Name: Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Erfahren Sie die zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations-Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung schneller Strukturänderungen bei geordneten und ungeordneten Proteinen.

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Wir danken Dr. Markus Zweckstetter für die Bereitstellung der pdb-Koordinatendatei für das 'native' Tau-Ensemble, das aus seiner NMR-Arbeit vorhergesagt wurde, mit von Dr. Adnan Sljoka bereitgestellten Analysewerkzeugen. Die Finanzierung dieser Arbeit erfolgte durch das ENGAGE Grant-Programm des Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

HINWEIS: Wenden Sie sich alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Fumes hergestellt durch Laserablation von Poly (methylmethacrylat) (PMMA) können toxisch sein. Achten Sie darauf, dass der Laser-Graveur an eine funktionierende Lüftungsanlage angeschlossen ist. Verwenden Sie alle geeigneten Praktiken Sicherheit bei der Mikrofluidik-Vorrichtung des Aufbau einschließlich der Verwendung von technischen Kontrollen (Dunstabzug, Behälter für spitze Gegenstände) und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Gesichtsmaske, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe). Es ist von größter Bedeutung High Performance Liquid Chromatography (HPLC) grade Reagenzien, wann immer möglich zu verwenden, mit allen Sein von ACS-Qualität oder höherer störende Verunreinigungen während der Analyse zu verringern. 1. Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung <ol><li> Der Bau der PMMA Mikrofluidik-Plattform <ol><li> Erhalten, die einen Standard-PMMA-Block (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) und Laser-Ablatieren einen Eingangskanal zum Einführen des Reaktionsteilnehmers, ein proteoLysekammer und ein Ausgangskanal mit einem Laser-Graveur 17, 18 verwendet wird . HINWEIS: Ätzen der Proteolyse Kammer in einer länglichen ovalen Form (30 x 5 x 0,05 mm). Der Eingangs- und Ausgangskanal zu dem Ende der PMMA-Blöcke erstrecken muss und nicht größer als 75 &amp; mgr; m sowohl in der Breite und Tiefe, um eine 30 ga Kapillare aufzunehmen. </li><li> Geschnitten, um ein 30 GA Edelstahlmetall Kapillare in zwei Stücke von etwa 10 cm je ein Drehwerkzeug mit einer 1/64&quot; dick abgeschnittenen Scheibe zu ermitteln. Ein Schleifpapier um die Ende der Kapillaren zu glätten (dies kann durch Betrachten unter a erleichtert werden, Lichtmikroskop). </li><li> Schmelzen die Kapillaren in die geätzten Poly (methylmethacrylat) block mit einem Lötkolben verwendet wird. Der Eingangskanal wird auf automatisierte Spritzenpumpen angeschlossen werden, und der Ausgabekanal wird zur Kopplung in die MS verwendet werden. </li></ol></li><li> Der Bau der Durchlaufzeitaufgelöste Kinetic Mixer <ol><li> Besorgen Sie sich einen fusioniertenQuarzglas-Kapillare (ID: 75 &amp; mgr; OD: 150 &amp; mgr; m) von etwa 40 cm, und sie in eine Edelstahlmetall Kapillare 28 GA von etwa 15 cm ein. In Abhängigkeit von der Reaktionszeit erforderlich ist, verwenden Sie einen längeren äußeren Metall Kapillare oder eines mit einer größeren ID. HINWEIS: Die Ermittlung der ‚wahre‘ Innendurchmesser der Metallkapillare ist entscheidend für eine genaue Reaktionszeiten zu erhalten. Dies kann durch Anbringen der Metallkapillare an eine HPLC durchgeführt