Name: Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Erfahren Sie die automatische Kontraktionsanalyse von humanen Engineered Heart Tissues mittels hiPSC-Kardiomyozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Kontraktionskraft für Drug-Safety-Screening und kardiale Forschung.

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Die Autoren danken Alessandra Moretti und Dennis Schade für ihre Art Beitrag des Materials. Wir erkennen die große Unterstützung der iPS und EHT-Arbeitsgruppe am Institut für Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie des UKE. Die Arbeit der Autoren wird durch Zuschüsse aus dem DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 unterstützt / 5-1 ), British National Center für das Ersatz-Refinement &amp; Reduktion von Tieren in der Forschung (NC3Rs CRACK-IT 35.911-259.146 gewähren), die British Heart Foundation RM / 13/30157, der Europäischen Forschungsrat (Advanced Grant IndivuHeart), die deutsche Herzstiftung und die Freie und Hansestadt Hamburg.

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 <a target="_blank" href="http://www.eht-technologies.com">http://www.eht-technologies.com</a> Forthcoming.</li>
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IM, TE und AH sind Mitbegründer der EHT Technologies GmbH, Deutschland.

Ausgeführt Herzgewebe bieten eine wertvolle Option für den Werkzeugkasten der kardiovaskulären Forschung. EHTs in dem 24-Well - Format haben für Krankheit Modellierung 8, 14, Arzneimittelsicherheit Screening 7, 8, 10, 11, 15, oder basisches Cardiovascular Research 16,</sup...

Herznebenwirkungen wie die Arzneimittel-induzierte Long-QT-Syndrom haben Rücknahme aus dem Markt in den letzten Jahren geführt. Statistiken zeigen , dass etwa 45% aller Abhebungen fällig sind , um unerwünschte Auswirkungen auf das Herz - Kreislauf - System 1. Dieses Medikament Versagen nach dem teueren Entwicklungsprozess und die Genehmigung ist das Worst-Case-Szenario für Pharmaunternehmen. Forschungs- und Entwicklungsabteilungen konzentrieren sich daher auf dem Nachweis von solchen unerwünschten kardiovaskulären Wirkungen frühzeitig zu erkennen. Aus wirtschaftlichen und ethischen Bedenken, die Bemühungen um Tierversuche zu reduzieren und ersetzen sie durch neue in - vitro - Screening - Tests sind im Gange. Eine Reihe von etablierten Assays sind in den Vereinigten Staaten Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel - Agentur (EMA) Richtlinien für die präklinische Bewertung von proarrhythmischen Arzneimittelwirkungen 2 enthalten. Die Technologie von somatischen Zellen durch Differenzierung gefolgt Umprogrammierung vonmenschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) verstärkt dieses Forschungsgebiet 3. Es bietet nun die Möglichkeit , neue Medikamentenkandidaten auf dem menschlichen Kardiomyozyten in vitro zu screenen und vermeidet Probleme mit Wechselwirkungen zwischen den Arten Unterschieden. Aktuelle Herzdifferenzierungsprotokolle 4, 5 bieten unbegrenzte Versorgung von Kardiomyozyten ohne ethische Bedenken. Die Messung der Kontraktionskraft ist die wichtigste und am besten charakterisierte jedoch in vivo Parameter von Kardiomyozyten, nicht gut etabliert. Dies hängt mit der relativen Unreife 6 des menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen (hiPSC-CM) im Vergleich zu dem erwachsenen Kardiomyozyten. Eine mögliche Weiterentwicklung ist 3-dimensionale Herzgewebe aus einzelnen Zellen zu konstruieren , 7 (engineered Herzgewebe, EHT). Das EHT - Protokoll basiert auf einzelnen murinen oder humanen Kardiomyozyten Einbettung 8 </sup&gt;, 9, 10 in Fibrinhydrogel zwischen zwei flexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS) Pfosten 11 in 24-Well - Format. Innerhalb von wenigen Tagen beginnen die Kardiomyozyten spontan als einzelne Zellen zu kontrahieren und starten Mobilfunknetze zu bilden. Nach 7-10 Tagen sind makroskopische Kontraktionen des gesamten Gewebes sichtbar. Während dieses Prozesses wird die extrazelluläre Matrix umgestaltet, was zu einer Abnahme des Durchmessers und der Länge führt. Die Verkürzung der EHT Ergebnisse in der PDMS Biege Post auch während der Ruhe, Kardiomyozyten in der Entwicklung von EHT zu Dauerbelastung ausgesetzt wird. EHTs weiterhin auxotonisches Muskelkontraktionen über mehrere Wochen durchzuführen. Human EHTs zeigen Reaktionen auf physiologische und pharmakologische Stimulation anzeigt , deren Eignung für Wirkstoff - Screening und Krankheit 7 modellieren. In diesem Manuskript präsentieren wir ein robustes und einfaches Protokoll für die Generatiauf der menschlichen EHT, und die automatisierten Analyse von Kontraktilität konzentrationsabhängigen Veränderungen des Kontraktionsmusters in Gegenwart von hERG Kanalinhibitoren.

