den Kontraktionen der EHTs zu folgen.Drücken Sie die Taste „Position bestätigen“, um die festgelegten Positionen für jede Vertiefung zu speichern. Klicken Sie nun auf den Reiter „Parameter“, um die Kriterien festzulegen, nach denen die Software einen Kontraktionspeak identifiziert, wobei die Peaks mit grünen Quadraten markiert werden. Speichern Sie alle eingegebenen Einstellungen, indem Sie die Schaltfläche „Parameter auf alle Vertiefungen anwenden“ betätigen.Klicken Sie dann auf den Reiter „automatisch“ und auf die Schaltfläche „Start“, um die Grundlinien-Kontraktionen des EHT aufzuzeichnen und die spontane Grundlinien-Kontraktilität für jeden EHT zu berechnen. Die Echtzeit-Analyse der Kontraktionen wird im Reiter „Echtzeit“ angezeigt. Stellen Sie sicher, dass sich die blauen Kreuze nur vertikal bewegen, um den Kontraktionen des EHTs zu folgen.Um die Wirkungen eines bestimmten Wirkstoffs auf die Kontraktionen zu analysieren, überführen Sie zunächst eine mit proteinfreier Thyreoidlösung gefüllte 24-Loch-Platte unter sterilen Bedingungen in einen sterilen Abzug und platzieren Sie Kohlenstoffelektroden in die Löcher. Überführen Sie die EHTs in ihren PDMS-Halterungen auf die Elektroden und bringen Sie die EHTs anschließend zurück in den Inkubator. Nach etwa einer halben Stunde platzieren Sie die EHTs in die Verriegelungseinheit des EHT-Analysesystems und nehmen Sie die spontane Grundkontraktionsfähigkeit jeweils 20 Sekunden pro EHT auf.Als Nächstes verbinden Sie die Karbonelektroden mit dem Stimulationskabel und beginnen Sie, die EHTs elektrisch zu stimulieren. Registrieren Sie die stimulationsgesteuerte Grundlinie für 10 Sekunden pro EHT, wobei darauf zu achten ist, dass alle EHTs korrekt stimuliert werden. Das Stimulationsignal wird nun durch blaue vertikale Linien markiert, die in der Kontraktionskurve vor jedem Peak eingefügt sind.Nach der Basislinienaufnahme überführen Sie die Elektroden und die PDMS-Gestelle in eine neue 24-Well-Platte, die die erste Wirkstoffkonzentration enthält, und bringen die EHTs unverzüglich in die Verriegelung des EHT-Analysesystems zurück, um eine 20-minütige Inkubation durchzuführen. Schließen Sie die Stimulationskabel erneut an, justieren Sie die Figurenerkennung und nehmen Sie die Kontraktionen der EHTs als Reaktion auf die erste Wirkstoffkonzentration auf. Nachdem alle Wirkstoffkonzentrationen getestet wurden, speichern Sie alle resultierenden PDF-Aufzeichnungen und überprüfen Sie jede Aufzeichnung hinsichtlich der Figurenerkennung sowie der korrekten Positionierung der Kontraktionspeak-Quadrate und Artefakte.Klicken Sie zur Offline-Analyse im Laufdatenbank die Option „Lauf auswählen“ für den jeweiligen Lauf und wechseln Sie im Parameter-Tab den Parameter für die Kontraktionsanalyse. Wählen Sie anschließend im Offline-Tab die Offline-Analyse, um die Videos erneut zu analysieren. Um die Objekterkennung anzupassen und eine neue Videodatei aufzuzeichnen.Passen Sie die Erkennung der Form im Reiter Echtzeit an und wählen Sie die Beispielüberprüfung aus. Das EHT wird nun entsprechend der neuen Positionen analysiert. Die Analyse jedes EHT basiert auf der Formerkennung an den oberen und unteren Enden des Gewebes.Die aufgezeichneten EHT-Kontraktionen werden anschließend automatisch durch den Softwarealgorithmus des EHT-Analysesystems ausgewertet, wobei die Peaks gemäß den entsprechenden vordefinierten Kriterien bestimmt werden. Die Langzeitmessung der EHT-Kontraktionsanalyse zeigt, dass innerhalb von bis zu 20 Stunden keine offensichtlichen zeitabhängigen Veränderungen in der Kontraktionskraft, Schlagfrequenz oder den Zeiten T1 (Kontraktion) bzw. T2 (Relaxation) auftreten. Dies weist auf ein hohes Maß an Stabilität der Konstrukte hin.Tatsächlich sind die Ergebnisse für jedes Signal EHT mit einer geringen Variabilität reproduzierbar. Eine Exposition gegenüber einem hERG-Kanalblocker führt hingegen zu einer signifikanten Verlängerung der T2-Relaxationszeit, beginnend bei der Konzentration, sowie zu einem unregelmäßigen Schlagmuster bei höheren Konzentrationen.Wenn die Methode einmal beherrscht ist, können 24 EHTs innerhalb von 30 Minuten erzeugt werden, sofern die Vorbereitung ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet des Krankheitsmodellierens den Weg, um die Wirkung von Genvarianten in vitro zu untersuchen. Die Vielseitigkeit dieses Modells ermöglicht es, es mit humanen induzierten Stammzellen oder der Genom-Editierungstechnologie zu kombinieren.Nach Durchführung dieses Verfahrens können zusätzliche Methoden wie Histologie oder RNA- und Proteinanalysen verwendet werden, um weitere Fragen zur Gen-Transkription und -Expression zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man EHTs herstellt und analysiert. Falls Sie Fragen zu diesem Verfahren haben, zögern Sie nicht und kontaktieren Sie uns direkt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Spontan contracting Syncytia von Kardiomyozyten abgeleitet von Human-induzierte pluripotente sind Stammzellen nützliche Modelle der menschlichen Herz Physiologie und Pharmakologie. Hier präsentieren wir ein Hochdurchsatz-Screening-System zur Quantifizierung der Auswirkungen von exogenen Verbindungen auf Frequenz zu schlagen, mit einem Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und temperaturgeführte imaging Multi-well-Platte Leser.