werden, fließt Lösungsmittel obwohl die Kapillare, und Aufzeichnen der Rückdruck. Ein Gegendruck zu Innendurchmesser Berechnung kann gemacht werden, und das wahre Innendurchmesser des Metall Kapillare bestimmt. Dies kann die Molecular Weight Calculator Software berechnet werden (für Windows Version 6.49). </li><li> Erzeugt eine 2 mm Kerbe unter Verwendung niedrigen Strom Laserengraver Einstellungen an einem Ende des inneren Glaskapillare und verschließen dieses Ende der inneren Glaskapillare (Abbildung 2). Alternativ macht die Kerbe eine Glaskeramik Kapillarsystem mity Schneidwerkzeug oder ein Rotationsschleifer mit einem feinen Schneidklinge. </li><li> Aufstellung der innere Glaskapillare mit dem Ende des Metall Kapillare (dies kann durch Betrachten unter einem Lichtmikroskop erleichtert werden). </li><li> Befestigen diesen kinetischen Mischer an ein Ende der Misch - T (Abbildung 2). </li><li> Anhänge einen Quarzglas-Kapillare (ID: 75 &amp; mgr; OD: 150 &amp; mgr; m) von etwa 40 cm zu dem gegenüberliegenden Ende des kinetischen Mischer auf dem Misch-T. Dies wird verwendet, Säure (5% Essigsäure, pH 2,4) zu liefern, um die Reaktion abzuschrecken. HINWEIS: mit automatisierten Infusionspumpen Reaktanten werden auf das Gerät mit gasdichten Spritzen durch Polytetrafluorethylen (PTFE) -Schlauch geliefert. </li></ol></li><li> Pepsin-Aktivierung <ol><li> Abwiegen 20 mg Pepsin aus Schweine Magenschleimhaut und suspendieren sie in 1 ml Kopplungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 6,0). </li><li> Man wiegt 50 mg N - Hydroxysuccinimid (NHS) -aktivierten Agaroseperlen, fügt die Re-suspended Protease und dreht sanft über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Spin down bei 1000 × g für 2 min bei Raumtemperatur um das Harz zu sammeln. </li><li> Absaugen ungebundene Protease. </li><li> Inkubiere die Agarose in 1 ml Blockierungspuffer (1 M Tris-HCl, pH 6,0) und drehen sich sanft bei Raumtemperatur für 1 h. </li><li> Spin down bei 1000 × g für 2 min bei Raumtemperatur um das Harz zu sammeln. </li><li> Absaugen Blockierungspuffer. </li><li> Inkubiere die Pepsin-Agarose mit 1 ml 5% Essigsäure, pH 2,4 für 5 min. </li><li> Spin down bei 1000 × g für 2 min, um das Harz zu sammeln. </li><li> Den Überstand aspirieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.3.8 - 1.3.10 für insgesamt drei Wäschen. </li><li> Lagern Sie die Beads in 1 ml Essigsäure bei 4 ° C für die langfristige Nutzung. </li></ol></li><li> Vorrichtungsaufbau <ol><li> Füllen der Proteolyse Kammer mit der Aufschlämmung aus aktiviertem Pepsin-Agarosekügelchen in 5% Essigsäure einen sterilen Spatel verwendet wird. </li><li> Legen Sie die PMMA mikrofluidischen platform zwischen zwei Leer PMMA-Blöcke als Abdeckung der Vorrichtung abzudichten, gefüttert mit Silikonkautschuk eine flüssigkeitsdichte Abdichtung zu schaffen. </li><li> Verwenden metallische Klemmplatten zu Druckdichtung der Vorrichtung. HINWEIS: Die Klemme wurde speziell hergestellt, um die mikrofluidische Plattform zu passen, und besteht aus zwei Platten messen 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. </li><li> Strom 5% Essigsäure, pH 2,4 bei einer Rate von 10 &amp; mgr; l / min. Fließ 50 mM Ammoniumacetat-Puffer (pH 6,9), obwohl die Protein-Linie mit einer Rate von 1 &amp; mgr; l / min. HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, dass