<table><tbody><tr><td>EHT Analysegerät</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>A0001</td><td>Software ist im Lieferumfang enthalten</td></tr><tr><td>EHT PDMS Rack</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT PTFE Abstandhalter</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0002</td><td></td></tr><tr><td>EHT Elektrode</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT Stimulationsadapter/Kabel</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0002</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon-Röhrchen, graduiert&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Sarstedt</td><td>831.830</td><td></td></tr><tr><td>Spinnerkolben</td><td>Integra</td><td>182 101</td><td></td></tr><tr><td>Rührer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>70101</td><td>Rotordrehzahl auf 40 U/min</td></tr><tr><td>einstellen T175 Zellkulturflasche</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>831.812.002</td><td></td></tr><tr><td>V-förmiges Sedimentationsgestell&nbsp;</td><td>Sonderanfertigung am UKE Hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>10&mal; DMEM</td><td>Gibco</td><td>52100</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2-Phospho-L-ascorbinsäure-Trinatriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activin-A&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systeme</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-019</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Baxter GmbH</td><td>1428</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS Insulin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase II&nbsp;</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom</td><td>F0415</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DNase II, Typ V (aus Rindermilz)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab120843</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-921</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen (Rind)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Für die Beschichtung: 1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>HBSS ohne Ca2+/Mg2+&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Lebenstechnologien</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Humanserumalbumin&nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>05-720-1B</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, human</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipidmix&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5146</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Für EHT-Rekonstitutionmix.</td></tr><tr><td>N-Benzyl-p-Toluolsulfonamid</td><td>TCI</td><td>B3082-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne MgCl2/CaCl2</td><td>Biochrom</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pluronsäure F-127&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>TGF&szlig; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biorbyt</td><td>orb6014</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Custom made at UKE hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>iCell Kardiomyozyten Kit</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>CMC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Pluricyte Kardiomyozyten Kit</td><td>Pluriomics</td><td>PCK-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cor.4U - HiPSC Kardiomyozyten Kit</td><td>Axiogenesis AG</td><td>Ax-C-HC02-FR3</td><td></td></tr><tr><td>Cellartis Kardiomyozyten</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>Nr. Y10075</td><td></td></tr></tbody></table>

automatische kontraktions analyse menschlicher engineered herzgewebe für herz drug safety screening

