Question 1

Was ist RNA-seq und wie unterscheidet es sich von Mikroarrays?

Accepted Answer

RNA-Seq ist eine Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnik, die die Sequenz und Quantität aller in einer Zellpopulation exprimierten RNA misst, genannt das Transkriptom. Im Gegensatz zu Mikroarrays, die bekannte RNA-Sequenzen abfragen, kann RNA-Seq Genexpression von Organismen mit nicht-sequenziertem Genom profilieren und genau einen größeren Bereich von Transkript-Expressionsniveaus messen, insbesondere bei sehr niedrigen oder sehr hohen Niveaus.

Question 2

Warum wird rRNA vor der RNA-Seq-Bibliothekvorbereitung entfernt?

Accepted Answer

Die meisten RNA in Zellen ist ribosomale RNA (rRNA), die die zentrale Komponente des Proteinproduktionsapparats der Zelle ist. Die Entfernung von rRNA erleichtert die Rückgewinnung anderer Transkripttypen für genaue Messungen. rRNA wird typischerweise durch Hybridisierung der Probe mit komplementären Oligonukleotiden, die an magnetische Perlen gebunden sind, entfernt und anschließend mithilfe eines Magneten von der restlichen Probe getrennt.

Question 3

Wie werden RNA-Proben für die Sequenzierung in DNA umgewandelt?

Accepted Answer

Da RNA von Natur aus anfällig für Abbau ist, wird sie zunächst in doppelsträngige DNA rücktranskribiert. Oligonukleotidsequenzen, sogenannte Adapter, werden dann an die DNA-Fragmente ligiert. Diese Adapter enthalten konstante Regionen, die als Primer-Bindungsstellen für die PCR-Amplifikation dienen, und einzigartige Sequenzen, sogenannte Barcodes, die Fragmente aus jeder Probe identifizieren.

Question 4

Welche Rolle spielen Barcodes bei der Vorbereitung von RNA-seq-Bibliotheken?

Accepted Answer

Barcodes sind einzigartige Oligonukleotid-Sequenzen, die in Adaptern enthalten sind und alle DNA-Fragmente identifizieren, die von einer einzelnen Probe stammen. Dies ermöglicht es, Bibliotheken aus verschiedenen Proben miteinander zu mischen und gleichzeitig zu sequenzieren. Nach der Sequenzierung ermöglichen die Barcodes Forschern, Reads nach ihrer Quellprobe zu sortieren und zu analysieren.

Question 5

Wie wird die Qualität von RNA-seq-Daten während der Sequenzierung bewertet?

Accepted Answer

Die Qualität der Sequenzierung wird durch den Q-Wert angezeigt, der die Wahrscheinlichkeit einer falschen Basenidentifikation widerspiegelt. Q-Werte größer als 30 entsprechen einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 1 zu 1.000 für eine falsche Lesung. Zusätzlich dienen als Qualitätskontrolle hinzugegebene Referenz-DNA-Sequenzen in niedriger Konzentration, und deren Wiederherstellung zum erwarteten Zeitpunkt zeigt an, dass alle Bibliothekssequenzen gleichmäßig vertreten sind.

Question 6

Was kann RNA-seq über Unterschiede in der Genexpression zwischen Proben zeigen?

Accepted Answer

RNA-Seq kann Gene identifizieren, die unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich exprimiert werden, indem es Transkriptome zwischen Proben vergleicht. Forscher können die Anzahl der Reads pro Transkript zählen, um den RNA-Überfluss zu messen. Selbst für Organismen ohne sequenzierte Genome können Transkriptom-Informationen mit anderen sequenzierten Arten verglichen werden, um Gene mit erhöhten oder verringerten Expressionsniveaus zu identifizieren.

Question 7

Wie wird RNA-seq verwendet, um RNA-Protein-Interaktionen zu untersuchen?

Accepted Answer

RNA-seq kann angepasst werden, um Transkripte zu identifizieren, an die ein Protein von Interesse bindet, indem das Protein mit Antikörpern immunopräzipitiert und die gebundenen RNAs durch Sequenzierung definiert werden. Wenn RNA-Protein-Komplexe zu Beginn vernetzt werden, kann die Sequenzierungsanalyse die Vernetzungsstelle kartieren und die Protein-Bindungsstelle auf der RNA bis auf die Nukleotidebene identifizieren.

RNA-Seq - Bewertungsquiz