Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Die Konformationsflexibilität spielt eine entscheidende Rolle für die Proteinfunktion, und das übergeordnete Ziel der zeitaufgelösten ElectroSpray-Ionisations-Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie ist es, schnelle strukturelle Veränderungen zu untersuchen, die die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen vorantreiben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Strukturbiologie zu beantworten, wie z. B. die Kraterisierung transienter Proteinbestätigungen, die im Vergleich zu klassischen hochauflösenden Techniken wie Elektrozystographie und NMR nicht minimal ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Reaktionen auf der Zeitskala von Millisekunden überwacht werden können, was für die Charakterisierung von Schleifenkämmen, Moltinglobyalen und intrinsisch ungeordneten Proteinen wichtig ist.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie neurodegenerativer Erkrankungen. Da sie oft die Fehlfaltung oder Aggregation von intrinsisch ungeordneten Proteinregionen beinhalten. Obwohl diese Methode Einblicke in wöchentlich strukturierte Proteine geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. Enzyme, die einen katalytischen Umsatz durchlaufen, oder die Charakterisierung von Protein-, Protein- und Protein-, Ligan-Wechselwirkungen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, wird eine Platte mit einem Lasergravierer durch einen Eingangskanal zum Einbringen der Reagenzien, eine Prodialysekammer und einen Ausgangskanal auf einen Standard-PMM8-Block gelasert. Schneiden Sie anschließend eine 30-Gauge-Metallkapillare aus Edelstahl mit einem Rotationswerkzeug in zwei 10 Zentimeter große Stücke für die 164 Zoll dicke Trennscheibe. Verwenden Sie Schleifpapier, um das Ende der Kapillaren zu glätten, was durch Betrachten unter einem Lichtmikroskop erleichtert werden kann.

Schmelzen Sie nun diese Kapillaren mit einem Glätteisen in den geätzten PMM8-Block ein. Um einen zeitaufgelösten kinetischen Mischer mit kontinuierlichem Durchfluss zu konstruieren, setzen Sie eine 40 Zentimeter lange geschmolzene Cilica-Glaskapillare in eine 28-Gauge-Stahl-Metall-Kapillare von etwa 15 Zentimetern ein. Stellen Sie als Nächstes eine zwei Millimeter große Kerbe her, indem Sie an einem Ende der inneren Glaskapillare einen Lasergravierer mit geringer Leistung verwenden und dieses Ende der inneren Glaskapillare versiegeln.

Dies ist ein kritischer Schritt, der eine orthogonale und effiziente Durchmischung des Proteins gewährleistet, das durch die Kerbe austritt, die einen gemeinsamen Verderber darstellt. Der zwei Millimeter große Kapillarzwischenraum zwischen der Kerbe und dem Ende der Kapillare ist die Mischung und das Volumen. Bringen Sie Verschraubungen und Schlauchmanschetten in geeigneter Größe an und integrieren Sie einen T-Anschluss, der zur Abgabe von Deterium verwendet wird.

Richten Sie als Nächstes die innere Glaskapillare mit dem Ende der Metallkapillare aus, was durch Betrachten unter einem Lichtmikroskop erleichtert werden kann. Markieren Sie dies als Null-Millimeter-Position. Befestigen Sie diesen kinetischen Mischer an einem Ende des Misch-T.Befestigen Sie dann eine 40 Zentimeter lange Kapillare aus Quarzglas am gegenüberliegenden Ende des kinetischen Mischers auf dem Misch-T.Für die Pepsinaktivierung suspendieren Sie 20 Milligramm Pepsin aus der Porsena-Gasschleimhaut in einem Milliliter Kupplungspuffer

Geben Sie 50 Milligramm NHS-aktivierte Agro-Geschwindigkeiten in die resuspendierten Protiens und drehen Sie sie sanft über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag schleudern Sie die Mischung bei tausendmal G für zwei Minuten bei Raumtemperatur herunter, um das Harz aufzufangen. Anschließend werden die ungebundenen Protiyes abgesaugt.

Anschließend das Agros in einem Milliliter Blockpuffer inkubieren und eine Stunde lang sanft bei Raumtemperatur drehen. Nachdem Sie das Harz gesammelt und den Blockierungspuffer abgesaugt haben, inkubieren Sie die Pepsin-Agguros fünf Minuten lang mit einem Milliliter fünfprozentiger Essigsäure. Schleudern Sie die Mischung bei 1.000 Mal G für zwei Minuten bei Raumtemperatur herunter, um das Harz aufzufangen, und aspirieren Sie dann das Supernatent.

Lagern Sie die Kügelchen nach Wiederholung der vorherigen Schritte für insgesamt drei Wäschen in einem Milliliter Essigsäure bei vier Grad Celsius für den Langzeitgebrauch. Um das Gerät zusammenzubauen, füllen Sie eine Protialysekammer mit einem sterilen Spatel mit einer Aufschlämmung aus aktivierten Pepsin-Agguros-Kügelchen in fünfprozentiger Essigsäure. Platzieren Sie die PMMA-Mikro-Falitic-Plattform zwischen zwei leeren PMMA-Blöcken als Abdeckung, um das Gerät abzudichten, und legen Sie sie mit Silikonkautschuk aus, um eine flüssigkeitsdichte Abdichtung zu schaffen.