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac Tissue Engineering beschreibt Techniken dreidimensionale Krafterzeugungs engineered Gewebe zu bilden. Für die Umsetzung dieser Verfahren in der Grundlagenforschung und die präklinische Entwicklung von Medikamenten, ist es wichtig, Protokolle zur automatisierten Generierung und Analyse unter standardisierten Bedingungen zu entwickeln. Hier präsentieren wir eine Technik Engineered Herzgewebe (EHT) von Kardiomyozyten verschiedener Spezies zu erzeugen (Ratte, Maus, Mensch). Die Technik beruht auf der Anordnung eines Fibrin-Gel, das dissoziiert Kardiomyozyten zwischen elastischer Polydimethylsiloxan (PDMS) Einträgen in einem 24-Well-Format. Dreidimensionale, krafterzeugende EHTs bilden innerhalb von zwei Wochen nach dem Gießen. Dieses Verfahren ermöglicht die Erzeugung von mehreren hundert EHTs pro Woche und ist technisch nur durch die Verfügbarkeit von Kardiomyozyten (0,4-1,0 × 10 6 / EHT) begrenzt. Bewertung der auxotonisches Muskelkontraktionen in einem modifizierten Inkubationskammer mit einem mechan durchgeführtische Verriegelung für 24-Well-Platten und eine Kamera auf der Oberseite dieser Kammer angeordnet. Eine Software steuert eine Kamera auf einem XYZ-Achsensystem an jede EHT bewegt. EHT Kontraktionen werden durch eine automatisierte Figur Erkennungsalgorithmus erkannt wird, und wird eine Kraft berechnet, basierend auf Verkürzung der EHT und die elastische Neigung und die Geometrie der PDMS Beiträge. Dieses Verfahren ermöglicht die automatisierte Analyse von hohen Zahl von EHT unter standardisierten und sterilen Bedingungen. Die zuverlässige Erkennung von Arzneimittelwirkungen auf Kardiomyozyten Kontraktion ist von entscheidender Bedeutung für die Herzarzneimittelentwicklung und Sicherheitspharmakologie. Wir zeigen, mit dem Beispiel der hERG Kanalinhibitor E-4031, dass das menschliche EHT System Arzneimittelantworten auf der Kontraktion Kinetik des menschlichen Herzens nachbildet, angibt, dass es ein vielversprechendes Werkzeug für die kardialen Arzneimittelsicherheit Screening sein.

Herzdifferenzierung und Herstellung von EHT HiPSC wurde auf reduziertem Wachstumsfaktor Basalmembranmatrix erweitert, dissoziiert mit EDTA und embryoid bodies (EBs) über Nacht in Spinnerflaschen gebildet. Nach mesodermalen Induktion für drei Tage wurde kardiale Differenzierung mit dem Wnt-Inhibitor ausgelöst. Nach ~ 17 Tagen Differenzierung Protokoll wurde schlagen EBs in einzelne Zellen dissoziiert mit Kollagenase Typ II <strong...

Hier zeigen wir die Herstellung von humanen konstruierte Herzgewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitetes Kardiomyozyten. Wir stellen eine Methode Kontraktionskraft und beispielhafte Veränderung der Kontraktionsmuster durch den hERG-Kanal-Hemmer E-4031 zu analysieren. Dieses Verfahren zeigt hohe Robustheit und die Eignung für das Herz Wirkstoff-Screening.

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, dreidimensionales, gewebetechnisch hergestelltes Herzgewebe zu erzeugen, das als Plattform für die Analyse der Kontraktion in vitro zur Arzneimittelscreening und Krankheitsmodellierung verwendet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardialen Bereich bezüglich der Krankheitsmodellierung, der Sicherheitspharmakologie sowie der Auswirkungen von Genvarianten oder Arzneimitteln auf die kontraktile Kraft zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die kontraktile Kraft in gewebetechnisch hergestelltem Herzgewebe aus verschiedenen Spezies unter sterilen Bedingungen über längere Zeiträume hinweg gemessen werden kann.Wissenschaftler, die mit dieser Methode neu sind, könnten Schwierigkeiten mit der Zellqualität haben oder mit einem Mangel an Bestandteilen im Medium. Es ist wichtig, die eigene Vorbereitung zu optimieren und Zyklen zu vermeiden. Diese Prozedur demonstrieren Anika Benzin und Umber Saleem.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, geben Sie 1,6 Milliliter warmes zweiprozentiges Agarose in die Hilfsgele der Vertiefungen einer 24-Loch-Platte. Und platzieren Sie sofort Polytetrafluoroethylen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Spontan contracting Syncytia von Kardiomyozyten abgeleitet von Human-induzierte pluripotente sind Stammzellen nützliche Modelle der menschlichen Herz Physiologie und Pharmakologie. Hier präsentieren wir ein Hochdurchsatz-Screening-System zur Quantifizierung der Auswirkungen von exogenen Verbindungen auf Frequenz zu schlagen, mit einem Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff und temperaturgeführte imaging Multi-well-Platte Leser.