die Essigsäure in der Gesamtheit des Experiments durch die Vorrichtung kontinuierlich fließen. Sicherzustellen, dass keine Leckagen sind und daß die Fluid austritt nur aus dem Ausgangskanal, die als die ESI-Quelle dienen. </li><li> Koppel die Vorrichtung mit dem vorderen Ende eines modifizierten Quadrupol-Time-of-Flight (Q-TOF) Massenspektrometers einer einstellbare isolierte Stufe unter Verwendung Elektrosprüh optimale Bedingungen zu erreichen. HINWEIS: Ein Bypass-Schalterwird eingeführt, um das Vorhandensein einer kommerziellen ESI-Quelle zu simulieren. 17 </li></ol></li></ol> 2. Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch <ol><li> Erwerb von Pepsin und Protein nur Spectra HINWEIS: ESI-MS Erfassung wird in positivem Ionen-Modus mit einer Spannung von 4500 bis 5000, 60-V Declustering Potential und 250 V-Fokussierungspotential durchgeführt. Spektren werden über einen Bereich von 350-1,500 m / z mit einer Abtastrate von 1 s -1 erworben. <ol><li> Erwerben Sie ein Pepsin nur Spektrum. Etwaige Spitzen in diesem Spektrum erscheinen, werden abgezogen, sobald das Protein zugegeben wird. </li><li> Einführung von 50-100 uM tau / phospho-tau - Protein (reinigen und vorzubereiten , wie zuvor beschrieben , 13, 19) mit einer Rate von 1 &amp; mgr; l / min , wo die 50 mM Ammoniumacetat - Puffer zuvor fließt wurden. </li><li> Erwerben Sie ein Protein nur Spektrum. </li></ol></li><li> Acquisition of Zeitpunkte <ol><li> Während 100 uM tau / phospho-tau - Protein fließt bei 1 &amp; mgr; l / min, D 2 O mit einer Rate von 3 &amp; mgr; l / min über einen T - Verbinder einzuführen und ermöglichen , in dem kinetischen Mischer zu reagieren. Man läßt das System für mindestens 10 min vor dem Erwerb des Spektrums äquilibrieren. HINWEIS: Nach dem Austausch wird die Markierungsreaktion durch die Strömung von Essigsäure pH 2,4 bei 10 &amp; mgr; l / min und der Verdauung des markierten Proteins erfolgt in der proteolytischen Kammer abgeschreckt wird. </li><li> Um die Markierung der Zeit zu erhöhen, ziehen manuell die Position der inneren Glaskapillare zurück zu erreichen Zeiten von 42 ms bis 8 s zu mischen. Man lässt das System für mindestens 10 min äquilibrieren zwischen jedem pull-back. </li></ol></li></ol> 3. Daten und statistische Analyse <ol><li> Identifizierung von Peptiden und Berechnung der Prozentsatz der Deuterium-Austausch <ol><li> Führen Sie MS - Spektren analysiert mit mMass Software, Version 5.5.0 20 </sup&gt;. </li><li> Peptide , die die Identifizierung ExPASy Proteomics - Server FindPept und bestätigen durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) , wenn 21 erforderlich. HINWEIS: Hier wurde Deuterium Aufnahme Inkorporation gemessen , um eine in-house entwickelte Fortran - Software für die Isotopenverteilungsanalyse 22, 23 verwendet wird . </li><li> Berechne die theoretischen intrinsischen Raten auf der Grundlage der Primärsequenz des Web - Tool unter Verwendung KUGEL 22, 24. </li><li> Passen , die Daten einzelne exponentielle nichtlineare Regression unter Verwendung von und normalisieren eine Visualisierungs- und statistische Software (zB SigmaPlot). HINWEIS: Das Verhältnis von k int / k obs ergibt den Schutzfaktor (PF), ein semi-quantitatives Maß für den Grad , dass eine bestimmte Region innerhalb des Konformationsensembles strukturiert ist. </li></ol></li></ol>

