Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, dreidimensional manipuliertes Herzgewebe zu erzeugen, das als In-vitro-Kontraktionsanalyseplattform für das Wirkstoffscreening und die Modellierung von Krankheiten verwendet werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im kardiologischen Bereich zur Krankheitsmodellierung, zur Sicherheitspharmakologie und zu den Auswirkungen von Genvarianten oder Medikamenten auf die kontraktile Kraft zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Kontraktionskraft in künstlich hergestellten Herzgeweben verschiedener Spezies unter sterilen Bedingungen über längere Zeiträume gemessen werden kann.

Wissenschaftler, die neu in dieser Methode sind, könnten mit einem Mangel an zellulärer Qualität zu kämpfen haben. Oder das Fehlen eines Mediums. Es ist wichtig, die Selbstvorbereitung zu optimieren und Zyklen des Verfahrens zu vermeiden. Dieses Verfahren wird von Anika Benzin und Umber Saleem demonstriert.

Geben Sie vor Beginn des Eingriffs 1,6 Milliliter warme zweiprozentige Agarose in die Erste-Hilfe-Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Und geben Sie sofort Polytetrafluorethylen in Abstandshaltern in die Agarose. Nach etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur wird die Agarose undurchsichtig, was auf ihre Verfestigung hinweist.

Entfernen Sie die Abstandshalter und setzen Sie PDMS-Zahnstangen in die Gussteile ein, so dass ein Paar Zahnstangenpfosten in jede Agaroseform hineinragen. Wenn alle Gestelle platziert sind, suspendieren wir die Kardiomyozyten in Medium in einer Mindestkonzentration von 1,5 mal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter und mischen mit der serologischen Pipette 10 bis 15 Mal frisch zubereitete Rekonstitutionsmischungen mit Fibrinogen, bis das Fibrinogengerinnsel aufgelöst ist. Überprüfen Sie die Rekonstitutionsmischung in der Pipette auf Homogenität.

Mischen Sie dann für jedes manipulierte Herzgewebe (EHT) 100 Mikroliter Rekonstitutionsmischung mit drei Mikrolitern Thrombin in einem 200-Mikroliter-Röhrchen. Und sofort aliquotieren Sie 100 Mikroliter dieses EHT-Thrombin-Gemisches in die Agaroseschlitze. Verwenden Sie für jedes EHT eine neue Filterspitze.

Wenn alle Schlitze mit Rekonstitutionsmischung gefüllt sind, schließen Sie den Deckel der Zellkulturschale und inkubieren Sie die Präparate zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und sieben Prozent Kohlendioxid. Legen Sie die Platte am Ende der Inkubation in eine sterile Haube und bedecken Sie jede Vertiefung mit 200 bis 500 Mikrolitern Medium. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und stellen Sie die EHTs wieder in den Inkubator.

Nach 10 Minuten werden die Racks vorsichtig in eine neue 24-Well-Platte mit 1,5 Millilitern EHT-Medium pro Well umgefüllt und die Platte unter den entsprechenden Kulturbedingungen in einen Zellkultur-Inkubator gestellt. Beschickung der EHTs jeden Montag, Mittwoch und Freitag, indem die PDMS-Racks auf eine zweite Platte mit frischem Medium umgefüllt werden. Sieben bis 10 Tage nach dem Gießen sollten die EHTs spontane Kontraktionen aufweisen, die die Pfosten der PDMS-Racks ablenken.

Um die Kontraktionen des EHT zu analysieren, schalten Sie am Tag des Experiments das Heizgerät im EHT-Analysegerät zwei Stunden vor der Messung ein. Schalten Sie unmittelbar vor der Analyse die Gas- und Elektronikversorgung des Achssystems ein. Für eine Baseline-Aufzeichnung setzen Sie die EHT-Platte in das EHT-Analysegerät ein und starten Sie die Kontraktionsanalyse-Software gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Verwenden Sie die Anweisungen des Softwarehandbuchs, um einen neuen Lauf zu starten, und klicken Sie auf die Registerkarte Protokoll, um die relevanten Studieninformationen einzugeben. Öffnen Sie die Registerkarte "Setup" und wählen Sie die Wells für die Analyse aus. Aus Zeitgründen wird dies in diesem Video nur für zwei EHTs demonstriert.

Klicken Sie dann auf die Registerkarte Kameraansicht und starten Sie den Kamera-Live-Modus mit dem Modus zur automatischen Figurenerkennung. Passen Sie die Kameraposition mit den xyz-Koordinaten für jedes ausgewählte Well in der 24-Well-Schüssel an und achten Sie darauf, dass sich jedes EHT in der Mitte des Fensters und im Fokus befindet. Stellen Sie sicher, dass sich die blauen Kreuze am oberen und unteren Ende der EHTs befinden und sich entsprechend den Kontraktionen der EHTs bewegen.