Kontraktionen der iPSC abgeleitete Cardiomyocyte Syncytia gemessen mit einem Ca-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff in temperaturgesteuerten 384-Well-Platten

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) haben sich als vielversprechendes In-vitro-Modell für das medikamenteninduzierte Kardiotoxizitätsscreening und die Krankheitsmodellierung herausgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der Kontraktilität und Elektrophysiologie von hiPSC-CMs.

Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Die Analyse von Veränderungen der kontraktilen Funktion und der zellulären Integrität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten ist von immenser Bedeutung für die nicht-klinische Arzneimittelentwicklung. Ein hybrides 96-Well-Zellanalysesystem adressiert beide Parameter in Echtzeit und physiologisch für zuverlässige, für den Menschen relevante Ergebnisse, die für einen sicheren Übergang in klinische Stadien erforderlich sind.

Hybridzell-Analysesystem zur Beurteilung struktureller und kontraktiler Veränderungen von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für die präklinische kardiale Risikobewertung

Dreidimensionale Herzgewebe, die mit aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten biotechnologisch hergestellt wurden, haben sich als vielversprechende Modelle für die Untersuchung von gesundem und krankem menschlichem Myokard in vitro erwiesen und gleichzeitig Schlüsselaspekte der nativen Herznische rekapituliert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Analyse von High-Content-Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden.

Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kontraktilität in adulten humanen primären Kardiomyozyten aus Spenderherzen mit dem MyoBLAZER-System gemessen werden kann, einer zuverlässigen Plattform zur Beurteilung arzneimittelinduzierter Veränderungen der Kontraktilität während der präklinischen Entwicklung.

Messung der Herzkontraktilität in isolierten adulten humanen primären Kardiomyozyten

Dieses Protokoll stellt Methoden zur Erzeugung von 3D-konstruiertem Herz- und Skelettmuskelgewebe bereit und beschreibt deren Verwendung in präklinischen Arzneimittel-Screening-Modalitäten. Die beschriebenen Methoden verwenden ein magnetisches Sensorsystem, um die gleichzeitige Beurteilung von 24 Geweben parallel zu ermöglichen.

Präklinische Arzneimitteltests in skalierbaren 3D-Muskelgeweben

Hier demonstrieren wir eine nicht-invasive Methode zur Bewertung der Kontraktilität von Herzmedizinprodukten unter Verwendung von 2D-Monoschichten aus humanen pluripotenten Stammzellen (hiPSC-CM), die auf einem flexiblen Substrat plattiert und mit videobasierter Mikroskopie gekoppelt sind. Dieses Tool wird für die In-vitro-Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von kardialen Elektrophysiologiegeräten nützlich sein.

Evaluierung der kardialen Kontraktilitätsmodulationstherapie in 2D-Kardiomyozyten aus humanen Stammzellen

Es wird eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von 3D-Myokardgeweben vorgestellt, bei der MEW-Gerüste (Melt Electrospinning Writing), Polycaprolacton (PCL)-Gerüste und Fibrin-Hydrogele mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und Fibroblasten kombiniert werden. Diese Technik bietet eine präzise Kontrolle über die Gerüstarchitektur und kann in präklinischen Arzneimitteltests und bei der Modellierung von Herzerkrankungen eingesetzt werden.

3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Erfahren Sie die automatische Kontraktionsanalyse von humanen Engineered Heart Tissues mittels hiPSC-Kardiomyozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen der Kontraktionskraft für Drug-Safety-Screening und kardiale Forschung.

Automatische Kontraktions Analyse menschlicher Engineered Herzgewebe für Herz Drug Safety Screening

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