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Wir haben nichts offenzulegen.

Während der Strukturbiologie Methoden wie die Röntgenkristallographie und NMR vorteilhaft sind, weil sie äußerst detaillierte Strukturen von Proteinen liefern, sind diese Bilder oft statisch. Die Charakterisierung von transienter Spezies und schwach strukturierter Domänen weiterhin schwer sein, wenn sie von diesen herkömmlichen Verfahren untersucht. Deshalb, um dynamische Erkenntnisse über diese Art von Systemen zu gewinnen, ist es wichtig, bei schnellen Zeitskalen zu arbeiten. Wir haben erfolgreich angewandt Tresi-HDX-...

In den letzten Jahrzehnten haben bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von analytischen Techniken entworfen worden , um die Proteinstruktur und Dynamik 1, 2, 3, 4 zu messen. Während Röntgenkristallographie das Prinzip Werkzeug zur Bestimmung der Proteinstruktur, hohe Konzentrationen an Protein bleibt benötigt werden und umfangreiche Optimierung erforderlich Diffraktionsqualität Kristalle zu erzeugen. Proteine , die schwer zu kristallisieren, wie beispielsweise membranassoziiertes und intrinsisch ungeordneten Proteine klassisch durch Wasserstoff-Deuterium - Austausch (HDX) NMR 5 untersucht worden. Doch in den letzten Jahrzehnten Kopplung von Elektrospray - Ionisations - Massenspektrometrie (ESI-MS) zu HDX hat sich schnell an Popularität gewann 6, 7. Die Massenspektrometrie bietet eine Lösungzu viele der durch Röntgenkristallographie und NMR gestellt Einschränkungen. Insbesondere MS ist sehr empfindlich (nM bis uM Konzentrationen erforderlich), und es gibt praktisch keine Begrenzung für Proteingröße. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Tastgrad von MS-Analyse der Möglichkeit von Proteinen zu studieren, wie sie enzymatischen Umsatz, misfolding, Komplexierung und andere biologisch relevante Prozesse unterzogen werden. Diese Prozesse treten häufig auf den von Millisekunden bis Sekunden Zeitskala und erfordern eine schnelle Vermischung von Reagenzien vor der Analyse. Die Entwicklung des Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisation (Tresi) von Wilson und Konermann 2003 erlaubten Reaktionen in pseudo-Echtzeit durch ESI-MS überwacht werden. Ihre Einrichtung einen kapillaren Mischer mit einem stufenlos einstellbaren Reaktionskammervolumen 8 eingebaut. Die Vorrichtung besteht aus zwei konzentrischen Kapillaren, mit der inneren Kapillare abgedichtet und einer Kerbe in die Seite geschnitten zum Mischen innerhalb des engen inter Kapillarsystem zu ermöglicheny Raum von der Kerbe zu dem Ende der inneren Kapillare (typischerweise 2 mm). Wenn auf HDX Experimente angewandt, wobei die innere Kapillare das Protein von Interesse trägt, trägt die äußerte Kapillare die Kennzeichnung D 2 O - Lösung, die dann mit dem Protein erfährt vermischt , bevor das einstellbare Reaktionskammer eintretenden zum Etikettieren von HDX ermöglicht vor dem direkten Transfer in die ESI Quelle. Kurz gesagt, verlässt sich HDX auf Wasserstoffe Rückgrat Amid mit Deuteriumatomen in Lösung 9, 10 unterzogen Austausch. Der Austausch ist basenkatalysierte bei physiologischem pH-Wert, mit Säure-Katalyse bei pH 2,6 unter etwa verbreitet zu werden. Der Wechselkurs basiert auf vier Hauptfaktoren: pH, Temperatur, Lösungsmittelzugänglichkeit und intramolekulare Wasserstoffbindung. Da die ersten beiden Faktoren konstant während des gesamten Versuchs gehalten werden, ist der Wechselkurs, insbesondere bei Peptidgerüst Amid Positionen, in erster Linie dependent auf die Proteinstruktur 11. Dicht Regionen gefaltet mit umfangreichen, stabilen Wasserstoffbrücken - Netzwerken in α-Helices und β-Faltblätter werden Deuterium bei wesentlich geringeren Geschwindigkeiten im Vergleich zu Schleifen und ungeordneten Bereiche (und manchmal gar nicht) 12 aufzunehmen. Dies ermöglicht eine globale Proteinanalyse, in den Störungen in der Struktur (z. B. bei der Aggregation oder Substratbindung) führen zu unterschiedlicher Deuterium Aufnahme (Abbildung 1). Die kinetischen kapillaren Mischer können in eine Mikrofluidik-Plattform integriert werden, um eine proteolytische Kammer für die Lokalisierung der Deuterium-Aufnahme enthält. Diese proteolytische Kammer wird bei niedrigem pH - Wert gehalten , um effektiv die Austauschreaktion zu auslöschen, und erfordert eine immobilisierte Säure - Protease, um das Protein in lokalisierte Peptide (Abbildung 2) zu verdauen. Überwachung Backbone Austausch in Millisekunden bis Sekunden Zeitskalen ist besonders wichtig für dieCharakterisierung von Konformationsänderungen innerhalb schwierig Schleifenregionen, geschmolzene Kügelchen und intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs) 13, 14 zu charakterisieren. Alternativ kann Tresi-HDX auch Proteine verwendet werden , zu charakterisieren , die derzeit keine gelöste Atomstruktur durch die Verfahren der Röntgenkristallographie und NMR haben, Deuterium - Austausch mit dem COREX - Algorithmus gekoppelt unter Verwendung von (DX-COREX) Ansatz 15, 16. Dieses detaillierte Protokoll Tresi-HDX gilt tau zu studieren, ein IDP, sowohl sie als auch nativer Form ist, wie es pathogen hyperphosphorylated Zustand. Während einheimischer tau eine der gut untersucht IDPs ist, ist nur wenig über sein amyloidogenen Gegenstück 13 bekannt.