Verwenden Sie metallische Klemmplatten, um das Gerät unter Druck zu versiegeln. Befestigen Sie dann das Misch-T mit entsprechenden Anschlüssen am Einlass des Geräts. Nun fließen fünf Prozent Essigsäure in die Säurelinie mit einer Geschwindigkeit von zehn Mikrolitern pro Minute.

Lassen Sie dann 50 Millimeter Amoniasäurepuffer mit einer Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute durch die Proteinlinie. Koppeln Sie das Gerät an das vordere Ende eines modifizierten Quadrapol-Laufzeit- oder Qtof-Massenspektrometers mit einem einstellbaren isolierten Tisch, um optimale Elektrosprühbedingungen zu erzielen. Nachdem Sie die ESI-MS-Bedingungen eingestellt haben, erfassen Sie ein reines Pepsin-Spektrum.

Als nächstes führen Sie 50 bis 100 Mikromoler Tau oder Phospho-Tau-Protein mit einer Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute ein, wo zuvor der 50-Millimeter-Amoniumacitatpuffer floss. Nachdem Sie das System vor der Erfassung mindestens 10 Minuten lang äquilibrieren gelassen haben, erfassen Sie das Nur-Protein-Spektrum. Während das Tao oder Phospho-Tao-Protein fließt, führen Sie Duteriumoxid mit einer Geschwindigkeit von drei Mikrolitern pro Minute über den T-Anschluss ein und lassen Sie es im kinetischen Mischer reagieren.

Um die Etikettierzeit zu verlängern, ziehen Sie die Position der inneren Glaskapillare manuell zurück, um Mischzeiten von 42 Millisekunden bis acht Sekunden zu erreichen, so dass das System zwischen jedem Rückzug mindestens 10 Sekunden lang äquilibrieren kann. Diese Animation zeigt den Arbeitsablauf für ein typisches Experiment. Protein tritt durch die Kerbe aus und vermischt sich mit dem entgegenkommenden Duterium.

Während der vorgegebenen Reaktionszeit werden Backbone-M8-Wasserstoffatome ausgetauscht, die durch Zurückziehen der Proteinkapillare variiert werden können. Die Reaktion wird dann abgeschreckt und dann auf einer mikrofluidischen Plattform mit einer ESI-Auslassnadel verdaut. Das resultierende Spektrum enthält verdautes Protein.

Der prozentuale Anteil der Deuteriumaufnahme wird für einzelne Peptide berechnet und dann auf die 3D-Proteinstruktur abgebildet. Die Verdauungsprofile von nativem und Phospho-Tau waren ähnlich und ergaben eine Sequenzabdeckung von 77,1 bzw. 71,7 Prozent, wobei die am besten passenden Isotopenverteilungen und die zugehörigen Deuteriumaufnahmewerte für vier einfache Peptide hier dargestellt sind. Die beobachtete kinetische Darstellung der prozentualen Deuteriumaufnahme über der Zeit für jedes Peptid wird verwendet, um die beobachtete experimentelle Rate zu extrahieren.

Die berechneten zufälligen Qualitätsprofile werden zum Vergleich dargestellt und dienen zur Extraktion der theoretischen intrinsischen Note. Wie erwartet wurden in diesem Bereich keine Schutzfaktoren beobachtet, die normalerweise mit Sekundärstrukturelementen verbunden sind, was bestätigt, dass natives Tau eine schwache interne Wasserstoffbrückenbindung aufweist. Ein signifikanter Schutz wird an den N- und C-Termini, der zentralen Domäne und den Aggregationsanfälligkeitsbereichen beobachtet.

In hyperphospho-verwandten Tau wurde ein allgemeiner Anstieg der Deuteriumaufnahme über das Protein beobachtet. Es gibt signifikante Erhöhungen an den N- und C-Termini und in der Hexapeptid-Zwei-Region. Der Grad der Schutzfaktoren ist als Regenbogenschema eingefärbt, wie hier gezeigt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Bereiche mit HPC-Qualität oder höher zu verwenden, um Verunreinigungen zu minimieren, da sie die Analyse beeinträchtigen können. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. kovalente Markierung, chemische Vernetzung, Computermodellierung und Dokustudien, durchgeführt werden, um dreidimensionale Proteinstrukturen abzugleichen oder Bereiche der Interaktion zwischen Proteinprotein und Proteinlegin zu bestätigen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Strukturbiologie, um intrinsisch ungeordnete Proteine und Domänen zu erforschen, die am häufigsten bei nuerodegenerativen Erkrankungen auftreten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die zeitaufgelöste Elektrosprühionisation, den Wasserstoff-Deuterium-Austausch und die Massenspektrometrie für die Untersuchung der Proteinstruktur und -dynamik einsetzen können.