Kontraktionen der iPSC abgeleitete Cardiomyocyte Syncytia gemessen mit einem Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff in temperaturgesteuerten 384-Well-Platten

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als vielversprechendes In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der Kontraktilität und Elektrophysiologie von hiPSC-CMs.

Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Die Analyse von Veränderungen der kontraktilen Funktion und der zellulären Integrität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist von immenser Bedeutung für die nicht-klinische Arzneimittelentwicklung. Ein hybrides 96-Well-Zellanalysesystem adressiert beide Parameter in Echtzeit und physiologisch für zuverlässige, für den Menschen relevante Ergebnisse, die für einen sicheren Übergang in klinische Stadien erforderlich sind.

Hybridzell-Analysesystem zur Beurteilung struktureller und kontraktiler Veränderungen von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für die präklinische kardiale Risikobewertung

Dreidimensionale Herzgewebe, die mit aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten biotechnologisch hergestellt wurden, haben sich als vielversprechende Modelle für die Untersuchung von gesundem und krankem menschlichem Myokard in vitro erwiesen und gleichzeitig Schlüsselaspekte der nativen Herznische rekapituliert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Analyse von High-Content-Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden.

Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kontraktilität in adulten humanen primären Kardiomyozyten aus Spenderherzen mit dem MyoBLAZER-System gemessen werden kann, einer zuverlässigen Plattform zur Beurteilung arzneimittelinduzierter Veränderungen der Kontraktilität während der präklinischen Entwicklung.

Messung der Herzkontraktilität in isolierten adulten humanen primären Kardiomyozyten

Dieses Protokoll stellt Methoden zur Erzeugung von 3D-konstruiertem Herz- und Skelettmuskelgewebe bereit und beschreibt deren Verwendung in präklinischen Arzneimittel-Screening-Modalitäten. Die beschriebenen Methoden verwenden ein magnetisches Sensorsystem, um die gleichzeitige Beurteilung von 24 Geweben parallel zu ermöglichen.

Präklinische Arzneimitteltests in skalierbaren 3D-Muskelgeweben

Hier demonstrieren wir eine nicht-invasive Methode zur Bewertung der Kontraktilität von Herzmedizinprodukten unter Verwendung von 2D-Monoschichten aus humanen pluripotenten Stammzellen (hiPSC-CM), die auf einem flexiblen Substrat plattiert und mit videobasierter Mikroskopie gekoppelt sind. Dieses Tool wird für die In-vitro-Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von kardialen Elektrophysiologiegeräten nützlich sein.

Evaluierung der kardialen Kontraktilitätsmodulationstherapie in 2D-Kardiomyozyten aus humanen Stammzellen

Es wird eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von 3D-Myokardgeweben vorgestellt, bei der MEW-Gerüste (Melt Electrospinning Writing), Polycaprolacton (PCL)-Gerüste und Fibrin-Hydrogele mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und Fibroblasten kombiniert werden. Diese Technik bietet eine präzise Kontrolle über die Gerüstarchitektur und kann in präklinischen Arzneimitteltests und bei der Modellierung von Herzerkrankungen eingesetzt werden.

3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Erfahren Sie die automatische Kontraktionsanalyse von humanen Engineered Heart Tissues mittels hiPSC-Kardiomyozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Kontraktionskraft für Drug-Safety-Screening und kardiale Forschung.

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