<table><tbody><tr><td>Poly(methylmethacrylat) oder PMMA</td><td>Professional Plastics</td><td>SACR.250CCP</td><td>8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm</td></tr><tr><td>Quarzglas Kapillare</td><td>Polymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>ID: 75 &micro; m, OD: 150 &micro; m</td></tr><tr><td>Metallkapillaren</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &ndash; 89875K97 30 ga&nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>Fluoriertes Ethylen-Propylen (FEP) Schlauch</td><td>IDEX</td><td>1477 1548</td><td>ID: 0.007", OD: 1/16" ID: 0.020", AD: 1/16"</td></tr><tr><td>Standard-Polymer-Schlauchschneider</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>für 1/16" und 1/8" Außendurchmesser Schlauch</td></tr><tr><td>Mikrostatisches Misch-T-Stück</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>für 1/16" Außendurchmesser Rohr</td></tr><tr><td>oder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-T-Stück, 0,25&nbsp; mm Bohrung</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td><td>ZT1C</td><td>für 1/16" Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Rohr PEEK T-Stück für 1/16" OD Schlauch</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 Innengewinde auf Buchse</td><td>Luer IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK Doppelflügelmutter</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>Aderendhülse für 1/16" OD Schläuche</td><td>IDEX</td><td>F-142 100</td><td></td></tr><tr><td>Serie Rotationswerkzeug</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>Trennscheiben</td><td>Jobmate</td><td></td><td>1/64" Dicke</td></tr><tr><td>Stereomaster Digital Zoom Mikroskop</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>Lötkolben</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser</td><td>Universal Laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>500&nbsp; &Mikro; Spritzenpumpen mit L-Kapazität</td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-aktivierte Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin aus der Magenschleimhaut des Schweins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-10X0,6 ML</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Software/Online-Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molekulargewichtsrechner</td><td></td><td>Version 6.49</td><td>Open Source MS Tool</td></tr><tr><td>mMass</td><td></td><td>Version 5.5.0</td><td>Open Source MS Tool</td></tr><tr><td>ExPASy FindPept</td><td>Schweizerisches Institut für Bioinformatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software</td><td>Version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>Version 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td><>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF Massenspektrometer</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zeitaufgelöste elektrospray-ionisations wasserstoff-deuterium-austausch-massenspektrometrie zur struktur protein studium und dynamik

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsisch ungeordneten Proteine ​​(IDPs) sind seit langem eine Herausforderung an Strukturbiologen gewesen aufgrund ihres Mangels an stabilen Sekundärstrukturelemente. Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) bei schnellen Zeitskalen gemessen ist einzigartig geeignet Strukturen und Wasserstoffbindungsnetzwerke zu detektieren, die kurz aufgefüllt werden, so dass für die Charakterisierung von transienten Konformeren in nativer Ensembles. Die Kopplung von HDX Massenspektrometrie bietet mehrere Vorteile, darunter eine hohe Empfindlichkeit, geringe Probenverbrauch und ohne Beschränkung auf Proteingröße. Diese Technik hat sich stark in den letzten Jahrzehnten fortgeschritten, einschließlich der Fähigkeit HDX Kennzeichnungszeiten auf der Millisekunden-Zeitskala zu überwachen. Zusätzlich wird durch den HDX Workflow auf einer mikrofluidischen Plattform enthält eine saure Protease Mikroreaktor-Gehäuse, sind wir dynamischen Eigenschaften bei der Peptidebene lokalisieren können. In dieser Studie, zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (Tresi-MS), die mit HDX was verwendet, um ein detailliertes Bild von Reststruktur in dem Tau-Protein zur Verfügung zu stellen, sowie die Konformationsänderung auf Hyperphosphorylierung induzierten Verschiebungen.