Drücken Sie die Positions-OK-Taste, um die eingestellten Positionen der einzelnen Vertiefungen zu speichern. Klicken Sie nun auf die Registerkarte Parameter, um die Kriterien zu definieren, anhand derer die Software einen Kontraktionspeak identifiziert, und markieren Sie die Peaks mit grünen Quadraten. Speichern Sie alle eingegebenen Einstellungen, indem Sie auf die Schaltfläche Parameter in allen Vertiefungen verwenden drücken.

Klicken Sie dann auf die Registerkarte "Automatisch" und die Schaltfläche "Start", um die EHT-Basiskontraktionen aufzuzeichnen und die spontane Basiskontraktilität für jedes EHT zu berechnen. Die Live-Kontraktionsanalyse wird auf der Registerkarte Echtzeit angezeigt. Achten Sie darauf, dass sich die blauen Kreuze nur vertikal bewegen, um den Kontraktionen der EHTs zu entsprechen.

Um die Auswirkungen eines bestimmten Medikaments von Interesse auf die Kontraktionen zu analysieren, überführen Sie zunächst eine mit proteinfreier Schilddrüsenlösung gefüllte 24-Well-Platte unter eine sterile Haube und platzieren Sie Kohlenstoffelektroden in den Wells. Übertragen Sie die EHTs in ihren PDMS-Racks auf die Elektroden und bringen Sie die EHTs in den Inkubator zurück. Platzieren Sie die EHTs nach etwa einer halben Stunde in der Verriegelung des EHT-Analyseinstruments und zeichnen Sie die spontane Basiskontraktilität für 20 Sekunden pro EHT auf.

Verbinden Sie als Nächstes die Kohlenstoffelektroden mit dem Stimulationskabel und beginnen Sie, die EHTs elektrisch zu stimulieren. Zeichnen Sie die taktliche Grundlinie 10 Sekunden lang pro EHT auf und achten Sie darauf, dass alle EHTs richtig abgestimmt sind. Das Stimulationssignal wird nun durch blaue vertikale Linien markiert, die vor jedem Peak in das Kontraktionstransplantat einbezogen sind.

Übertragen Sie nach der Baseline-Aufzeichnung die Elektroden und die PDMS-Racks auf eine neue 24-Well-Platte, die die erste Wirkstoffkonzentration enthält, und legen Sie die EHTs sofort für eine 20-minütige Inkubation in die Verriegelung des EHT-Analysegeräts zurück. Schließen Sie die Stimulationskabel wieder an, stellen Sie die Figurerkennung ein und zeichnen Sie die EHT-Kontraktionen als Reaktion auf die erste Wirkstoffkonzentration auf. Nachdem alle Wirkstoffkonzentrationen getestet wurden, speichern Sie alle resultierenden PDF-Aufzeichnungen und überprüfen Sie jede Aufzeichnung auf Figurenerkennung und die korrekte Positionierung der Quadrate und Artefakte der Kontraktionspeaks.

Für die Offline-Analyse klicken Sie in der Ausführungsdatenbank auf Ausführung für den entsprechenden Lauf auswählen und ändern Sie auf der Registerkarte Parameter den Parameter für die Kontraktionsanalyse. Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Offline" die Option "Offline-Analyse" aus, um die Videos erneut zu analysieren. Zum Anpassen der Figurenerkennung und zum Aufnehmen einer neuen Videodatei.

Passen Sie die Figurerkennung im Echtzeit-Tab an und wählen Sie Stichprobenüberprüfung aus. Das EHT wird nun entsprechend der neuen Positionen analysiert. Die Analyse jedes EHT basiert auf der Figurerkennung am oberen und unteren Ende des Gewebes.

Die gefilmten EHT-Kontraktionen werden dann automatisch durch den Softwarealgorithmus des EHT-Analyseinstruments analysiert und die Peaks nach den relevanten vordefinierten Kriterien bestimmt. Die Langzeitmessung der EHT-Kontraktionsanalyse zeigt, dass es keine offensichtlichen zeitabhängigen Änderungen der Kontraktionskraft, der Schwebungsfrequenz, der T1-Kontraktion oder der T2-Relaxationszeiten für bis zu 20 Stunden gibt. Dies deutet auf eine hohe Stabilität der Konstrukte hin.

In der Tat sind die Ergebnisse für jedes EHT-Signal mit einer geringen Variabilität reproduzierbar. Die Exposition gegenüber einem hERG-Kanalblocker führt jedoch zu einer signifikanten Verlängerung der T2-Relaxationszeit, beginnend bei der Konzentration. Und ein unregelmäßiges Schwebmuster bei höheren Konzentrationen.

Einmal gemeistert, können innerhalb von 30 Minuten 24 EHTs generiert werden, wenn die Vorbereitung richtig durchgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krankheitsmodellierung, um die Wirkung von Genvarianten in vitro zu untersuchen. Die Vielseitigkeit dieses Modells ermöglicht die Kombination mit humanen induzierten Stammzellen oder der Genome-Editing-Technologie.

Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden wie Histologie oder RNA- und Proteinanalytik verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur Gentranskription und -expression zu beantworten. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie EHTs casten und analysieren können. Wenn Sie Fragen zu diesem Verfahren haben, zögern Sie bitte nicht und wenden Sie sich direkt an uns.