Verdauung Profile von nativen und Phospho-tau waren ähnlich, die jeweils eine Sequenz von 77,1 Abdeckung und 71,7% erhalten wird. Deuterium Aufnahmewerte jedes Peptids wurde durch Anpassen der beobachteten Isotopenverteilungen mit den theoretischen Verteilungen unter Verwendung einer Software im Hause entwickelten FORTRAN erzeugt wird, bestimmt. Die am besten passenden Verteilungen werden (Abbildung 3a) gezeigt , zusammen mit den zugehörigen Deuterium Aufnahmewerten. Upt...

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Die konformationelle Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion, und das übergeordnete Ziel der zeitaufgelösten Elektrospray-Ionisations-Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie besteht darin, schnelle strukturelle Veränderungen zu untersuchen, die die Funktion geordneter und ungeordneter Proteine antreiben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Strukturbiologie zu beantworten, wie beispielsweise die Identifizierung flüchtiger Protein-Konformationen, die für klassische hochauflösende Techniken wie die Elektronenmikroskopie und NMR nicht zugänglich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Reaktionen im Millisekunden-Zeitbereich verfolgt werden können, was für die Charakterisierung von Loop-Strukturen, Molten Globules und intrinsisch ungeordneten Proteinen von Bedeutung ist.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen. Da diese häufig das Fehlfalten oder die Aggregation intrinsisch ungeordneter Proteinbereiche beinhalten, kann diese Methode nicht nur Einblicke in wöchentlich strukturierte Proteine liefern, sondern auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispiel

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Biochemistry

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Protein-Konformation und Dynamik sind der Schlüssel zum Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion. Wasserstoffaustausch gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie ist eine vielseitige Methode, um die Konformationsänderungen Dynamik von Proteinen als auch studieren Charakterisierung von Protein-Ligand und Protein-Protein-Wechselwirkungen, einschließlich Kontaktschnittstellen und allosterische Effekte.

Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Festkörper-Amid-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (ssHDX-MS) und die Festkörper-Photolytische Markierungs-Massenspektrometrie (ssPL-MS) für Proteine in festen Pulvern. Die Methoden liefern hochauflösende Informationen über die Proteinkonformation und -wechselwirkungen im amorphen Festkörper, die für das Formulierungsdesign nützlich sein können.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Massenspektrometrie (MS) hat als ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Struktur und Dynamik der makromolekularen Versammlungen entstanden. Hier integrieren wir MS-basierte Ansätze, um komplexe Proteinbildung und Liganden Bindung zu befragen.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Lanthipeptid-Synthetasen katalysieren mehrstufige Reaktionen während der Biosynthese von Peptid-Naturprodukten. Hier beschreiben wir einen kontinuierlichen, Bottom-up, Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) Workflow, der verwendet werden kann, um die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen zu studieren, sowie andere ähnliche Enzyme, die an der Peptid-Naturproduktbiosynthese beteiligt sind.

Eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie -Plattform (HDX-MS) zur Untersuchung biosynthetischer Peptidenzyme

Hier wird ein Protokoll für einen Kapillarelektrophorese-basierten Wasserstoff/Deuterium-Austausch (HDX)-Ansatz in Verbindung mit Top-Down-Massenspektrometrie vorgestellt. Dieser Ansatz charakterisiert den Unterschied in Strukturen höherer Ordnung zwischen verschiedenen Proteinspezies, einschließlich Proteinen in verschiedenen Zuständen und verschiedenen Proteoformen, indem er gleichzeitig differentielle HDX- und elektrophoretische Trennung durchführt.

Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Das strukturelle Ensemble des monomeren Alpha-Synucleins beeinflusst seine physiologische Funktion und seine physikalisch-chemischen Eigenschaften. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie und anschließende Datenanalysen durchgeführt werden können, um Konformationsinformationen über das Monomer dieses intrinsisch ungeordneten Proteins unter physiologischen Bedingungen zu bestimmen.

Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung der Alpha-Synuclein-Strukturdynamik unter physiologischen Bedingungen

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Erfahren Sie die zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations-Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung schneller Strukturänderungen bei geordneten und ungeordneten Proteinen.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik (Video) | JoVE Journal

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

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